Explorando escolhas de história de vida: usando a temperatura e o tipo de substrato como fatores de interação para as preferências de larvas e fêmeas de mosca-varejeira

Resumo

Neste trabalho, são detalhados dois protocolos para avaliação da fonte alimentar e preferências de oviposição em larvas e fêmeas de moscas-varejeiras. Estes compreendem quatro opções com dois fatores interagentes: tipo de substrato e temperatura. Os ensaios permitem determinar a preferência da fonte alimentar das larvas e a preferência do sítio de oviposição para as fêmeas.

Resumo

As moscas-varejeiras (Diptera: Calliphoridae) apresentam uma ampla variedade de estilos de vida larval, tipicamente classificados como parasitismo obrigatório, parasitismo facultativo e sapro-necrofagia completa. Várias espécies parasitárias, obrigatórias e facultativas, são consideradas de importância sanitária e econômica, pois suas larvas podem causar miíase (infestação de larvas em tecidos vivos). No entanto, vale ressaltar que a fêmea adulta desempenha um papel decisivo na escolha do local de oviposição e, portanto, determina em grande parte o hábito alimentar e as condições de desenvolvimento das larvas. Neste estudo, dois protocolos são propostos para testar a preferência alimentar das larvas e a preferência do local de oviposição das fêmeas, considerando dois fatores que interagem: tipo de substrato da carne e temperatura. Os dispositivos aqui apresentados permitiram testar larvas e fêmeas grávidas de Lucilia cuprina em um ensaio de quatro escolhas com duas temperaturas (33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C) e dois tipos de substratos cárneos (carne fresca suplementada com sangue e carne podre de 5 dias de idade). Larvas ou fêmeas grávidas podem optar por escavar ou colocar seus ovos, respectivamente, em qualquer um dos seguintes: carne podre a 25 °C (simulando uma condição de espécie necrófaga), carne fresca suplementada com sangue a 33 °C (simulando uma condição de espécie parasita) e dois controles, carne podre a 33 °C ou carne fresca suplementada com sangue a 25 °C. A preferência é avaliada contando-se o número de larvas ou ovos postos em cada opção para cada repetição. A comparação dos resultados observados com uma distribuição aleatória permitiu estimar a significância estatística da preferência. Os resultados indicaram que as larvas de L. cuprina têm forte preferência pelo substrato podre a 25 °C. Por outro lado, a preferência pelo local de oviposição pelas fêmeas foi mais variada para o tipo de carne. Esta metodologia pode ser adaptada para testar a preferência de outras espécies de insetos de tamanho semelhante. Outras questões também podem ser exploradas usando condições alternativas.

Introdução

As moscas, particularmente os muscóides caliptratos (incluindo moscas-varejeiras, moscas domésticas, moscas-bot e moscas-da-carne, entre outros), exibem uma ampla gama de estilos de vida, englobando comportamentos parasitários e necrossaprófagos¹. As espécies parasitárias tipicamente causam miíase, uma infestação de tecidos vivos por larvas (larvas)². Na família Calliphoridae, tanto as espécies parasitárias obrigatórias quanto as facultativas são as principais pragas pecuárias responsáveis por perdas econômicas e precários de bem-estar animal devido às infestações de larvas 2,3,4,5,6,7. Parasitas obrigatórios, como as bicheiras do Novo Mundo e do Velho Mundo (Cochliomyia hominivorax e Chrysomyia bezziana, respectivamente), são especialmente problemáticos4,7,8,9,10 juntamente com parasitas facultativos, como as moscas-varejeiras (Lucilia cuprina e Lucilia sericata)2,5,6^{, 7º}. Espécies não parasitárias, incluindo as sapronecrófagas, desenvolvem-se em matéria orgânica em decomposição e necrótica e são comumente encontradas em ambientes insalubres. Seu estilo de vida estritamente não parasitário pode ser usado com sucesso para a terapia de larvas, que usa larvas de moscas para limpar feridas de tecidos necróticos^11,12,13. As moscas-varejeiras também são utilizadas na ciência forense, pois estão entre os primeiros organismos a localizar e colonizar corpos recentemente falecidos, sendo que as larvas em desenvolvimento servem como meio de estimar o tempo da morte¹⁴.

O estilo de vida da mosca-varejeira tem sido objeto de várias pesquisas (e.g.^,15,16,17,18,19,20,21) devido à sua importância em relação aos interesses humanos. A compreensão dos mecanismos biológicos que regem o estilo de vida de uma espécie pode fornecer informações valiosas para melhorar os métodos destinados ao controle de espécies-praga. Além disso, a diversidade e a evolução dos estilos de vida das moscas-varejeiras oferecem um contexto ideal para estudar as origens e os mecanismos de características complexas (por exemplo, parasitismo). O parasitismo devido às larvas que se alimentam de tecidos vivos evoluiu independentemente várias vezes dentro da família Calliphoridae^22,23. No entanto, a história evolutiva dos hábitos alimentares das moscas-varejeiras ainda é pouco conhecida, com estudos restritos ao mapeamento dos hábitos ao longo de filogenias (e.g.^,16,19,22) sem o auxílio de ensaios funcionais. Por exemplo, é incerto se os parasitas obrigatórios evoluíram de generalistas (isto é, parasitas facultativos) ou diretamente de espécies necrófagas. Os processos moleculares, fisiológicos e comportamentais que acompanham as mudanças evolutivas no estilo de vida também são amplamente desconhecidos.

Nesse contexto, parasitas facultativos, como a mosca-varejeira Lucilia cuprina, que podem se desenvolver como parasitas em um hospedeiro ou como necrófagos em cadáveres, oferecem a possibilidade de explorar os fatores e mecanismos que controlam as escolhas de estilo de vida. Lucilia cuprina é uma espécie cosmopolita conhecida por causar moscas de ovelhas, especialmente na Austrália, onde é considerada uma praga ^3,16. A miíase por L. cuprina também pode ocorrer em outros animais de criação, animais de estimação e humanos 3,24,25,26,27,28,29,30. No entanto, suas larvas também podem se desenvolver em tecidos necróticos e matéria em decomposição e esta espécie tem sido usada com sucesso em entomologia forense por ser muito rápida para localizar e colonizar cadáveres^31,32,33,34. Embora o estilo de vida parasitário versus não parasitário das moscas-varejeiras seja definido pelo estágio larval, é a fêmea adulta que seleciona o local de oviposição. Consequentemente, a fêmea adulta influencia fortemente o estilo de vida das larvas, uma vez que estas têm mobilidade limitada. No entanto, a escolha da fêmea não implica necessariamente que as larvas prefiram o mesmo substrato quando apresentadas com uma escolha³⁵. Uma hipótese é que mudanças comportamentais que levam as fêmeas a colocar seus ovos em tecidos vivos poderiam ter sido parte de uma mudança precoce para um estilo de vida parasitário. Pré-adaptações ou capacidades fisiológicas das larvas resultantes teriam sido essenciais para o seu desenvolvimento bem-sucedido no tecido vivo, levando ao surgimento do estilo de vida parasitário. Como tal, os processos afetados e selecionados podem não necessariamente se alinhar entre as duas fases da vida.

Neste contexto, dois métodos foram desenvolvidos para testar a preferência comportamental em moscas-varejeiras, em particular, para L. cuprina, em relação ao substrato alimentar larval (ensaio de preferência larval) e ao local de oviposição (ensaio de preferência de fêmeas). Esses métodos levam em conta dois fatores que interagem: temperatura e frescor da carne. A temperatura foi escolhida como fator crucial, uma vez que a maioria dos casos de miíase ocorre em animais^{homeotérmicos2}. Assim, uma temperatura de 33 °C foi selecionada como proxy para o "fator de estilo de vida parasitário", enquanto uma temperatura de 25 °C (temperatura ambiente) representa o "fator não parasitário". A temperatura de 25 °C foi escolhida por ser representativa da temperatura média anual registrada no Brasil (Instituto Nacional de Meteorologia, INMET). Adicionalmente, dois tipos de substratos cárneos foram considerados, ambos de origem bovina: (i) carne fresca suplementada com sangue, mimetizando o substrato para o estilo de vida parasitário, que é utilizado para criar a mosca-varejeira parasita Co. hominivorax em condições de laboratório³⁶, e (ii) carne podre de 5 dias de idade, emulando o substrato para o estilo de vida necrófago. O substrato bovino é comumente utilizado para criar L. cuprina em condições de laboratório^27,37,38,39 por oferecer diversas vantagens em termos de disponibilidade, custo-benefício e praticidade^, além de ser um substrato ecologicamente justificável. Outros estudos^40,41 comparando o efeito de substratos podres versus frescos em moscas-varejeiras utilizaram substrato podre com 7 dias de idade (em condições anaeróbias) e mostraram um efeito adverso do substrato podre sobre as taxas de desenvolvimento^, sobrevivência e crescimento. Como L. cuprina é conhecida por colonizar cadáveres frescos que geralmente são expostos ao ar, resolvemos usar carne podre de 5 dias de idade (carne moída) em vasos não herméticos (decomposição aeróbia e anaeróbia) para mimetizar um substrato necrófago.

Os desenhos experimentais aqui apresentados oferecem a vantagem de discernir preferências por fatores individuais, bem como seus efeitos combinados. Além disso, os fenótipos pontuados, a saber, a escolha do substrato alimentar larval e o número de ovos colocados, são diretamente relevantes para os aspectos biológicos e ecológicos das espécies de moscas-varejeiras. A adequação desses protocolos é destacada pela demonstração de sua eficácia em L. cuprina. Adicionalmente, é fornecido um roteiro de análise estatística, que pode ser utilizado para comparar os resultados observados obtidos em L. cuprina com dados aleatórios simulados, garantindo análises e interpretações estatísticas robustas.

Protocolo

As amostras de moscas foram obtidas utilizando-se armadilhas e não em animais infestados. Uma licença SISBIO (67867-1) foi emitida para coletar e manter moscas da família Calliphoridae em cativeiro em condições de laboratório. Amostras de insetos são isentas de avaliação ética em pesquisas no Brasil. Carne e sangue bovinos foram obtidos comercialmente, e nenhuma autorização ética foi necessária.

1. Preferência alimentar das larvas

1. Preparo das placas de Petri contendo ágar 2%
   1. Prepare quatro pratos de Petri com 2% de ágar. Para isso, adicione 6 g de ágar bacteriológico a 300 mL de água e derreta essa mistura no micro-ondas. Em seguida, divida o volume uniformemente em quatro placas de Petri de vidro (150 x 20 mm), utilizando cerca de 70 mL em cada placa.
      OBS: Preparar placas de Petri igual ao número de repetições experimentais desejadas. Neste estudo, foram utilizadas 36 repetições.
   2. Uma vez solidificado o ágar, utilizar um tubo cônico de 50 mL (3 cm de diâmetro) para perfurar quatro orifícios no ágar, dois de cada lado da placa de Petri, seguindo o padrão de corte fornecido (Figura 1).
      NOTA: Esta configuração é semelhante aos protocolos descritos anteriormente por Fouche et al (2021)⁴⁰ e Boulay et al (2016)⁴².
2. Preparo de substratos
   1. Para preparar a carne fresca com sangue, adicione 12 ml de sangue bovino diluído a 200 g de carne fresca moída de bovino. Homogeneizar. Certifique-se de usar cilindros e colheres graduadas diferentes para cada tipo de carne para evitar a contaminação cruzada entre substratos.
      NOTA: O sangue diluído é composto por 50% de sangue puro misturado com um anticoagulante (3,8% de citrato de sódio) e 50% de água filtrada.
   2. Para preparar o substrato podre, adicione 12 mL de água filtrada a 200 g de carne bovina moída podre de 5 dias e misture bem.
      OBS: A carne podre foi obtida incubando-se a carne moída fresca por cinco dias a 25 °C em potes plásticos não herméticos (mistura de decomposição aeróbia e não aeróbia). Cada pote continha 200 g de carne moída fresca. Em seguida, foi congelado até o uso.
   3. Preencha dois buracos em cada placa de Petri com a mistura de carne fresca e sangue e os dois buracos restantes com a mistura de carne podre e água.
      OBS: Para evitar vieses de posição, varie a colocação dos diferentes tipos de carne nas placas de Petri. Por exemplo, algumas placas de Petri devem ter o mesmo tipo de carne voltada uma para a outra, enquanto em outros pratos, o tipo de carne deve ser cruzado, como mostra a Figura 2.
3. Arranjo experimental
   1. A uma temperatura ambiente (TR) de 25 °C, posicione a almofada de aquecimento diretamente abaixo de uma fonte de luz para iluminar uniformemente a área experimental e evitar qualquer viés de comportamento em direção ou contra a luz. Coloque almofadas de cartão ao redor da almofada de aquecimento para garantir que a configuração experimental permaneça nivelada.
      NOTA: A fonte de luz utilizada foi a luz branca de baixa emissão de aquecimento, como um tubo de néon. A almofada térmica foi posicionada sobre uma mesa logo abaixo das lâmpadas de teto (Figura 3).
   2. Cubra a almofada de aquecimento e as almofadas de cartão niveladoras com cartão preto e ligue a almofada de aquecimento.
      NOTA: A capa de papelão preta deve ser usada para evitar sinais visuais que possam enviesar o ensaio de comportamento.
   3. Coloque seis placas de Petri com ágar e substrato de carne sobre o papelão preto com dois substratos, um de cada tipo, sobre a almofada de aquecimento e os outros dois fora da superfície da almofada de aquecimento (Figura 2). Deixe os substratos aquecerem por aproximadamente 10 min.
      NOTA: Pode formar-se condensação na tampa das placas de Petri.
4. Teste larval
   1. Verifique a temperatura dos substratos (lado frio: 25 ± 2 °C; lado quente: 33 ± 2 °C) com um termômetro infravermelho.
      NOTA: A almofada de aquecimento permanece ligada durante toda a duração do experimento. As medições de temperatura foram realizadas no início e no final do experimento. Embora a temperatura tenha flutuado em ± 2 °C, ainda havia pelo menos uma diferença de temperatura de 8 °C entre as condições quente e fria.
   2. Após atingir a temperatura desejada, colocar cinco larvas de terceiro ínstar no centro de cada placa de Petri com uma pinça (Figura 2) e cobrir as placas de Petri com as tampas. Deixe o experimento de escolha durar 10 min.
      NOTA: Algumas larvas podem rastejar ao redor das bordas e na tampa das placas de Petri. Se alguma larva escapar, use uma pinça para colocá-la de volta ao centro da placa de Petri.
   3. Após 10 min, retire todas as placas de Petri da almofada de aquecimento e coloque-as em uma superfície diferente para evitar continuar aquecendo os substratos. Em seguida, conte o número de larvas em cada substrato, bem como aquelas que não escolheram nenhum substrato.
      OBS: Larvas de Lucilia cuprina permanecem no substrato escolhido, como observado neste experimento.

2. Preferência do local de oviposição das fêmeas

1. Arranjo experimental
   1. Use uma prateleira comum previamente coberta com papelão preto e uniformemente iluminada com tiras de luz LED brancas.
      NOTA: As capas de papelão pretas devem ser usadas para evitar sinais visuais que possam enviesar o ensaio de comportamento. As tiras de LED brancas são fixadas longitudinalmente no meio da prateleira logo acima do experimento. As prateleiras utilizadas na montagem foram colocadas a 45 cm de distância.
   2. Em RT (25 °C), coloque uma almofada de aquecimento no centro da prateleira. Use almofadas de papelão ao redor da almofada de aquecimento como suporte para garantir que a configuração experimental seja nivelada.
   3. Cubra a almofada de aquecimento e as almofadas de cartão niveladoras com um cartão preto para manter o mesmo padrão visual abaixo de todos os substratos.
   4. Coloque dois recipientes de vidro em forma de cruz em uma prateleira, cada um deve ter dois braços sobre o papelão preto e a almofada de aquecimento. Ligue as tiras de luz LED brancas e as almofadas de aquecimento antes do início do experimento.
   5. Use etanol 70% para limpar as cruzes (dentro da cruz e da tampa) para evitar a contaminação do odor.
2. Preparo de substratos
   1. Prepare quatro placas de Petri (60 mm x 15 mm) por cruz com 5 g de carne podre ou fresca de 5 dias (duas de cada tipo de substrato).
      OBS: Preparar placas de Petri igual ao número de repetições experimentais desejadas vezes quatro. Neste estudo foram utilizadas 30 repetições, totalizando 120 placas de Petri preparadas.
   2. Adicionar 1 ml de sangue bovino diluído (50% de sangue puro com anticoagulante e 50% de água filtrada) à carne fresca e 1 ml de água filtrada à carne podre. Misture bem a carne (fresca ou podre) com o líquido (sangue ou água) usando uma colher diferente para cada tipo de carne.
      NOTA: O preparo da carne para o ensaio de fêmeas é muito semelhante ao ensaio de larvas, embora as quantidades sejam diferentes, pois o teste de fêmeas será executado por mais tempo do que o teste de larvas. Lembre-se de usar pontas e colheres de pipeta diferentes para cada tipo de carne para evitar qualquer contaminação cruzada de odor entre os substratos.
   3. Verifique se o álcool evaporou completamente das cruzes. Em seguida, coloque quatro placas de Petri (uma de cada tipo de carne na almofada de aquecimento e as outras duas fora da superfície da almofada de aquecimento) na extremidade de cada braço da cruz (Figura 4). Feche as cruzes com suas tampas e deixe os substratos aquecerem por aproximadamente 10 min.
      OBS: Além disso, para evitar vieses de posicionamento, varie a colocação dos diferentes tipos de carne nos cruzamentos. Por exemplo, algumas cruzes devem ter o mesmo tipo de carne nos braços adjacentes, enquanto em outras cruzes, o mesmo tipo de carne deve estar em frente um do outro, como mostrado na Figura 4.
3. Teste feminino
   1. Coletar fêmeas grávidas na gaiola de mosca e isolá-las em tubos individuais.
      NOTA: As fêmeas grávidas são caracterizadas por terem um abdome aumentado e amarelo-esbranquiçado em contraste com as fêmeas não grávidas (Figura 5). Fêmeas grávidas foram coletadas entre 10 e 16 dias após a emergência para os experimentos.
   2. Verifique a temperatura dos substratos nas cruzes (lado frio: 25 ± 2 °C; lado quente: 33 ± 2 °C) usando um termômetro infravermelho.
      NOTA: Assim como no teste larval, a almofada de aquecimento permanece ligada durante toda a duração do experimento. As medidas de temperatura foram realizadas no início e no final do experimento. Embora a temperatura tenha flutuado em ± 2 °C, ainda havia pelo menos uma diferença de temperatura de 8 °C entre as condições quente e fria.
   3. Coloque o tubo de cabeça para baixo contendo uma fêmea grávida na abertura no centro de cada cruz. Depois que a fêmea entrar na cruz, retire o tubo e feche a abertura com sua pequena tampa. Após fechar todas as cruzes, coloque um papelão preto na frente da prateleira para fechar o arranjo experimental. Deixe o experimento durar 4 h.
   4. Depois disso, retire a fêmea, pegando-a cuidadosamente com um tubo, e verifique se havia ovos nos substratos.
   5. Identifique a tampa de cada placa de Petri com o tipo de substrato de cada cruz. Use etanol 70% para limpar as cruzes (dentro da cruz e da tampa) de qualquer odor do teste.
      NOTA: Caso os ovos não possam ser contados logo após o experimento, as placas de Petri com substratos podem ser armazenadas a -20 °C.
4. Contagem de ovos
   OBS: Se os substratos das placas de Petri foram congelados, descongele-os antes da contagem.
   1. Use um estereomicroscópio para contar o número de ovos postos em cada substrato. Use uma escova e água para ajudar a separar os ovos para contá-los.

3. Análise de dados e estatística

1. Cálculo de índices de preferência
   1. Para cada repetição de testes de larvas (n = 36) e fêmeas (n = 30), calcule o Índice de Preferência para carne (designada como_carne PI) determinando a razão entre larvas ou ovos presentes nos substratos frescos (quente fresco e frio fresco) e a contagem total de larvas ou ovos em todos os substratos (quente fresco + frio fresco + quente podre + frio podre).
      PI_carne = (# larvas ou ovos em substratos frescos) / # Total de larvas ou ovos
      NOTA: Os termos "Quente" e "Frio" são indicativos de condições de temperatura de 33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C, respectivamente.
   2. Da mesma forma, calcule o Índice de Preferência por temperatura (PI_temp) para cada repetição de testes de larvas e fêmeas como o número de larvas ou ovos presentes nos substratos quentes (quente fresco e quente podre) dividido pelo número total de larvas ou ovos em todos os substratos (quente fresco + frio fresco + quente podre + frio podre).
      PI_temp = (# larvas ou ovos em substratos quentes) / # Total de larvas ou ovos
      NOTA: Valores próximos de 1 refletem uma preferência por substratos frescos ou quentes e valores próximos a zero indicam uma preferência por substratos podres ou frios. Os PIs podem ser calculados manualmente ou usando o código fornecido (Arquivos suplementares S1 e Arquivos suplementares S2).
2. Comparação da preferência observada com dados aleatórios simulados
   1. Execute o código fornecido (Arquivo Suplementar S1 e Arquivo Suplementar S1) para gerar os dados simulados e compará-los com os dados observados.
      NOTA: Este código gera 1000 dados aleatórios simulados para larvas e fêmeas e calcula os Índices de Preferência (PIs) para cada réplica do simulado, e os dados observados de L. cuprina. As simulações partem do princípio de que tanto larvas quanto fêmeas não apresentam preferência por substrato e fazem escolhas aleatórias. As simulações incorporam aspectos comportamentais chave dos animais, englobando vários cenários, tais como: a probabilidade de as larvas não selecionarem nenhum substrato, e as fêmeas adultas concentrarem sua postura de ovos em um único substrato ou distribuírem seus ovos uniformemente ou não entre diferentes substratos. Modelos lineares generalizados (GLM, família: quasibinomial; link: logit) foram utilizados para comparar os dados observados nos ensaios de comportamento com os dados aleatórios simulados. O GLM empregado mostrou-se adequado para esta análise devido à natureza limitada do Índice de Preferência (IP), variando entre 0 e 1. GLMs são hábeis em lidar com variáveis de resposta não normalmente distribuídas e permitem comparações estatísticas robustas. Essa escolha facilitou insights significativos, permitindo comparar efetivamente dados observados de ensaios de comportamento com padrões complexos gerados por dados aleatórios simulados. Pequenos ajustes no código podem ser necessários para outros conjuntos de dados estruturados.

Resultados

Para demonstrar a eficácia dos métodos apresentados, os experimentos foram conduzidos utilizando uma população de laboratório de Lucilia cuprina (família: Calliphoridae), uma mosca-varejeira parasita facultativa². Todo o conjunto de dados brutos obtidos para esta espécie pode ser encontrado no Arquivo Suplementar S3 com os resultados para os testes de preferência larval e fêmea de substrato. Para avaliar se as larvas e fêmeas apresentam preferência por algum su...

Discussão

A compreensão da evolução dos hábitos alimentares, particularmente no contexto do parasitismo em moscas-varejeiras, requer o exame das preferências de substrato ao longo de diferentes fases da vida para alimentação ou oviposição. Portanto, neste estudo, métodos robustos e diretos foram propostos para investigar preferências de substrato em larvas e fêmeas de moscas-varejeiras. Esses métodos foram testados em Lucilia cuprina, uma mosca varejeira parasita facultativa². Curiosam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	-	-	70x50 cm
Bovine blood with anticoagulat	-	-	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	-	-	Around 7-8% of fat
Brush	-	-	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	-	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	-	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	-	30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150x20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60x15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	-	-	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	-	-	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	-	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	-	WF10X/22 lenses
Tweezer	-	-	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)