Il test di sicurezza contro le minacce sociali scopre i fenotipi legati allo stress psicosociale

Riepilogo

Il test di sicurezza della minaccia sociale consente una valutazione simultanea dello sviluppo dell'evitamento sociale come misura dell'apprendimento condizionato avversivo e della capacità di discriminazione della sicurezza della minaccia sociale, entrambi utilizzati per identificare individui suscettibili allo stress e resilienti allo stress all'interno di un singolo gruppo di topi maschi cronicamente socialmente sconfitti.

Abstract

Lo stress sociale è una delle principali cause dello sviluppo di disturbi mentali. Per aumentare il valore traslazionale degli studi preclinici, l'esperienza dello stress sociale e il suo impatto comportamentale sui topi dovrebbero essere paragonabili a quelli umani. La sconfitta sociale cronica (CSD) utilizza un tipo di stress sociale che coinvolge attacchi fisici e minacce sensoriali per indurre disfunzioni mentali simili ai disturbi affettivi umani. Per rafforzare la componente psicosociale della CSD, è stato applicato un protocollo CSD di 10 giorni in cui gli attacchi fisici quotidiani sono standardizzati in tre episodi di 10 secondi seguiti da una fase sensoriale di 24 ore. Dopo la decima^{fase sensoriale} , il protocollo CSD è seguito da un test comportamentale raffinato chiamato test di sicurezza della minaccia sociale (STST). I test comportamentali post-stress devono determinare come e in che misura il fattore di stress sociale ha influenzato il comportamento. L'STST consente ai topi maschi cronicamente socialmente sconfitti di interagire con 2 nuovi individui maschi (bersagli sociali): un bersaglio sociale del ceppo attaccante incontrato durante i giorni della CSD e l'altro di un nuovo ceppo. Entrambi sono presentati simultaneamente in diversi compartimenti di un'arena di prova a tre camere. Il test consente una valutazione simultanea dello sviluppo dell'evitamento sociale per misurare l'apprendimento condizionato avversivo di successo e la capacità di discriminazione della minaccia sociale e della sicurezza. Lo sviluppo dell'evitamento sociale nei confronti di entrambi i ceppi riflette una risposta avversiva generalizzata e, quindi, una misurazione della suscettibilità allo stress. Nel frattempo, lo sviluppo dell'evitamento sociale solo verso il ceppo attaccante riflette la discriminazione della sicurezza della minaccia e, quindi, una misura della resilienza allo stress. Infine, l'assenza di evitamento sociale nei confronti del ceppo attaccante riflette un apprendimento condizionato avversivo alterato. Il protocollo mira a perfezionare i modelli murini di suscettibilità/resilienza allo stress attualmente utilizzati includendo criteri traslazionali, in particolare la discriminazione minaccia-sicurezza e la generalizzazione della risposta avversiva, per classificare un singolo gruppo di animali cronicamente socialmente sconfitti in sottogruppi resilienti e suscettibili, avanzando infine futuri approcci traduzionali.

Introduzione

Lo stress è definito come l'interruzione dell'omeostasi causata da stimoli fisici o psicologici¹. Lo stress è un noto fattore di rischio importante per lo sviluppo di disturbi mentali come il disturbo da stress post-traumatico, la depressione e l'ansia ^2,3. In particolare, lo stress sociale è considerato un importante fattore di rischio per lo sviluppo di disturbi mentali legati allo stress⁴. Un tipo di stress sociale che ha acquisito particolare importanza nella ricerca è lo stress di subordinazione sociale⁵. I topi, come gli esseri umani, sono in grado di sviluppare un ricco insieme di comportamenti sociali⁶, il che li rende adatti per indagini che coinvolgono lo stress sociale. Nell'ambiente di laboratorio, quando i topi adulti sono ospitati in gruppo, stabiliscono una struttura sociale che coinvolge la formazione dei ranghi⁷. Di conseguenza, il modello di colonia è stato progettato per studiare gli effetti delle gerarchie sociali stabilite naturalmente in gruppi misti di topi⁸. Nel corso degli anni, sono state sviluppate varianti del modello di colonia per utilizzare lo stress di subordinazione sociale, compresi i modelli di gruppo dello stesso sesso, il modello di instabilità sociale e il modello di colonia di intrusi. Negli ultimi anni, tuttavia, una particolare variante nota come modello residente maschile-intruso è stata resa popolare in letteratura, semplificando la complessità sociale a due topi: un residente e un intruso. L'animale di interesse, noto come intruso, viene messo nella gabbia di un allevatore più grande, più anziano e in pensione, noto come residente o aggressore. Il residente attacca quindi fisicamente l'intruso come metodo di confronto, stabilendo una gerarchia sociale in cui il residente è dominante e l'intruso è subordinato. Quando gli scontri sono eventi una tantum, vengono classificati come "acuti" (il "modello della sconfitta sociale acuta"), mentre gli scontri ripetuti che durano diversi giorni (di solito 10) sono noti come "cronici" (il "modello della sconfitta sociale cronica"). Nel modello di sconfitta sociale cronica (CSD), gli attacchi sono intermittenti e tipicamente limitati a un periodo di 5-10 minuti⁹, chiamato fase fisica. Dopo la fase fisica, l'intruso e il residente vengono tenuti per la notte nella stessa gabbia, separati a metà da una parete a rete, consentendo tutte le forme di interazione tranne il contatto fisico. Questa configurazione, nota come fase sensoriale, induce stress attraverso la continua comparsa di una minaccia invece di un confronto fisico diretto. Nel 2018, van der Kooji e colleghi hanno introdotto un trattamento di sconfitta sociale cronica modificato per concentrarsi sulla componente psicosociale del modello, standardizzando e limitando rigorosamente la fase^{fisica 10}. Il modello modificato limita gli attacchi fisici a tre episodi di 10 secondi con residenti diversi, che si verificano a intervalli di 15 minuti tra un episodio e l'altro della fase sensoriale. Dopo il terzo episodio fisico, la fase sensoriale dura tutta la notte. Questo ciclo si ripete per 10 giorni consecutivi con nuovi residenti per episodio. Il trattamento modificato migliora la validità traslazionale del modello di sconfitta sociale cronica in quanto il danno fisico dell'intruso è ridotto al minimo e la variabilità dei risultati derivanti da durate differenziali degli attacchi fisici è ridotta.

Poiché il modello CSD viene utilizzato per studiare le malattie legate allo stress (ad esempio, depressione, ansia, disturbo da stress post-traumatico), vengono scelti saggi post-comportamentali, inclusi, ma non limitati a, saggi comportamentali di aggressività, memoria e anedonia. Negli ultimi anni, i saggi comportamentali post-CSD nei topi spesso valutano come e in che misura la socialità è influenzata⁹. La socievolezza è definita come la preferenza innata dei topi di interagire socialmente piuttosto che evitare socialmente un conspecifico. Poiché la socialità è soggetta agli effetti dello stress, sono stati stabiliti saggi che valutano esclusivamente lo sviluppo dell'evitamento sociale. L'evitamento sociale indotto dallo stress ha una rilevanza traslazionale in quanto rappresenta uno dei principali sintomi comportamentali dell'ansia sociale e della depressione negli esseri umani¹¹. Analogamente agli esseri umani, non tutti i topi sviluppano l'evitamento sociale dopo il trattamento con CSD, suggerendo la presenza di individualità nella risposta allo stress. Cohen e colleghi hanno proposto che i criteri comportamentali cut-off siano un approccio promettente per lo studio della neurobiologia dell'individualit๲. La selezione degli animali in base al comportamento si traduce in una divisione del gruppo, sottolineando le basi per gli studi gene-ambientali. Successivamente, diversi sottogruppi mostrano spesso un distinto arricchimento di specifiche varianti/modificazioni genetiche, che a loro volta possono essere studiate in diverse condizioni ambientali¹³. Di conseguenza, l'individualità nello sviluppo dell'evitamento sociale è stata utilizzata per dividere il singolo gruppo di topi maschi cronicamente socialmente sconfitti in due sottogruppi: suscettibili allo stress (socialmente evitanti) e resistenti allo stress (socialmente non evitanti ^9,14). Tuttavia, l'interpretazione del fenotipo di evitamento sociale nei topi come comportamento disadattivo o adattativo dovrebbe essere considerata nel contesto generale sia del trattamento (in questo caso CSD) che del test comportamentale post-trattamento. Inoltre, il test comportamentale post-trattamento di scelta valuterebbe idealmente altri aspetti della socialità e non solo lo sviluppo dell'evitamento sociale. Il nostro recente lavoro ha rivelato il coinvolgimento dell'apprendimento condizionato nell'evitamento sociale indotto dalla CSD¹⁵. In particolare, l'evitamento sociale indotto da CSD è una risposta condizionata avversiva nei confronti dei tratti caratterizzanti del ceppo dei residenti che funge da stimolo condizionato allo stimolo incondizionato, vale a dire gli attacchi da parte dei residenti. Inoltre, all'interno del sottogruppo socialmente evitante, alcuni individui possono discriminare tra i tratti del ceppo dei residenti avversi e quelli di altri nuovi ceppi sicuri, mentre altri individui mostrano un evitamento sociale generalizzato a entrambi i ceppi. Proponiamo qui un raffinato test comportamentale post-CSD: il Social Threat-Safety Test (STST)¹⁵. A differenza di altri test di interazione sociale⁹, l'STST consente una valutazione simultanea dello sviluppo dell'evitamento sociale come misura della corretta risposta condizionata avversiva (cioè l'apprendimento condizionato di successo) e della capacità di discriminazione della minaccia sociale e della sicurezza, entrambe utilizzate per identificare individui suscettibili allo stress e resilienti allo stress all'interno di un singolo gruppo di topi maschi cronicamente socialmente sconfitti. La valutazione della discriminazione tra minaccia sociale e sicurezza rispetto alla generalizzazione della risposta avversiva estende i criteri traslazionali utilizzati per classificare il singolo gruppo di animali cronicamente socialmente sconfitti in sottogruppi resilienti e suscettibili.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee relativa alla cura e all'uso degli animali per le procedure sperimentali e sono state approvate dalle autorità locali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). La Figura 1 rappresenta una sequenza temporale schematica.

1. Trattamento

1. Animali di interesse: Ottenere topi maschi C57BL6/J a 7 settimane di età e, all'arrivo, in una casa singola in una struttura a temperatura e umidità controllata con un ciclo luce-buio di 12 ore (luci accese: 8:00; luci spente: 20:00; 23 °C; 38% di umidità) con cibo e acqua ad libitum.
2. Sconfitta sociale cronica (CSD)
   1. Gruppo di trattamento
      1. Dopo 1 settimana di assuefazione, eseguire il trattamento con CSD per 10 giorni consecutivi utilizzando il ceppo CD-1 come ceppo del residente (per un protocollo dettagliato, fare riferimento a sconfitta sociale cronica⁹ e trattamento di sconfitta sociale cronica^{modificata 10}).
      2. Introdurre il mouse C57BL6/J nella gabbia del mouse CD-1 e contare 10 s di attacco fisico. Ripeti questo episodio tre volte, ognuna con un mouse CD-1 diverso, e separa di intervalli di 15 minuti tra un episodio e l'altro.
      3. Posizionare una parete a rete tra il mouse C57BL6/J e il mouse CD-1 durante questi intervalli, consentendo solo il contatto sensoriale. Dopo il terzo episodio, alloggia i topi C57BL6/J durante la notte nelle gabbie dei topi CD-1, separandoli entrambi da un muro a rete. Ripetere per 10 giorni.
         NOTA: Numero di topi CD-1 = numero di topi C57BL6/J + 1. Se il numero di topi trattati con C57BL6/J è inferiore a 10, è comunque necessario un minimo di 10 topi CD-1 per garantire che ogni giorno l'ultima fase sensoriale (che dura tutta la notte) sia con un nuovo topo CD-1 per tutti i 10 giorni di trattamento.
      4. Valutare attentamente il benessere fisico degli animali durante i 10 giorni. Se un animale è gravemente ferito, escluderlo dall'esperimento per motivi etici e scientifici (mobilità/attività durante il test post-trattamento). La Tabella 1 fornisce una lista di controllo per il benessere.
   2. Gruppo di controllo
      1. All'arrivo, mantenere i topi della stessa età nelle stesse condizioni del gruppo di trattamento.
      2. Dopo 1 settimana di assuefazione, introdurre gli animali di controllo per 90 secondi in una gabbia vuota e poi riportarli in gabbie individuali (a stabulazione singola) separate a metà da pareti a maglie identiche a quelle utilizzate per il gruppo di trattamento. Eseguire questa operazione quotidianamente in parallelo ai 10 giorni di trattamento.
         NOTA: Si consiglia di tenere il gruppo di controllo e il gruppo di trattamento alloggiati in stanze diverse.
3. Dopo l'ultima (^{decima) fase} sensoriale, alloggiare tutti i topi in nuove gabbie in condizioni simili a quelle descritte all'arrivo e lasciarli riposare per tutta la notte.
   NOTA: L'ultima fase sensoriale dovrebbe durare 24 ore, dopodiché gli animali vengono alloggiati in una casa singola.

2. Test post-trattamento: test di sicurezza contro la minaccia sociale (Figura 2)

1. Dopo il trattamento con CSD, tutti i topi (trattati e gruppi di controllo) sono stati isolati in nuove gabbie in condizioni simili a quelle descritte all'arrivo e li hanno lasciati riposare per la notte.
2. Durante le ore mattutine (8:00-13:30), pulire l'arena a tre camere (di forma rettangolare con dimensioni totali di 60 cm x 40 cm, realizzata con pareti acriliche trasparenti e pavimenti lisci) con etanolo al 5% e posizionarla sotto la telecamera con condizioni di luce di 37 lux. Assicurati che l'intera arena sia visibile.
3. Pulire gli involucri a rete (simili a gabbie in metallo o acrilico) con etanolo al 5% e posizionarli come mostrato negli angoli della Figura 1A.
4. Fase di assuefazione: introduci l'animale di interesse al centro dell'arena, consenti l'esplorazione per 6 minuti e poi riportalo nella sua gabbia di casa.
5. Posizionare il nuovo (sconosciuto) bersaglio sociale CD-1 (conspecifico) sotto un recinto a rete e il nuovo bersaglio sociale 129/Sv sotto l'altro recinto a rete.
   NOTA: È importante utilizzare un conspecifico 129/Sv sconosciuto per evitare un bias di familiarità. Preferibilmente avere 4 recinti a rete per arena: 2 attribuiti alla fase di assuefazione e 2 alla fase di test.
6. Fase di test: reintrodurre immediatamente l'animale di interesse al centro dell'arena e consentire l'esplorazione per 6 minuti.
7. Riporta tutti gli animali a casa loro. Pulire l'arena e i recinti a rete con etanolo al 5% tra i test di animali diversi, ma mai durante l'osservazione dello stesso animale, cioè mai tra la fase di assuefazione e quella di test.
8. Alternare la posizione degli involucri a rete tra gli animali (e mai tra le due fasi all'interno dello stesso animale) per controllare eventuali distorsioni preferenziali di posizione.

3. Punteggio e analisi

NOTA: Viene valutato e analizzato solo il test di trattamento post-stress, ovvero l'STST (e non il trattamento da stress CSD).

1. Definire la zona di interazione come 2 cm attorno ai contorni degli involucri della rete.
2. Calcola la durata dell'esplorazione dei recinti a rete durante la fase di assuefazione quando il naso dell'animale si trova all'interno della zona di interazione.
3. Assegna un punteggio alla durata dell'interazione con i target sociali durante la fase di test, quando il naso dell'animale si trova all'interno della zona di interazione.
   NOTA: Il rilevamento può essere ottenuto manualmente (utilizzando un timer o un software per l'assegnazione manuale del punteggio) o automaticamente. Indipendentemente dal metodo di rilevamento, prendi il punto del naso per le misurazioni dell'esplorazione e dell'interazione sociale e il punto centrale del corpo per le misurazioni relative all'attività (ad esempio, la distanza percorsa).
4. Calcola l'indice di interazione sociale come segue: tempo trascorso ad esplorare ciascun bersaglio sociale durante la fase di test / tempo medio trascorso ad esplorare i due recinti a rete vuoti durante la fase di assuefazione (Figura 2B).
5. Suddividere il gruppo di trattamento in 3 sottogruppi come segue: gli animali con un indice di interazione sociale ≥1 con il bersaglio sociale CD-1 non sono evitanti, gli animali con un indice di interazione sociale <1 con entrambi i bersagli sociali sono evitatori indiscriminati, gli animali con un indice di interazione sociale ≥1 solo con il bersaglio sociale 129/Sv sono discriminanti-evitatori (Figura 2C-D).
   NOTA: Il numero di animali all'interno di ciascuno dei tre sottogruppi può differire tra i diversi lotti di animali (circa 1/3 di tutti gli animali sottoposti al trattamento CSD presenterà le caratteristiche fenotipiche di uno dei tre sottogruppi).
6. Valutare l'effetto dello stress analizzando statisticamente l'indice di interazione sociale con il target sociale CD-1 tra il gruppo di trattamento e il gruppo di controllo (test t parametrico a due campioni o test di Mann-Whitney non parametrico).

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Risultati

L'indice di interazione sociale come misura della risposta condizionata avversiva
Un indice di interazione sociale ≥1 riflette una maggiore interazione sociale con il rispettivo target sociale rispetto all'esplorazione dei recinti a rete vuota. In condizioni basali, qui definite come non avere né esperienza appetitiva né avversiva con i tratti caratterizzanti di un ceppo specifico (qui sia i bersagli sociali per il gruppo di controllo che il bersaglio sociale 129/Sv per il gruppo di trattamento), ...

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Discussione

Il protocollo comportamentale qui descrive il Social Threat-Safety Test, utilizzato per dividere un singolo gruppo di trattamento post-CSD in tre diversi sottogruppi, che funge da metodo per indagare la biologia sottostante della suscettibilità allo stress e della resilienza e per testare potenziali terapie. Il contesto biologico e i dettagli tecnici devono essere attentamente considerati per guidare un disegno sperimentale approfondito.

Diverse condizioni abitative possono alterare i livelli...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arenas	Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x  40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors
Camera for video recording	Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg	ace Classic acA1300-60gc	If using automatic detection program, make sure cameras are compatible
Camera objective	KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv	Part-No. 10504
Detection program/Timer	Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/ethovision-xt	Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically
Housing cages	ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel	3010010	Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C
Mesh enclosures	Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol)
Mesh wall	selfmade	N/A	Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact
Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders	Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl	Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl	CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice