Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

להלן מפורטים שני פרוטוקולים להערכת מקורות מזון והעדפות אוביפוזיציה בזחלים ובנקבות של זבובים. אלה מורכבים מארבע אפשרויות עם שני גורמים המקיימים יחסי גומלין: סוג המצע וטמפרטורה. הבדיקות מאפשרות לקבוע את העדפת מקור המזון של הזחלים ואת העדפת אתר הביציות עבור הנקבות.

Abstract

זבובי נשיפה (Diptera: Calliphoridae) מציגים מגוון רחב של אורחות חיים של זחלים, המסווגים בדרך כלל כטפילות מחייבת, טפילות פקולטטיבית וספרו-נקרופגיה מוחלטת. כמה מינים טפיליים, הן מחייבים והן פקולטטיביים, נחשבים לבעלי חשיבות סניטרית וכלכלית, שכן הזחלים שלהם יכולים לגרום למיאזיס (התפשטות רימות ברקמה חיה). עם זאת, ראוי לציין כי הנקבה הבוגרת ממלאת תפקיד מכריע כשהיא בוחרת את אתר הביצית, ולכן קובעת במידה רבה את הרגלי האכילה ואת התנאים ההתפתחותיים של הזחלים. במחקר זה, מוצעים שני פרוטוקולים לבדיקת העדפת האכלת הזחלים והעדפת אתר הביציות הנקביות בהתחשב בשני גורמים המקיימים אינטראקציה: סוג מצע הבשר וטמפרטורה. ההגדרות המוצגות כאן אפשרו לבדוק זחלי לוסיליה קופרינה ונקבות גרבידיות במבחן של ארבע אפשרויות עם שתי טמפרטורות (33 ± 2 מעלות צלזיוס ו- 25 ± 2 מעלות צלזיוס) ושני סוגים של מצעי בשר (בשר טרי בתוספת דם ובשר רקוב בן 5 ימים). זחלים או נקבות גרבידיות יכולים לבחור להתחפר או להטיל את ביציהם, בהתאמה, באחד מהבאים: בשר רקוב ב -25 מעלות צלזיוס (המדמה מצב של מין נקרופג), בשר טרי בתוספת דם ב -33 מעלות צלזיוס (המדמה מצב של מין טפילי), ושתי בקרות, בשר רקוב ב -33 מעלות צלזיוס, או בשר טרי בתוספת דם ב -25 מעלות צלזיוס. ההעדפה נבחנת על ידי ספירת מספר הזחלים או הביצים המוטלים בכל אפשרות עבור כל משוכפל. השוואת התוצאות הנצפות להתפלגות אקראית אפשרה להעריך את המובהקות הסטטיסטית של ההעדפה. התוצאות הצביעו על כך שלזחלי L. cuprina יש העדפה חזקה למצע הרקוב ב 25 °C (75 °F). לעומת זאת, העדפת אתר האוביפוזיציה על ידי הנקבות הייתה מגוונת יותר לסוג הבשר. מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת כדי לבדוק את ההעדפה של מיני חרקים אחרים בגודל דומה. שאלות אחרות ניתן לחקור גם באמצעות תנאים חלופיים.

Introduction

זבובים, במיוחד מוסקואידים קליפטרטיים (כולל זבובי מציצה, זבובי בית, זבובי בוט וזבובי בשר בין היתר), מפגינים מגוון רחב של אורחות חיים, הכוללים התנהגויות טפיליות ונקרו-ספרופגוס1. מינים טפיליים גורמים בדרך כלל למיאזיס (myiasis), התפשטות של רקמות חיות על ידי רימות (זחלים)2. במשפחת Calliphoridae, שני המינים הטפיליים המחייבים והפקולטטיביים הם מזיקים עיקריים לחיות משק האחראים להפסדים כלכליים ולרווחת בעלי חיים ירודה עקב נגיעות רימות 2,3,4,5,6,7. טפילי חובה, כגון תולעי העולם החדש ותולעי העולם הישן (Cochliomyia hominivorax ו- Chrysomyia bezziana, בהתאמה), הם בעייתיים במיוחד 4,7,8,9,10 יחד עם טפילים פקולטטיביים, כגון זבובי הנשיפה של הכבשים (Lucilia cuprina ו- Lucilia sericata)2,5,6, 7. מינים שאינם טפיליים, כולל אלה sapro-necrophagous, מתפתחים בחומר אורגני נרקב ונמק ונמצאים בדרך כלל בסביבות לא סניטריות. אורח החיים הלא טפילי שלהם יכול לשמש בהצלחה לטיפול ברימות, המשתמש בזחלי זבובים כדי לנקות פצעים של רקמות נמק11,12,13. זבובי נשיפה משמשים גם במדע הזיהוי הפלילי, שכן הם בין האורגניזמים הראשונים לאתר וליישב גופות שנפטרו לאחרונה, כאשר הזחלים המתפתחים משמשים כאמצעי להערכת זמן המוות14.

אורחות חיים של זבובים היו נושא למחקרים שונים (למשל,15,16,17,18,19,20,21) בשל חשיבותם ביחס לאינטרסים אנושיים. הבנת המנגנונים הביולוגיים השולטים באורח החיים של מין מסוים יכולה לספק תובנות חשובות לשיפור שיטות שמטרתן לשלוט במינים של מזיקים. יתר על כן, המגוון והאבולוציה של אורחות החיים של הזבובים מציעים הקשר אידיאלי לחקר מקורותיהן ומנגנוניה של תכונות מורכבות (למשל, טפילות). טפילות עקב רימות הניזונות מרקמה חיה התפתחה באופן עצמאי מספר פעמים במשפחת Calliphoridae22,23. עם זאת, ההיסטוריה האבולוציונית של הרגלי האכילה של זבובי נשיפה עדיין אינה ידועה במידה רבה, כאשר מחקרים מוגבלים למיפוי ההרגלים לאורך פילוגניות (למשל, 16,19,22) ללא סיוע של בדיקות פונקציונליות. לדוגמה, לא בטוח אם טפילי החובה התפתחו ממינים כלליים (כלומר, טפילים פקולטטיביים) או ישירות ממינים נקרופגיים. גם התהליכים המולקולריים, הפיזיולוגיים וההתנהגותיים המלווים את השינויים האבולוציוניים באורח החיים אינם ידועים ברובם.

בהקשר זה, טפילים פקולטטיביים, כגון זבוב הכבשים לוסיליה קופרנה (Lucilia cuprina), שיכולים להתפתח כטפילים על פונדקאי או כנקרופג'ים על גופות, מציעים את האפשרות לחקור את הגורמים והמנגנונים השולטים בבחירות אורח החיים. לוסיליה קופרינה (שם מדעי: Lucilia cuprina) הוא מין קוסמופוליטי הידוע בגרימת מכת זבובי כבשים, במיוחד באוסטרליה שם הוא נחשב למזיק 3,16. Myiasis עקב L. cuprina יכול להתרחש גם אצל בעלי חיים אחרים, חיות מחמד, ובני אדם 3,24,25,26,27,28,29,30. עם זאת, הזחלים שלו יכולים להתפתח גם ברקמות נמק וחומר נרקב ומין זה שימש בהצלחה באנטומולוגיה משפטית מכיוון שהוא מהיר מאוד לאתר וליישב גופות31,32,33,34. למרות שאורח החיים הטפילי לעומת הלא טפילי של הזבובים מוגדר על ידי שלב הזחל, הנקבה הבוגרת היא זו שבוחרת את אתר הביצית. כתוצאה מכך, הנקבה הבוגרת משפיעה מאוד על אורח החיים של הזחלים, שכן האחרונים מוגבלים בניידות. עם זאת, בחירתה של הנקבה אינה מעידה בהכרח על כך שהזחלים יעדיפו את אותו המצע כאשר תוצג בפניהם בחירה35. אחת ההשערות היא ששינויים התנהגותיים שהובילו לכך שהנקבות הטילו את ביציהן על רקמות חיות היו יכולים להיות חלק ממעבר מוקדם לאורח חיים טפילי. התאמות מקדימות או יכולות פיזיולוגיות של הזחלים המתקבלים היו חיוניים להתפתחותם המוצלחת על הרקמה החיה, מה שהוביל להופעת אורח החיים הטפילי. ככאלה, התהליכים המושפעים והנבחרים אינם בהכרח מתיישרים בין שני שלבי החיים.

בהקשר זה פותחו שתי שיטות לבדיקת העדפה התנהגותית בזבובים, בפרט, עבור L. cuprina, לגבי מצע הזנת זחלים (בדיקת העדפת זחלים) ואתר העדפת זחלים (בדיקת העדפת נקבה). שיטות אלה לוקחות בחשבון שני גורמים המקיימים אינטראקציה: טמפרטורה וטריות הבשר. הטמפרטורה נבחרה כגורם מכריע מכיוון שרוב המקרים של מיאזיס מתרחשים בבעלי חיים הומתרמיים2. לפיכך, טמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס נבחרה כפרוקסי ל"גורם אורח החיים הטפילי", ואילו טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר) מייצגת את "הגורם הלא טפילי". נבחרה טמפרטורה של 25 °C (75 °F) מכיוון שהיא מייצגת את הטמפרטורה השנתית הממוצעת שנרשמה בברזיל (המכון הלאומי למטאורולוגיה, INMET). בנוסף, נבחנו שני סוגים של מצעי בשר, שניהם ממקורות בקר: (i) בשר טרי בתוספת דם, המחקה את המצע לאורח החיים הטפילי, המשמש לגידול הזבוב הטפילי Co. hominivorax בתנאי מעבדה36, ו-(ii) בשר רקוב בן 5 ימים, המדמה את המצע לאורח החיים הנקרופג. מצע הבקר משמש בדרך כלל לגידול L. cuprina בתנאי מעבדה 27,37,38,39 מכיוון שהוא מציע מספר יתרונות מבחינת זמינות, חסכוניות ומעשיות תוך היותו מצע מוצדק מבחינה אקולוגית. מחקרים אחרים40,41 שהשוו את ההשפעה של מצעים רקובים לעומת טריים בזבובים השתמשו במצע רקוב בן 7 ימים (בתנאים אנאירוביים) והראו השפעה שלילית של המצע הרקוב על קצב ההתפתחות, ההישרדות והצמיחה. מכיוון שידוע כי L. cuprina מאכלס גופות טריות אשר בדרך כלל חשופות לאוויר, החלטנו להשתמש בבשר רקוב בן 5 ימים (בשר בקר טחון) בסירים לא הרמטיים (פירוק אירובי ואנאירובי) כדי לחקות מצע נקרופג.

עיצובי הניסוי המוצגים כאן מציעים את היתרון של הבחנה בהעדפות עבור גורמים בודדים, כמו גם ההשפעות המשולבות שלהם. יתר על כן, הפנוטיפים שדורגו, כלומר בחירת מצע הזנת הזחלים ומספר הביצים שהוטלו, רלוונטיים ישירות להיבטים הביולוגיים והאקולוגיים של מיני הזבובים. התאמתם של פרוטוקולים אלה מודגשת על ידי הוכחת יעילותם ב - L. cuprina. בנוסף, מסופק סקריפט לניתוח סטטיסטי, אשר ניתן להשתמש בו כדי להשוות את התוצאות הנצפות שהתקבלו L. cuprina לנתונים אקראיים מדומים, הבטחת ניתוח סטטיסטי חזק ופרשנויות.

Protocol

דגימות זבובים הושגו באמצעות מלכודות ולא על בעלי חיים שורצים. רישיון SISBIO (67867-1) הונפק לאיסוף והחזקת זבובים ממשפחת Calliphoridae בשבי בתנאי מעבדה. דגימות חרקים פטורות מהערכה אתית במחקר בברזיל. בשר בקר ודם הושגו באופן מסחרי, ולא נדרש אישור אתי.

1. העדפת האכלת זחלים

  1. הכנת צלחות פטרי המכילות 2% אגר
    1. הכינו ארבע מנות פטרי עם אגר 2%. כדי לעשות זאת, להוסיף 6 גרם של אגר בקטריולוגי 300 מ"ל של מים ולהמיס את התערובת במיקרוגל. לאחר מכן, מחלקים את הנפח באופן שווה לארבע צלחות פטרי זכוכית (150X20 מ"מ), תוך שימוש בכ-70 מ"ל בכל מנה.
      הערה: הכינו צלחות פטרי השוות למספר העותקים הניסיוניים הרצויים. במחקר זה נעשה שימוש ב-36 עותקים משוכפלים.
    2. לאחר שהאגר התמצק, השתמשו בצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל (קוטר 3 ס"מ) כדי לנקב ארבעה חורים באגר, שניים מכל צד של צלחת הפטרי, בהתאם לתבנית החיתוך שסופקה (איור 1).
      הערה: הגדרה זו דומה לפרוטוקולים שתוארו בעבר על ידי Fouche et al. (2021)40 ו- Boulay et al. (2016)42.
  2. הכנת מצעים
    1. כדי להכין את הבשר הטרי בדם, מוסיפים 12 מ"ל של דם בקר מדולל ל -200 גרם של בשר בקר טרי טחון. מערבבים היטב. הקפידו להשתמש בגלילים ובכפות מדורגים שונים עבור כל סוג בשר כדי למנוע זיהום צולב בין מצעים.
      הערה: הדם המדולל מורכב מ-50% דם טהור מעורבב עם נוגד קרישה (3.8% נתרן ציטראט) ו-50% מים מסוננים.
    2. כדי להכין את המצע הרקוב, מוסיפים 12 מ"ל מים מסוננים ל 200 גרם של בשר בקר רקוב בן 5 ימים ומערבבים אותו היטב.
      הערה: בשר רקוב הושג על ידי דגירה של בשר טחון טרי במשך חמישה ימים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בסירי פלסטיק לא הרמטיים (תערובת של פירוק אירובי ולא אירובי). כל סיר הכיל 200 גרם בשר טחון טרי. לאחר מכן הוא הוקפא עד לשימוש.
    3. ממלאים שני חורים בכל צלחת פטרי בתערובת הבשר והדם הטרי ואת שני החורים הנותרים בתערובת הבשר והמים הרקובים.
      הערה: כדי למנוע הטיות מיקום, שנו את המיקום של סוגי הבשר השונים בצלחות הפטרי. לדוגמה, חלק מצלחות הפטרי צריכות להכיל את אותו סוג של בשר זו מול זו, בעוד שבמנות אחרות יש לחצות את סוג הבשר, כפי שמוצג באיור 2.
  3. מערך ניסיוני
    1. בטמפרטורת חדר (RT) של 25°C, מקמו את כרית החימום ישירות מתחת למקור אור כדי להאיר באופן שווה את אזור הניסוי ולהימנע מהטיה התנהגותית כלפי או נגד האור. הניחו רפידות קרטון סביב כרית החימום כדי להבטיח שמערך הניסוי יישאר מאוזן.
      הערה: מקור האור ששימש היה אור לבן פולט חימום נמוך, כגון צינור ניאון. כרית החימום הוצבה על שולחן ממש מתחת לנורות התקרה (איור 3).
    2. כסו את כרית החימום ואת רפידות הקרטון המפולסות בקרטון שחור והפעילו את כרית החימום.
      הערה: יש להשתמש בכיסוי הקרטון השחור כדי להימנע מרמזים חזותיים שעלולים להטות את מבחן ההתנהגות.
    3. הניחו שש צלחות פטרי עם מצע אגר ובשר על הקרטון השחור עם שני מצעים, אחד מכל סוג, על כרית החימום והשניים האחרים מעל פני משטח כרית החימום (איור 2). תנו למצעים לחמם כ-10 דקות.
      הערה: עיבוי עשוי להיווצר על מכסה צלחות הפטרי.
  4. בדיקת זחל
    1. בדוק את הטמפרטורה של המצע (צד קר: 25 ± 2 °C; צד חם: 33 ± 2 °C) עם מדחום אינפרא אדום.
      הערה: כרית החימום נשארת דולקת לכל אורך הניסוי. מדידות הטמפרטורה נעשו בתחילת הניסוי ובסופו. למרות הטמפרטורה השתנתה על ידי ± 2 °C (75 °F), עדיין היה לפחות 8 °C (75 °F) הפרש הטמפרטורה בין התנאים החמים והקרים.
    2. לאחר שתגיעו לטמפרטורה הרצויה, הניחו חמישה זחלים בעלי כוכב שלישי במרכז כל צלחת פטרי באמצעות פינצטה (איור 2) וכסו את צלחות הפטרי עם העפעפיים. תן לניסוי הבחירה לרוץ במשך 10 דקות.
      הערה: חלק מהזחלים עשויים לזחול סביב הקצוות ועל מכסה צלחות הפטרי. אם זחל כלשהו בורח, השתמשו בפינצטה כדי להחזיר אותו למרכז צלחת הפטרי.
    3. לאחר 10 דקות, הוציאו את כל צלחות הפטרי מכרית החימום והניחו אותן על משטח אחר כדי להימנע מהמשך חימום המצעים. לאחר מכן, ספרו את מספר הזחלים בכל מצע, כמו גם את אלה שלא בחרו מצע כלשהו.
      הערה: זחלי Lucilia cuprina נשארים במצע הנבחר שלהם, כפי שנצפה בניסוי זה.

2. העדפת אתר ביצית נשית

  1. מערך ניסיוני
    1. השתמשו במדף רגיל שכוסה בעבר בקרטון שחור ומואר באופן שווה בפסי תאורת LED לבנים.
      הערה: יש להשתמש בכיסויי הקרטון השחורים כדי להימנע מרמזים חזותיים שעלולים להטות את בדיקת ההתנהגות. פסי הלד הלבנים מאובטחים לאורכם במרכז המדף ממש מעל הניסוי. המדפים ששימשו במערך מוקמו במרחק של 45 ס"מ זה מזה.
    2. ב-RT (25°C), הניחו כרית חימום במרכז המדף. השתמש רפידות קרטון סביב כרית החימום כתמיכה כדי להבטיח כי ההתקנה הניסיונית מפולסת.
    3. כסו את כרית החימום ואת רפידות הקרטון המפולסות בקרטון שחור כדי לשמור על אותה תבנית חזותית מתחת לכל המצעים.
    4. הניחו שני מיכלי זכוכית בצורת צלב על מדף אחד, כל אחד צריך להיות שתי זרועות מעל הקרטון השחור וכרית החימום. הפעילו את פסי תאורת הלד הלבנים ואת כריות החימום לפני תחילת הניסוי.
    5. השתמשו באתנול 70% כדי לנקות את הצלבים (בתוך הצלב והמכסה) כדי למנוע זיהום ריח.
  2. הכנת מצעים
    1. הכינו ארבע צלחות פטרי (60 מ"מ על 15 מ"מ) בכל צלב עם 5 גרם בשר רקוב או טרי בן 5 ימים (שניים מכל סוג מצע).
      הערה: הכינו צלחות פטרי השוות למספר ההעתקים הניסיוניים הרצויים כפול ארבע. במחקר זה נעשה שימוש ב-30 רפליקטים, ובסך הכל ב-120 צלחות פטרי מוכנות.
    2. הוסיפו 1 מ"ל דם בקר מדולל (50% דם טהור עם נוגדי קרישה ו-50% מים מסוננים) על הבשר הטרי ו-1 מ"ל מים מסוננים על הבשר הרקוב. מערבבים היטב את הבשר (טרי או רקוב) עם הנוזל (דם או מים) בעזרת כף שונה לכל סוג בשר.
      הערה: הכנת הבשר לבדיקת הנקבה דומה מאוד לבדיקת הזחל, אם כי הכמויות שונות מכיוון שמבחן הנקבה יפעל זמן רב יותר ממבחן הזחל. זכור להשתמש בקצוות פיפטה שונים וכפיות עבור כל סוג של בשר כדי למנוע כל זיהום צולב ריח בין מצעים.
    3. בדוק אם האלכוהול התאדה לחלוטין מהצלבים. לאחר מכן, הניחו ארבע צלחות פטרי (אחת מכל סוג בשר על כרית החימום והשתיים האחרות מחוץ לפני השטח של כרית החימום) בקצה של כל זרוע של הצלב (איור 4). סוגרים את הצלבים עם המכסים ונותנים למצעים להתחמם כ-10 דקות.
      הערה: בנוסף, כדי למנוע הטיות מיקום, לשנות את המיקום של סוגי בשר שונים בצלבים. לדוגמה, חלק מהצלבים צריכים להכיל את אותו סוג בשר על זרועות סמוכות, בעוד שבצלבים אחרים, אותו סוג בשר צריך להיות זה מול זה, כפי שמוצג באיור 4.
  3. מבחן נשים
    1. אספו נקבות גרבידיות בכלוב הזבובים ובודדו אותן לצינורות בודדים.
      הערה: נקבות גרבידיות מאופיינות בבטן מוגדלת ולבנבן-צהוב, בניגוד לנקבות שאינן גרבידיות (איור 5). נקבות גרביד נאספו בין 10 ל-16 ימים לאחר הופעתן לצורך הניסויים.
    2. בדוק את טמפרטורת המצעים בצלבים (צד קר: 25 ± 2 ° C; צד חם: 33 ± 2 ° C) באמצעות מדחום אינפרא אדום.
      הערה: בדיוק כמו במבחן הזחל, כרית החימום נשארת דולקת לכל אורך הניסוי. מדידות הטמפרטורה נעשו בתחילת הניסוי ובסופו. למרות הטמפרטורה השתנתה על ידי ± 2 °C (75 °F), עדיין היה לפחות 8 °C (75 °F) הפרש הטמפרטורה בין התנאים החמים והקרים.
    3. מניחים את הצינור הפוך המכיל נקבה גרבידית אחת בפתח במרכז כל צלב. לאחר שהנקבה נכנסת לצלב, הסירו את הצינור וסגרו את הפתח עם המכסה הקטן שלו. לאחר סגירת כל הצלבים, מניחים קרטון שחור בחזית המדף כדי לתחום את מערך הניסוי. תן לניסוי לרוץ במשך 4 שעות.
    4. לאחר מכן, להסיר את הנקבה, על ידי לתפוס אותו בזהירות עם צינור, ולבדוק אם יש ביצים על המצע.
    5. זהה את המכסה של כל צלחת פטרי עם סוג המצע מכל צלב. השתמשו באתנול 70% כדי לנקות את הצלבים (בתוך הצלב והמכסה) מכל ריח מהבדיקה.
      הערה: במקרה שלא ניתן לספור את הביצים מיד לאחר הניסוי, ניתן לאחסן את צלחות פטרי עם מצעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  4. ספירת ביצים
    הערה: אם המצעים בצלחות הפטרי הוקפאו, הפשירו אותם לפני הספירה.
    1. השתמש בסטריאומיקרוסקופ כדי לספור את מספר הביצים המוטלות בכל מצע. השתמש במברשת ומים כדי לעזור להפריד את הביצים כדי לספור אותם.

3. ניתוח נתונים וסטטיסטיקה

  1. חישוב מדדי העדפות
    1. עבור כל העתק של בדיקות הזחל (n = 36) והנקבה (n = 30), חשב את מדד ההעדפה לבשר (המיועדכבשר PI) על ידי קביעת היחס בין הזחלים או הביצים הנמצאים על מצעים טריים (טרי חם וקר טרי) לספירה הכוללת של הזחלים או הביצים על כל המצעים (טרי חם + קר טרי + רקוב חם + קר רקוב).
      בשר PI = (# זחלים או ביצים על מצעים טריים) / # סה"כ זחלים או ביצים
      הערה: המונחים "חם" ו "קר" מעידים על תנאי טמפרטורה של 33 ± 2 °C (75 °F) ו 25 ± 2 °C (75 °F), בהתאמה.
    2. כמו כן, יש לחשב את מדד ההעדפה לטמפרטורה (PI temp) עבור כל העתק של בדיקות זחלים ונקבות כמספר הזחלים או הביצים הנמצאים על מצעים חמים (חם טרי וחם רקוב) חלקי המספר הכולל של הזחלים או הביצים על כל המצע (חם טרי + קר טרי + חם רקוב + קר רקוב).
      PI temp = (# זחלים או ביצים על מצעים חמים) / # סה"כ זחלים או ביצים
      הערה: ערכים קרובים ל- 1 משקפים העדפה למצעים טריים או חמים וערכים קרובים לאפס מציינים העדפה למצעים רקובים או קרים. ניתן לחשב את PIs באופן ידני או באמצעות הקוד שסופק (קבצים משלימים S1 וקבצים משלימים S2).
  2. השוואה בין ההעדפה שנצפתה לנתונים אקראיים מדומים
    1. הפעל את הקוד שסופק (קובץ משלים S1 וקובץ משלים S1) כדי ליצור את הנתונים המדומים ולהשוות אותם לנתונים שנצפו.
      הערה: קוד זה מייצר 1000 נתונים אקראיים מדומים עבור זחלים ונקבות ומחשב את מדדי ההעדפות (PIs) עבור כל העתק של הסימולציה, ואת הנתונים הנצפים של L. cuprina. הסימולציות מניחות שגם הזחלים וגם הנקבות אינם מפגינים העדפת מצע ומקבלים החלטות אקראיות. הסימולציות משלבות היבטים התנהגותיים מרכזיים של בעלי החיים, וכוללות תרחישים שונים כגון: ההסתברות שהזחלים לא יבחרו מצע כלשהו, ונקבות בוגרות ירכזו את הטלת הביצים שלהן על מצע בודד או יחלקו את ביציהן באופן אחיד או לא בין מצעים שונים. מודלים ליניאריים כלליים (GLM, משפחה: quasibinomial; קישור: logit) שימשו להשוואת הנתונים הנצפים ממבחני ההתנהגות עם הנתונים האקראיים המדומים. ה-GLM המועסק התאים היטב לניתוח זה בשל אופיו התחום של מדד ההעדפות (PI), שנע בין 0 ל-1. GLMs מיומנים בטיפול במשתני תגובה שאינם מבוזרים באופן נורמלי ומאפשרים השוואות סטטיסטיות חזקות. בחירה זו אפשרה תובנות משמעותיות בכך שאפשרה להשוות ביעילות נתונים נצפים ממבחני התנהגות עם דפוסים מורכבים שנוצרו על ידי נתונים אקראיים מדומים. ייתכן שיהיה צורך בהתאמות קלות לקוד עבור ערכות נתונים מובנות אחרות.

תוצאות

כדי להדגים את יעילותן של השיטות המוצגות, הניסויים נערכו באמצעות אוכלוסיית מעבדה של Lucilia cuprina (משפחה: Calliphoridae), זבוב טפילי פקולטטיבי2. את כל הנתונים הגולמיים שהתקבלו עבור מין זה ניתן למצוא בקובץ משלים S3 עם התוצאות עבור בדיקות העדפות הזחל והמצע הנקבי. כדי להעריך אם ה?...

Discussion

הבנת האבולוציה של הרגלי האכלה, במיוחד בהקשר של טפילות אצל זבובים, מחייבת בחינה של העדפות המצע לאורך שלבי חיים שונים להאכלה או לביציות. לכן, במחקר זה הוצעו שיטות חזקות ופשוטות לחקירת העדפות המצע בזחלים ובנקבות של זבובים. שיטות אלה נבדקו בלוסיליה קופרנה (Lucilia cuprina), זבוב טפילי פקולטטיבי

Disclosures

איש מהם לא הצהיר.

Acknowledgements

אנו מודים לפטרישיה תיסן, גבריאלה ס. זאמפים ולוקאס דה אלמיידה קרבליו על שסיפקו את מושבת L. cuprina ועל עזרתם בהקמת הניסוי. ברצוננו להודות גם לרפאל בארוס דה אוליביירה על הצילום והעריכה של הסרטון. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר של האומה המתפתחת מהאגודה להתנהגות בעלי חיים ל- V.A.S.C. ועל ידי מענק FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo ל- T.T.T. (20/05636-4). S.T. ו- D.L.F. נתמכו על ידי FAPESP (מענק פוסט-דוקטורט 19/07285-7 ומלגת דוקטורט 21/10022-8, בהתאמה). V.A.S.C. ו- A.V.R. נתמכו על ידי מלגות CNPq PhD (141391/2019-7, 140056/2019-0, בהתאמה). T.T.T. נתמכה על ידי CNPq (310906/2022-9).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarSigma-Aldrich05038-500GFor microbiology
Black cardboards--70x50 cm
Bovine blood with anticoagulat --50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat--Around 7-8% of fat
Brush--Made with plastic
Conical tubeFalcon or Generic-50 mL
Cross-shaped glass containersHandmadeNA48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
ErlenmeyerVidrolaborNA500 mL
70% EthanolSynthA1084.01.BL70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinderNalgon or Generic-500 mL and 50 mL
Heating padThermolux-30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometerHeTaiDaHTD8808Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S,
Accuracy: ±0.2 °C,
Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)PrecisionNA150x20 mm dimensions
          (Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PSCralplast1813060x15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette--3 mL (total volume)
Sodium citrateSynthC11033.01.AG3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons--More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatulaGeneric-Flat end and spoon end
StereomicroscopeBioptika-WF10X/22 lenses
Tweezer--Metal made and fine point
White led light stripsNANA4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)

References

  1. Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
  2. Zumpt, F. . Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , (1965).
  3. Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
  4. Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
  5. Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
  6. Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
  7. Mullen, G. R., Durden, L. A. . Medical and veterinary entomology. , (2009).
  8. Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
  9. World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , (2013).
  10. Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45 (2018).
  11. Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30 (2016).
  12. Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551 (2020).
  13. Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
  14. Greenberg, B. Flies as forensic indicators. Journal of Medical Entomology. 28 (5), 565-577 (1991).
  15. Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
  16. Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
  17. McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
  18. Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
  19. Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230 (2021).
  20. Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
  21. Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598 (2016).
  22. Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
  23. Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
  24. Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
  25. Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
  26. Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
  27. Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
  28. Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
  29. Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
  30. Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
  31. Smith, K. G. V. . A manual of forensic entomology. , (1986).
  32. Goff, M. L. . A Fly for the Prosecution. , (2001).
  33. CRC Press. . Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , (2001).
  34. Greenberg, B., Kunich, J. C. . Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
  35. Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
  36. Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
  37. Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
  38. Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
  39. Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
  40. Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791 (2021).
  41. Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
  42. Boulay, J., Deneubourg, J. -. L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676 (2016).
  43. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  44. Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
  45. Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
  46. Yang, S. -. T., Shiao, S. -. F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
  47. Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
  48. Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
  49. Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420 (2017).
  50. Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved