生活史選択の探索:温度と基質の種類をフバエの幼虫と雌の嗜好の相互作用因子として用いる

要約

本明細書では、フクロバエの幼虫および雌の食物源および産卵嗜好を評価するための2つのプロトコルが詳述されている。これらは、基板の種類と温度という2つの相互作用する要因を持つ4つの選択肢で構成されています。このアッセイにより、幼虫の食物源の好みと雌の産卵部位の好みを決定することができます。

要約

フクロバエ(双翅目:Calliphoridae)は、通常、偏性寄生、通性寄生、および完全な屍姦に分類される、幅広い幼虫のライフスタイルを示します。いくつかの寄生種は、義務性および通性の両方で、幼虫がミイアシス(生きた組織へのウジの蔓延)を引き起こす可能性があるため、衛生的および経済的に重要であると考えられています。しかし、産卵部位の選択には成虫の雌が決定的な役割を果たしており、幼虫の食性や発育状況を大きく左右していることは注目に値する。この研究では、幼虫の摂食嗜好と雌の産卵部位の嗜好をテストするために、2つのプロトコルが提案されています 肉の基質の種類と温度の2つの相互作用要因を考慮します。ここで紹介するセットアップでは、2つの温度(33±2°Cと25±2°C)と2種類の肉基質(新鮮な肉に血液と5日齢の腐った肉)の4つの選択肢アッセイで、 Lucilia cuprina の幼虫と妊娠した雌を試験することができました。幼虫または妊娠中の雌は、25°Cの腐った肉(屍食性種の状態をシミュレート)、33°Cで血液を補給した新鮮な肉(寄生種の状態をシミュレート)、および2つの対照、33°Cの腐った肉、または25°Cの血液を補給した新鮮な肉のいずれかで、それぞれ穴を掘るか産卵するかを選択できます。 選好は、各反復の各オプションに産み付けられた幼虫または卵の数をカウントすることによって評価されます。観察された結果をランダム分布と比較することで、選好の統計的有意性を推定することができました。その結果、 L. cuprina の幼虫は25°Cで腐った基質を強く好むことが示された。 逆に、雌の産卵部位の嗜好は肉の種類によってより多様であった。この方法論は、同様のサイズの他の昆虫種の好みをテストするために適応させることができます。他の質問は、代替条件を使用して調べることもできます。

概要

ハエ、特に萼類のムコイド(フクロバエ、イエバエ、ヒツジバエ、肉バエなど)は、寄生行動や死死仙食行動など、幅広い生活様式^{を示す1。}寄生種は通常、ウジ虫(幼虫)による生きた組織の蔓延であるミイアシスを引き起こします²。Calliphoridae科では、ウジ虫の蔓延による経済的損失と動物福祉の悪さの原因となる主要な家畜害虫です2,3,4,5,6,7。新世界と旧世界のスクリューワーム(それぞれCochliomyia hominivoraxとChrysomyia bezziana)などの偏性寄生虫は、ヒツジのフクロバエ(Lucilia cuprinaとLucilia sericata)などの通性寄生虫とともに特に問題があります4,7,8,9,102,5,6^。7.屍食性を含む非寄生種は、腐敗や壊死した有機物で発生し、不衛生な環境でよく見られます。彼らの厳密に非寄生的なライフスタイルは、ハエの幼虫を使用して壊死組織の傷をきれいにするウジ虫療法にうまく使用できます^11,12,13。フクロバエは、最近死亡した遺体を見つけてコロニーを形成した最初の生物の1つであり、発育中の幼虫が死亡時刻を推定する手段として機能するため、法医学でも使用されています¹⁴。

ブローフライのライフスタイルは、人間の利益に関連して重要であるため、さまざまな調査研究の対象となっています(例:¹⁵、16、¹⁷、¹⁸、^19、20、21)。種のライフスタイルを支配する生物学的メカニズムを理解することは、害虫種の防除を目的とした方法を改善するための貴重な洞察を提供することができます。さらに、コガネムシのライフスタイルの多様性と進化は、複雑な形質(寄生など)の起源とメカニズムを研究するための理想的な状況を提供します。生きた組織を餌とするウジ虫による寄生は、Calliphoridae科内で数回独立して進化してきた^22,23。しかし、フクロバエの食性の進化史はまだほとんど知られておらず、研究は機能アッセイの助けを借りずに系統発生に沿って習性をマッピングすることに限定されています(例:^16,19,22)。例えば、義務性寄生虫がジェネラリスト(通性寄生虫)から進化したのか、それとも屍食性種から直接進化したのかは不明である。ライフスタイルの進化的変化に伴う分子的、生理学的、行動学的プロセスもほとんどわかっていません。

これに関連して、ヒツジのフクロバエLucilia cuprinaなどの通性寄生虫は、宿主の寄生虫として、または死体の屍姦虫として発生する可能性があり、ライフスタイルの選択を制御する要因とメカニズムを調査する可能性を提供します。Lucilia cuprinaは、特に害虫と見なされているオーストラリアで、羊のハエの攻撃を引き起こすことで知られるコスモポリタン種です^3,16。L. cuprinaによるミヤ症は、他の家畜、ペット、および人間にも発生する可能性があります3,24,25,26,27,28,29,30。しかし、その幼虫は壊死組織や腐敗物質でも発生する可能性があり、この種は死体を見つけてコロニーを形成するのが非常に速いため、法医昆虫学で成功裏に使用されています31,32,33,34。フクロバエの寄生性と非寄生性のライフスタイルは幼虫期によって定義されますが、産卵部位を選択するのは成虫の雌です。その結果、成虫の雌は幼虫の行動が制限されているため、幼虫のライフスタイルに大きな影響を与えます。しかし、雌の選択は、幼虫が選択肢を提示されたときに同じ基質を好むことを必ずしも意味するものではない³⁵。1つの仮説は、雌が生きた組織に卵を産むことにつながる行動の変化は、寄生的な生活様式への初期の切り替えの一部であった可能性があるというものです。得られた幼虫の事前適応または生理学的能力は、生きた組織上での発達の成功に不可欠であり、寄生生活様式の出現につながった。そのため、影響を受けるプロセスと選択されるプロセスは、必ずしも両方のライフステージ間で一致するとは限りません。

これに関連して、フクロバエ、特にL. cuprinaの幼虫の摂食基質(幼虫選好アッセイ)と産卵部位(雌の選好アッセイ)に関する行動嗜好をテストするために、2つの方法が開発されました。これらの方法では、温度と肉の鮮度という2つの相互作用する要因が考慮されます。筋虫症のほとんどの症例は恒^温動物で発生するため、温度が重要な要素として選択されました2。したがって、33°Cの温度が「寄生生活因子」の代理として選択され、25°C(室温)の温度が「非寄生因子」を表します。25°Cは、ブラジルで記録された年間平均気温を表すため、選択されました(国立気象研究所、INMET)。さらに、2種類の肉基質が検討されたが、いずれもウシ由来である:(i)寄生性生活様式の基質を模倣した血液を添加した生肉(寄生性フクロバエ社ヒトボラックスを実験室条件³⁶で飼育するために使用される)、および(ii)屍食生活様式の基質を模倣した5日齢の腐肉。ウシ基質は、生態学的に正当化可能な基質であると同時に、入手可能性、費用対効果、および実用性の点でいくつかの利点を提供するため、実験室条件27,37,38,39でL.cuprinaを飼育するために一般的に使用されます。フクロバエの腐った基質と新鮮な基質の影響を比較した他の研究^40,41では、7日齢の腐った基質(嫌気性条件)を使用し、腐った基質が発生速度、生存率、および成長に悪影響を与えることを示しました。 L. cuprinaは、通常空気にさらされる新鮮な死体にコロニーを形成することが知られているため、私たちは、5日齢の腐った肉(牛ひき肉)を非密閉性の鍋(好気性および嫌気性分解)で使用し、屍食性の基質を模倣することにしました。

ここで紹介する実験計画は、個々の因子とその複合効果に対する選好を見分けるという利点があります。さらに、スコアリングされた表現型、すなわち幼虫の摂食基質の選択と産卵数は、フクロバエ種の生物学的および生態学的側面に直接関連しています。これらのプロトコルの適合性は、 L. cuprinaにおける有効性を実証することによって強調されています。さらに、 L. cuprina で得られた観察結果をシミュレートされたランダムデータと比較するために使用できる統計分析用のスクリプトが提供されており、堅牢な統計分析と解釈を保証します。

プロトコル

ハエのサンプルは、感染した動物ではなく、トラップを使用して取得しました。SISBIOライセンス(67867-1)が発行され、Calliphoridae科のハエを収集し、実験室条件で飼育しました。昆虫のサンプルは、ブラジルでの研究における倫理的評価を免除されています。ウシの肉と血液は商業的に入手され、倫理的クリアランスは必要ありませんでした。

1.幼虫の摂食の好み

1. 寒天2%を含有するシャーレの調製
   1. 2%寒天で4つのペトリ皿を準備します。これを行うには、300mLの水に6gの細菌寒天を加え、この混合物を電子レンジで溶かします。次に、容量を4つのガラスシャーレ(150 x 20 mm)に均等に分割し、各シャーレに約70 mLを使用します。
      注:必要な実験回数に等しいペトリ皿を準備します。この研究では、36回の繰り返しが使用されました。
   2. 寒天が固まったら、50 mLの円錐形チューブ(直径3 cm)を使用して、所定の切断パターンに従って、寒天にペトリ皿の両側に2つずつ、合計4つの穴を開けます(図1)。
      注:このセットアップは、Fouche et al. (2021)⁴⁰ および Boulay et al. (2016)⁴² によって以前に記述されたプロトコルと同様です。
2. 基材の調製
   1. 新鮮な肉を血液で調製するには、200 gの新鮮な牛ひき肉に12 mLの希釈した牛の血液を加えます。よく混ぜます。基材間の相互汚染を避けるために、肉の種類ごとに異なるメスシリンダーとスプーンを使用してください。
      注:希釈された血液は、抗凝固剤(3.8%クエン酸ナトリウム)と50%ろ過水と混合された50%の純血で構成されています。
   2. 腐った基質を準備するには、12 mLのろ過水を5日齢の腐った牛ひき肉200 gに加え、よく混ぜます。
      注:腐った肉は、新鮮なひき肉を非密閉プラスチックポット(好気性分解と非好気性分解の混合物)で25°Cで5日間インキュベートすることによって得られました。各鍋には200gの新鮮なひき肉が入っていました。その後、使用するまで冷凍しました。
   3. 各ペトリ皿の2つの穴を新鮮な肉と血液の混合物で満たし、残りの2つの穴を腐った肉と水の混合物で埋めます。
      注:位置の偏りを避けるために、ペトリ皿の肉の種類ごとに配置を変えてください。たとえば、 図2に示すように、ペトリ皿の中には同じ種類の肉を向かい合わせにする必要がありますが、他の皿では肉の種類を交差させる必要があります。
3. 実験装置
   1. 室温(RT)が25°Cの場合、加熱パッドを光源の真下に置いて、実験エリアを均一に照らし、光に向かおうと光に逆らう動作の偏りを回避します。加熱パッドの周囲に板紙パッドを置き、実験装置が水平に保たれるようにします。
      注:使用した光源は、ネオン管などの白色低発熱発光光でした。温熱パッドは、天井の電球のすぐ下のテーブルの上に置かれました(図3)。
   2. 加熱パッドとレベリング板紙パッドを黒い段ボールで覆い、加熱パッドのスイッチを入れます。
      注:黒い段ボールカバーは、行動アッセイに偏りを与える可能性のある視覚的な手がかりを避けるために使用する必要があります。
   3. 寒天と肉の基質が入った6つのシャーレを黒い段ボールの上に置き、各タイプの2つの基材を加熱パッドの上に置き、他の2つを加熱パッドの表面から離します(図2)。基板を約10分間加熱します。
      注意: ペトリ皿の蓋に結露が発生する場合があります。
4. 幼虫試験
   1. 基板の温度(低温側:25±2°C、高温側:33±2°C)を赤外線温度計で確認します。
      注:加熱パッドは、実験の全長中、オンのままです。温度測定は、実験の開始時と終了時に行われました。気温は2°C±変動しましたが、それでも暑い状態と寒い状態の間には少なくとも8°Cの温度差がありました。
   2. 希望の温度に達したら、ピンセットを使用して各シャーレの中央に5匹の3齢幼虫を配置し(図2)、シャーレを蓋で覆います。選択実験を 10 分間実行します。
      注:一部の幼虫は、ペトリ皿の端や蓋の上を這うことがあります。幼虫が逃げた場合は、ピンセットを使用してペトリ皿の中央に戻します。
   3. 10分後、すべてのペトリ皿を加熱パッドから外し、基板を加熱し続けないように別の表面に置きます。次に、各基質の幼虫の数と、基質を選択しなかった幼虫の数を数えます。
      注: Lucilia cuprina の幼虫は、この実験で観察されたように、選択した基質にとどまります。

2.女性の産卵部位の好み

1. 実験装置
   1. 以前に黒い段ボールで覆われ、白色LEDライトストリップで均一に照らされた通常の棚を使用してください。
      注:黒い段ボールカバーは、行動アッセイに偏りを与える可能性のある視覚的な手がかりを避けるために使用する必要があります。白色LEDストリップは、実験のすぐ上の棚の真ん中に縦に固定されています。セットアップに使用した棚は45cm離して配置されました。
   2. 室温(25°C)で、棚の中央に加熱パッドを置きます。加熱パッドの周りの板紙パッドをサポートとして使用して、実験セットアップが水平になっていることを確認します。
   3. 加熱パッドとレベリング板紙パッドを黒い段ボールで覆い、すべての基材の下に同じ視覚パターンを保ちます。
   4. 1つの棚に2つの十字型のガラス容器を置き、それぞれに黒い段ボールと加熱パッドの上に2本のアームが必要です。実験開始前に、白色LEDライトストリップと加熱パッドのスイッチを入れてください。
   5. 70%エタノールを使用して十字架(十字架と蓋の内側)を清掃し、臭いの汚染を防ぎます。
2. 基材の調製
   1. 5日齢の腐った肉または新鮮な肉5g(各タイプの基質に2つ)を入れたクロスごとに4つのシャーレ(60 mm x 15 mm)を準備します。
      注:ペトリ皿は、実験の反復回数に4倍の回数を合わせた量に等しくなります。この研究では、30回の繰り返しが使用され、合計120枚のペトリ皿が準備されました。
   2. 新鮮な肉に1mLの希釈した牛の血液(抗凝固剤と50%ろ過水を含む50%の純血)を加え、腐った肉に1mLのろ過水を加えます。肉の種類ごとに異なるスプーンを使用して、肉(新鮮または腐った)と液体(血液または水)を完全に混合します。
      注:雌のアッセイのための肉の調製は幼虫のアッセイと非常によく似ていますが、雌の試験は幼虫の試験よりも長く実行されるため、量は異なります。肉の種類ごとに異なるピペットチップとスプーンを使用して、基材間の臭いの相互汚染を防ぐことを忘れないでください。
   3. アルコールが十字架から完全に蒸発したかどうかを確認します。次に、十字架の各腕の先端に4つのシャーレ(各種類の肉を加熱パッドに1つ、加熱パッドの表面から他の2つ)を置きます(図4)。蓋で十字架を閉じ、基板を約10分間加熱します。
      注:さらに、位置の偏りを避けるために、クロスのさまざまな肉の種類の配置を変えてください。例えば、 図 4 に示すように、ある交配種では、隣接する腕に同じ種類の肉が描かれている必要がありますが、他の交配種では、同じ種類の肉が互いに向かい合っている必要があります。
3. 女性テスト
   1. ハエのケージに妊娠中の雌を集め、個々のチューブに隔離します。
      注:妊娠中の女性は、妊娠していない女性とは対照的に、肥大した白っぽい黄色の腹部を持っていることを特徴としています(図5)。妊娠中の雌は、実験のために羽化後10〜16日の間に収集されました。
   2. 赤外線温度計を使用して、クロス内の基板の温度(低温側:25±2°C、高温側:33±2°C)を確認します。
      注:幼虫試験と同様に、加熱パッドは実験の全長にわたってオンのままです。温度測定は、実験の開始時と終了時に行われました。気温は2°C±変動しましたが、それでも暑い状態と寒い状態の間には少なくとも8°Cの温度差がありました。
   3. 各十字架の中央の開口部に1匹の妊娠中の女性を含むチューブを逆さまに置きます。女性が十字架に入ったら、チューブを取り外し、小さな蓋で開口部を閉じます。すべての十字架を閉じた後、棚の前面に黒い段ボールを置き、実験セットアップを囲みます。実験を4時間実行します。
   4. その後、メスをチューブで慎重にキャッチして取り出し、基板に卵がないか確認します。
   5. 各ペトリ皿の蓋を、各クロスから基板タイプで識別します。70%エタノールを使用して、テストからの臭いから十字架(十字架と蓋の内側)をきれいにします。
      注:実験直後に卵を数えることができない場合は、基質の入ったペトリ皿を-20°Cで保存することができます。
4. 卵の数
   注:ペトリ皿の基質が凍結している場合は、カウントする前に解凍してください。
   1. 実体顕微鏡を使用して、各基質に産卵された卵の数を数えます。ブラシと水を使用して卵を分離し、卵を数えます。

3. データ分析と統計

1. 選好指数の計算
   1. 幼虫(n = 36)および雌(n = 30)のテストの繰り返しごとに、すべての基質(新鮮で暑い+新鮮な寒さ+腐った熱い+腐った冷たい)の幼虫または卵の合計数に対する新鮮な基質(新鮮なホットおよびフレッシュコールド)に存在する幼虫または卵の比率を決定することにより、肉(PI_肉として指定)の選好指数を計算します。
      PI_肉 =(#新鮮な基質上の幼虫または卵)/#幼虫または卵の総数
      注意: 「ホット」と「コールド」という用語は、それぞれ33±2°Cおよび25±2°Cの温度条件を示します。
   2. 同様に、幼虫と雌のテストの各反復の温度の選好指数(PI_temp)を、高温基質に存在する幼虫または卵の数(新鮮、高温、腐った高温)を、すべての基質上の幼虫または卵の総数(新鮮、高温、新鮮、低温+腐った高温、腐った低温)で割ったものとして計算します。
      PI_temp = (# 高温基板上の幼虫または卵) / # 幼虫または卵の総数
      注:1に近い値は、フレッシュまたはホットの基材の好みを反映し、ゼロに近い値は、腐ったまたは冷たい基材の好みを示します。PIは、手動で計算することも、提供されたコード(補足ファイルS1および補足ファイルS2)を使用して計算することもできます。
2. 観測された選好とシミュレートされたランダムデータとの比較
   1. 提供されたコード(補足ファイルS1および補足ファイルS1)を実行してシミュレーションデータを生成し、観測データと比較します。
      注:このコードは、幼虫と雌の1000のシミュレートされたランダムデータセットを生成し、シミュレートされた各複製の選好指数(PI)と L.cuprinaの観察データを計算します。シミュレーションでは、幼虫と雌の両方が基質の選好を示さず、ランダムな選択を行うと仮定しています。シミュレーションには、幼虫が基質を選択しない確率、成虫の雌が単一の基質に産卵を集中させる確率、または異なる基質に卵を均一に分配する確率など、さまざまなシナリオを含む動物の重要な行動的側面が組み込まれています。一般化線形モデル(GLM、ファミリー:準二項式、リンク:ロジット)を使用して、挙動アッセイから観察されたデータとシミュレートされたランダムデータを比較しました。採用されたGLMは、選好指数(PI)が0から1の範囲で有界であるため、この分析に適していました。GLMは、非正規分布の応答変数の処理に長けており、ロバストな統計的比較を可能にします。この選択により、行動アッセイから観察されたデータと、シミュレートされたランダムデータによって生成された複雑なパターンを効果的に比較できるようになり、有意義な洞察が促進されました。他の構造化データセットでは、コードの微調整が必要になる場合があります。

結果

提示された方法の有効性を実証するために、実験は、通性寄生性^フガンバエであるLucilia cuprina(科:Calliphoridae)の実験室集団を用いて行われました2。本種について得られた生データセット全体は、幼虫および雌の基質選好性試験の結果とともに補足ファイルS3にあります。幼虫と雌が何らかの基質を好むかどうかを評価するために、観察されたデータを、そ?...

ディスカッション

特にフクロバエの寄生の文脈における食性の進化を理解するには、摂食や産卵のさまざまなライフステージにわたる基質の好みを調べる必要があります。そこで、本研究では、フクロバエの幼虫や雌の基質選好性を調べるための頑健で簡便な手法を提案した。これらの方法は、通性寄生性フ^{ガンガンである}Lucilia cuprinaでテストされました2。興味深いことに、この実験...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	-	-	70x50 cm
Bovine blood with anticoagulat	-	-	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	-	-	Around 7-8% of fat
Brush	-	-	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	-	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48x48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	-	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	-	30x40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150x20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60x15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	-	-	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	-	-	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	-	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	-	WF10X/22 lenses
Tweezer	-	-	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2x0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)