Teste de segurança contra ameaças sociais revela fenótipos psicossociais relacionados ao estresse

Resumo

O teste de segurança contra ameaças sociais permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento de evitação social como uma medida da aprendizagem condicionada aversiva e da capacidade de discriminação de segurança contra ameaças sociais, ambos utilizados para identificar indivíduos suscetíveis e resilientes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente.

Resumo

O estresse social é uma das principais causas do desenvolvimento de transtornos mentais. Para aumentar o valor translacional de estudos pré-clínicos, a experiência de estresse social e seu impacto comportamental em camundongos devem ser comparáveis aos humanos. A derrota social crônica (DSC) utiliza um tipo de estresse social envolvendo ataques físicos e ameaças sensoriais para induzir disfunções mentais semelhantes a transtornos afetivos humanos. Para fortalecer o componente psicossocial do DSC, aplicou-se um protocolo de 10 dias de DSC, no qual as agressões físicas diárias são padronizadas para três episódios de 10 segundos seguidos por uma fase sensorial de 24 horas. Após a^10ª fase sensorial, o protocolo de DSC é seguido por um ensaio comportamental refinado chamado teste de segurança de ameaça social (STST). Os ensaios comportamentais pós-estresse precisam determinar como e em que medida o estressor social influenciou o comportamento. O STST permite que camundongos machos cronicamente derrotados socialmente interajam com 2 novos indivíduos masculinos (alvos sociais): um alvo social da cepa atacante encontrada durante os dias de DSC e o outro de uma nova cepa. Ambos são apresentados simultaneamente em diferentes compartimentos de uma arena de teste de três câmaras. O teste permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento da evitação social para medir a aprendizagem condicionada aversiva bem-sucedida e a capacidade de discriminação de segurança e ameaça social. O desenvolvimento de evitação social para ambas as cepas reflete uma resposta aversiva generalizada e, portanto, uma medida de suscetibilidade ao estresse. Enquanto isso, o desenvolvimento de evitação social em relação apenas à cepa agressora reflete discriminação ameaça-segurança e, portanto, uma medida de resiliência ao estresse. Finalmente, a ausência de evitação social em relação à tensão agressora reflete aprendizagem condicionada aversiva prejudicada. O protocolo visa refinar os modelos de camundongos atualmente usados de suscetibilidade/resiliência ao estresse, incluindo critérios translacionais, especificamente discriminação de segurança de ameaça e generalização de resposta aversiva, para categorizar um único grupo de animais cronicamente derrotados socialmente em subgrupos resilientes e suscetíveis, eventualmente avançando futuras abordagens translacionais.

Introdução

O estresse é definido como a ruptura da homeostase causada por estímulos físicos ou psicológicos¹. O estresse é um importante fator de risco bem conhecido para o desenvolvimento de transtornos mentais, como transtorno de estresse pós-traumático, depressão e ansiedade ^2,3. Em particular, o estresse social é considerado um importante fator de risco para o desenvolvimento de transtornos mentais relacionados ao estresse⁴. Um tipo de estresse social que tem ganhado particular importância nas pesquisas é o estresse de subordinação social⁵. Os camundongos, assim como os humanos, são capazes de um rico conjunto de comportamentos sociais⁶, tornando-os adequados para investigações que envolvam estresse social. No ambiente de laboratório, quando camundongos adultos são alojados em grupo, eles estabelecem uma estrutura social que envolve a formação de fileiras⁷. Nesse sentido, o modelo de colônia foi desenhado para estudar os efeitos de hierarquias sociais naturalmente estabelecidas em grupos mistos de camundongos⁸. Ao longo dos anos, variações do modelo de colônia foram desenvolvidas para utilizar o estresse de subordinação social, incluindo modelos de grupos do mesmo sexo, o modelo de instabilidade social e o modelo de colônia intrusa. Nos últimos anos, no entanto, uma variante específica conhecida como modelo residente-intruso masculino foi popularizada na literatura, simplificando a complexidade social para dois ratos: um residente e um intruso. O animal de interesse, conhecido como intruso, é colocado na gaiola de um criador maior, mais velho e aposentado, conhecido como morador ou agressor. O morador então ataca fisicamente o intruso como método de confronto, estabelecendo uma hierarquia social em que o morador é dominante e o intruso é subordinado. Quando os confrontos são eventos únicos, eles classificam como "agudos" (o "modelo de derrota social aguda"), enquanto confrontos repetidos que duram vários dias (geralmente 10) são conhecidos como "crônicos" (o "modelo de derrota social crônica"). No modelo de derrota social crônica (DSC), os ataques são intermitentes e tipicamente confinados a um período de 5-10 min⁹, denominado fase física. Após a fase física, o intruso e o residente são mantidos durante a noite na mesma gaiola, separados ao meio com uma parede de malha, permitindo todas as formas de interação, exceto o contato físico. Essa configuração, conhecida como fase sensorial, induz o estresse por meio do aparecimento contínuo de ameaça em vez do confronto físico direto. Em 2018, van der Kooji e colegas introduziram um tratamento social crônico modificado para se concentrar no componente psicossocial do modelo, padronizando e limitando estritamente a fase física¹⁰. O modelo modificado limita as agressões físicas a três episódios de 10 s com diferentes residentes, ocorrendo em intervalos interepisódios de 15 min da fase sensorial. Após o terceiro episódio físico, a fase sensorial dura durante a noite. Esse ciclo se repete por 10 dias consecutivos com novos residentes por episódio. O tratamento modificado aumenta a validade translacional do modelo de derrota social crônica à medida que o dano físico do intruso é minimizado e a variabilidade de desfecho de durações diferenciais de ataques físicos é reduzida.

Uma vez que o modelo de DSC é utilizado para estudar doenças relacionadas ao estresse (por exemplo, depressão, ansiedade, transtorno de estresse pós-traumático), ensaios pós-comportamentais são escolhidos, incluindo, mas não limitado a, ensaios comportamentais de agressividade, memória e anedonia. Nos últimos anos, ensaios comportamentais pós-DSC em camundongos frequentemente avaliam como e em que medida a sociabilidade é^afetada9. A sociabilidade é definida como a preferência inata dos ratos em interagir socialmente em vez de evitar socialmente um conespecífico. Uma vez que a sociabilidade está sujeita aos efeitos do estresse, foram estabelecidos ensaios que avaliam apenas o desenvolvimento da evitação social. A evitação social induzida pelo estresse tem relevância translacional por representar um dos principais sintomas comportamentais de ansiedade social e depressão em humanos¹¹. Semelhante aos humanos, nem todos os camundongos desenvolvem evitação social após o tratamento com DSC, sugerindo a presença de individualidade na responsividade ao estresse. Cohen e colaboradores propuseram critérios comportamentais de corte como uma abordagem promissora para o estudo da neurobiologia da individualidade¹². A seleção dos animais com base no comportamento resulta na divisão dos grupos, reforçando a base para estudos gene-ambiente. Posteriormente, diferentes subgrupos frequentemente mostram enriquecimento distinto de variantes/modificações genéticas específicas, que por sua vez podem ser investigadas sob diferentes condições ambientais¹³. Nesse sentido, a individualidade no desenvolvimento da esquiva social foi utilizada para dividir o único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente em dois subgrupos: suscetíveis ao estresse (socialmente evitativos) e resilientes ao estresse (socialmente não^{evitativos9,14}). No entanto, a interpretação do fenótipo de esquiva social em camundongos como um comportamento desadaptativo ou adaptativo deve ser considerada no contexto geral do tratamento (aqui DSC) e do ensaio comportamental pós-tratamento. Além disso, o ensaio comportamental de escolha pós-tratamento idealmente avaliaria outras facetas da sociabilidade e não apenas o desenvolvimento da esquiva social. Nosso trabalho recente revelou o envolvimento da aprendizagem condicionada na evitação social induzida por^DSC15. Especificamente, a esquiva social induzida pelo DSC é uma resposta condicionada aversiva aos traços caracterizadores da tensão dos residentes, servindo como estímulo condicionado ao estímulo incondicionado, ou seja, os ataques dos residentes. Além disso, dentro do subgrupo socialmente evitativo, alguns indivíduos podem discriminar entre os traços da cepa dos residentes aversivos e os de outras cepas novas seguras, enquanto outros indivíduos mostram evitação social generalizada para ambas as cepas. Propomos aqui um refinado ensaio comportamental pós-DSC: o Social Threat-Safety Test (STST)¹⁵. Ao contrário de outros testes de interação social⁹, o STST permite uma avaliação simultânea do desenvolvimento da evitação social como uma medida da resposta condicionada aversiva correta (isto é, aprendizagem condicionada bem-sucedida) e da capacidade de discriminação de segurança e ameaça social, ambas utilizadas para identificar indivíduos suscetíveis e resistentes ao estresse dentro de um único grupo de camundongos machos cronicamente derrotados socialmente. A avaliação da discriminação de ameaça social versus generalização de resposta aversiva amplia os critérios translacionais usados para classificar o único grupo de animais cronicamente derrotados socialmente em subgrupos resilientes e suscetíveis.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias relativa aos cuidados e utilização de animais em procedimentos experimentais e foram aprovados pelas autoridades locais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). A Figura 1 representa uma linha do tempo esquemática.

1. Tratamento

1. Animais de interesse: Obter camundongos machos C57BL6/J com 7 semanas de idade e, na chegada, em uma instalação com temperatura e umidade controladas em um ciclo claro-escuro de 12 h (luzes acesas: 8:00; luzes apagadas: 20:00; 23 °C; 38% de umidade) com comida e água ad libitum.
2. Derrota social crônica (DSC)
   1. Grupo de tratamento
      1. Após 1 semana de habituação, realizar o tratamento do DSC por 10 dias consecutivos usando a cepa CD-1 como cepa do residente (para um protocolo detalhado, consulte a derrota social crônica⁹ e o tratamento modificado da derrota social crônica¹⁰).
      2. Introduza o mouse C57BL6/J na gaiola do mouse CD-1 e conte 10 s de ataque físico. Repita este episódio três vezes, cada uma com um mouse CD-1 diferente, e separe por intervalos de 15 minutos entre episódios.
      3. Coloque uma parede de malha entre o mouse C57BL6/J e o mouse CD-1 durante esses intervalos, permitindo apenas o contato sensorial. Após o terceiro episódio, abrigar os camundongos C57BL6/J durante a noite nas gaiolas dos camundongos CD-1, separando ambos por uma parede de malha. Repita por 10 dias.
         NOTA: Número de ratos CD-1 = número de ratos C57BL6/J + 1. Se o número de camundongos tratados com C57BL6/J for inferior a 10, um mínimo de 10 camundongos CD-1 ainda é necessário para garantir que todos os dias a última fase sensorial (durando durante a noite) seja com um novo camundongo CD-1 durante os 10 dias de tratamento.
      4. Avalie cuidadosamente o bem-estar físico dos animais ao longo dos 10 dias. Se um animal estiver gravemente ferido, exclua-o da experiência por razões éticas e científicas (mobilidade/atividade durante o teste pós-tratamento). A Tabela 1 fornece uma lista de verificação de bem-estar.
   2. Grupo controle
      1. Na chegada, mantenha camundongos da mesma idade nas mesmas condições que o grupo de tratamento.
      2. Após 1 semana de habituação, introduzir os animais de controle por 90 s em uma gaiola vazia e, em seguida, devolvê-los a gaiolas individuais (unicaseiras) separadas ao meio por paredes de malha idênticas às usadas para o grupo de tratamento. Realize isso diariamente em paralelo aos 10 dias de tratamento.
         NOTA: É aconselhável manter o grupo controle e o grupo de tratamento alojados em salas diferentes.
3. Após a última (^10ª) fase sensorial, alojar sozinho todos os camundongos em novas gaiolas em condições semelhantes às descritas na chegada e deixá-los descansar durante a noite.
   NOTA: A última fase sensorial deve durar 24 h, então os animais são uni-alojados.

2. Teste pós-tratamento: Teste de ameaça social-segurança (Figura 2)

1. Após o tratamento com DSC, todos os camundongos (grupos tratados e controle) em novas gaiolas em condições semelhantes às descritas na chegada e deixá-los em repouso durante a noite.
2. Durante as horas da manhã (8:00-13:30), limpe a arena de três câmaras (retângulo em forma com tamanho total de 60 cm x 40 cm, feito de paredes de acrílico transparente e piso liso) com 5% de etanol e coloque-a sob a câmera com condições de luz de 37 lux. Certifique-se de que toda a arena esteja visível.
3. Limpe os compartimentos de malha (em forma de gaiola feitos de metal ou acrílico) com etanol a 5% e posicione-os como mostrado nos cantos da Figura 1A.
4. Fase de habituação: Introduza o animal de interesse no centro da arena, permita a exploração por 6 minutos e, em seguida, devolva-o à sua gaiola de origem.
5. Coloque o novo alvo social (desconhecido) CD-1 (conespecífico) sob um compartimento de malha e o novo alvo social 129/Sv sob o outro compartimento de malha.
   NOTA: É importante usar um conespecífico 129/Sv desconhecido para evitar um viés de familiaridade. Preferencialmente ter 4 recintos de malha por arena: 2 atribuídos à fase de habituação e 2 à fase de testes.
6. Fase de testes: Reintroduzir imediatamente o animal de interesse no centro da arena e permitir a exploração por 6 min.
7. Devolva todos os animais para sua casa. Limpar a arena e os recintos de malha com etanol 5% entre os testes de diferentes animais, mas nunca durante a observação do mesmo animal, ou seja, nunca entre as fases de habituação e teste.
8. Alternar a localização dos recintos de malha entre os animais (e nunca entre as duas fases dentro do mesmo animal) para controlar possíveis vieses preferenciais de localização.

3. Pontuação e análise

OBS: Apenas o teste pós-tratamento de estresse, ou seja, o STST é pontuado e analisado (e não o tratamento de estresse do DSC).

1. Defina a zona de interação como 2 cm ao redor dos limites dos compartimentos de malha.
2. Pontuar o tempo gasto explorando os recintos de malha durante a fase de habituação, quando o nariz do animal estiver dentro da zona de interação.
3. Pontuar o tempo gasto interagindo com os alvos sociais durante a fase de teste quando o nariz do animal está dentro da zona de interação.
   NOTA: A detecção pode ser feita manualmente (usando um temporizador ou software para pontuação manual) ou automaticamente. Independentemente do método de detecção, pegue o ponto do nariz para medidas de exploração e interação social e o ponto central do corpo para medidas relacionadas à atividade (por exemplo, distância deslocada).
4. Calcule o índice de interação social da seguinte forma: tempo gasto explorando cada alvo social durante a fase de teste / tempo médio gasto explorando os dois compartimentos de malha vazios durante a fase de habituação (Figura 2B).
5. Divida o grupo de tratamento em 3 subgrupos da seguinte forma: Animais com índice de interação social ≥1 com o alvo social CD-1 são não evitadores, animais com índice de interação social <1 com ambos os alvos sociais são evitadores indiscriminados, animais com índice de interação social ≥1 apenas com o alvo social 129/Sv são evitadores discriminatórios (Figura 2C-D).
   NOTA: O número de animais dentro de cada um dos três subgrupos pode diferir entre diferentes lotes de animais (cerca de 1/3 de todos os animais que se submetem ao tratamento com DSC exibirá as características fenotípicas de um dos três subgrupos).
6. Avaliar o efeito do estresse analisando estatisticamente o índice de interação social com o CD-1 alvo social entre os grupos de tratamento e controle (teste t paramétrico para duas amostras ou teste não paramétrico de Mann-Whitney).

Resultados

Índice de interação social como medida de resposta condicionada aversiva
Um índice de interação social ≥1 reflete maior interação social com o respectivo alvo social em comparação com a exploração dos recintos de malha vazios. Em condições basais, aqui definidas como não tendo experiência apetitiva ou aversiva com os traços caracterizadores de uma cepa específica (aqui tanto alvos sociais para o grupo controle quanto o alvo social 129/Sv para o grupo de tratamento), níveis de soci...

Discussão

O protocolo comportamental aqui descreve o Teste de Segurança de Ameaça Social, usado para dividir um único grupo de tratamento pós-DSC em três subgrupos diferentes, servindo como um método para investigar a biologia subjacente da suscetibilidade ao estresse e resiliência e testar terapias potenciais. O contexto biológico e os detalhes técnicos precisam ser cuidadosamente considerados para orientar um planejamento experimental completo.

Diferentes condições de moradia podem alterar ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arenas	Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x  40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors
Camera for video recording	Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg	ace Classic acA1300-60gc	If using automatic detection program, make sure cameras are compatible
Camera objective	KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv	Part-No. 10504
Detection program/Timer	Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/ethovision-xt	Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically
Housing cages	ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel	3010010	Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C
Mesh enclosures	Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol)
Mesh wall	selfmade	N/A	Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact
Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders	Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl	Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl	CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice