הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואקסוציטוזה בזרע עכבר חי

Summary

מודל העכבר AcroSensE ושיטות הדמיה של תאים חיים המתוארים כאן מספקים גישה חדשה לחקר דינמיקת הסידן בתא התת-תאי של אקרוזום הזרע וכיצד הם מווסתים שלבי ביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.

Abstract

אקסוציטוזה אקרוזום (AE), שבה השלפוחית האקזוציטוטית היחידה של הזרע מתמזגת עם קרום הפלזמה, היא תהליך מורכב ותלוי סידן החיוני להפריה. עם זאת, ההבנה שלנו לגבי האופן שבו איתות סידן מווסת AE עדיין אינה שלמה. בפרט, יחסי הגומלין בין דינמיקת הסידן התוך-אקרוזומלית לבין שלבי הביניים המובילים ל-AE אינם מוגדרים היטב. במאמר זה אנו מתארים שיטה המספקת תובנות מרחביות וזמניות על דינמיקת הסידן האקרוזומלית והקשר שלה לאיחוי קרום ולאקסוציטוזה שלאחר מכן של שלפוחית האקרוזומים. השיטה משתמשת בעכבר מהונדס חדשני המבטא חיישן ממוקד אקרוזום לאקסוציטוזה (AcroSensE). החיישן משלב מחוון סידן מקודד גנטית (GCaMP) המאוחה עם mCherry. חלבון היתוך זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר תצפית בו זמנית של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואירועי איחוי ממברנה. ניטור בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ו-AE בזרע חי של AcroSensE מושג באמצעות שילוב של הדמיה בקצב פריימים גבוה ומערכת העברת חומרים ממריצים שיכולה להתמקד בזרע יחיד. פרוטוקול זה מספק גם מספר דוגמאות לשיטות בסיסיות לכימות וניתוח הנתונים הגולמיים. מכיוון שמודל AcroSensE מקודד גנטית, ניתן להעצים את חשיבותו המדעית על ידי שימוש בכלים גנטיים זמינים, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או שיטות מבוססות עריכה גנטית (CRISPR). בעזרת אסטרטגיה זו, ניתן לפתור את תפקידיהם של מסלולי איתות נוספים בקיבול הזרע ובהפריה. לסיכום, השיטה המתוארת כאן מספקת כלי נוח ויעיל לחקר דינמיקת סידן בתא תת-תאי ספציפי - אקרוזום הזרע - וכיצד דינמיקות אלה מווסתות את שלבי הביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.

Introduction

הזרע רוכש את היכולת להפרות בתהליך שנקרא קיבול¹. נקודת קצה אחת של תהליך זה היא שהזרע רוכש את היכולת לעבור AE. יותר משני עשורים של נתונים תומכים בנוכחותו של מודל מורכב ורב-שלבי של AE בזרע יונקים (מסוכם^ב-2,3). עם זאת, חקר AE בזרע חי הוא מאתגר, והשיטות הזמינות כיום לניטור תהליך זה ברזולוציה נאותה הן מסורבלות ודורשות שלבי הכנה מרובים⁴, מוגבלות לזיהוי השלב הסופי של AE (למשל, באמצעות PNA⁵), מוגבלות למדידות של שינויים בסידן ציטוסולי (בניגוד לדינמיקה של סידן אקרוזומלי), או מוגבלים למדידות של דינמיקת סידן ציטוסולית או AE⁶.

כדי להתגבר על כמה מהמגבלות העיקריות של מחקרי AE בזמן אמת בתנאים פיזיולוגיים ולאפשר חקירה של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן ו- AE, נוצר מודל עכבר ייחודי. במודל עכבר זה, חלבון היתוך המורכב מחיישן Ca²⁺ המקודד גנטית (GCaMP3) ו-mCherry מבוטא וממוקד לאקרוזום באמצעות מקדם אקרוסין ופפטיד איתות². חיישן GCaMP3-mCherry כפול ממוקד מאפשר מדידות סימולטניות בזמן אמת של ריכוזי הסידן ומצב התוכן האקרוזומלי בזרע חי בתנאים פיזיולוגיים באמצעות מיקרוסקופיה ומערכת העברת ממריצים חד-תאית (איור 1). כמרכיב של המטריצה האקרוזומלית, איחוי הממברנה, ו- AE יגרום לאובדן פלואורסצנטיות mCherry שאינה רגישה לפוטו ול- pH מהזרע, מכיוון שחלבון זה מתפזר החוצה משלפוחית האקרוזומים. בהקשר זה, היכולת של המודל לשקף את העיתוי וההתרחשות של AE דומה ליתרונות של קו העכבר GFP ממוקד אקרוזום ^7,8,9.

גרסת GCaMP3 המשמשת בקו עכברים מהונדס זה היא בעלת KD משוער של 400 מיקרומטר וטווח דינמי עבור Ca²⁺ של 10-4-10-3 M¹⁰, המתאים לשלפוחית זו. הראינו כי שילוב תכונות זה של GCaMP3 יכול לחשוף היווצרות נקבוביות היתוך בין קרום הפלזמה לבין הממברנה האקרוזומלית החיצונית (OAM)². זיהוי נקבוביות האיחוי הוא תוצאה של גודל הנקבוביות קטן מכדי לאפשר לחלבון AcroSensE להתפזר החוצה מהאקרוזום (באמצעות אובדן תוכן אקרוזומים) תוך מתן "תערוץ" ממברנה המאפשר זרימה של יוני Ca²⁺ לתוך לומן האקרוזומים, מה שמוביל לעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3.

החלבון הפלואורסצנטי mCherry הבהיר, המונומרי והלא רגיש לסידן תומך בהדמיה של האקרום בזמן שהאות GCaMP3 חלש (למשל, לפני קשירת Ca²⁺ , איור 2), וחשוב מכך, הוא גם מאפשר זיהוי של תאי זרע שלמים אקרוזומים, המתאימים להדמיה.

הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש במודל העכבר הייחודי AcroSensE ואת שיטות המיקרוסקופ המשמשות באופן ניסיוני לחקר AE ודינמיקת סידן זרע ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו תחת ההנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קורנל (#2002-0095). עכברי AcroSensE^בני 8-10 שבועות 2 שימשו במחקר הנוכחי. בקשות למידע על זמינותם של עכברי AcroSensE ניתן להגיש למחבר המתאים.

1. איסוף זרע ושטיפתו

1. איסוף זרע קאודה אפידידימלי (פרטים נוספים על הליך זה מסופקים ב^-11) מעכברי AcroSensE. אפשר 15 דקות לשחה החוצה בצלחת תרבית רקמה של 3.5 ס"מ המכילה 0.5 מ"ל של מדיום וויטן שונה (MW) ב 37 ° C. צלחת צריך להיות מכוסה כדי להפחית אידוי של MW, ויש להטות כך המדיום יש מספיק עומק כדי לכסות את אפידידימידים cauda.
   הערה: המדיום של וויטן שונה (MW) כולל 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM חומצה פירובית, 4.8 mM חומצה לקטית hemi-Ca²⁺ מלח, pH 7.35. גלוקוז (5.5 מילימול), NaHCO₃ (10 מילימול) ו-2-הידרוקסיפרופיל - ציקלודקסטרין (CD; 3 מילימול) מתווספים (ראה טבלת חומרים) לפי הצורך להשראת קיבול, וניתן לשנות ריכוזים לניסויים ספציפיים. בנוסף, ניתן להשתמש במקבלי סטרולים חלופיים במקום CD (למשל, אלבומין בסרום בקר או ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה).
2. בעזרת מלקחיים עדינים, הסירו כל רקמה אפידידימלית מצלחת האיסוף שניתן לשחות החוצה. מעבירים את התווך המכיל את הזרע לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגו את המתלה ב 100 x גרם למשך דקה אחת ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפטה מפלסטיק, הסר את הסופרנאטנט MW המכיל את הזרע מכל פסולת רקמה גסה שתצטבר בשלב זה.
3. הביאו את הסופרנאטנט MW המכיל את הזרע לנפח כולל של 3 מ"ל על ידי הוספת MW ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 8 דקות (בטמפרטורת החדר) בצינור בעל תחתית עגולה. הסר לאט את supernatant של MW מן הזרע כדורי רופף.
4. אם הוא בר קיימא, הזרע צריך להופיע כגלולה "רכה" למראה. השהה מחדש בעדינות את הזרע באמצעות טריטורציה עם פיפטת העברה גדולה או באמצעות נקישות ידניות עדינות על הצינור ("הזזת אצבע"). לאחר השעייתם באופן שווה, העבירו אותם לצינור חדש בעל תחתית עגולה. השתמש 10-20 μL של תרחיף הזרע כדי לספור ולהעריך תנועתיות. לדלל זרע ב- MW לשימוש.
   הערה: ברוב הניסויים הכוללים קיבול זרע עכבר, נעשה שימוש בריכוז סופי של 5-10 מיליון זרע/מ"ל MW. פרוטוקול ההדמיה המתואר כאן אינו דורש קיבול של זרע, אם כי יש צורך בזרע כדי לרכוש את היכולת לעבור אקסוציטוזה אקרוזום רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. אפשר ללמוד אקסוציטוזה פתולוגית או אקסוציטוזה הנגרמת באמצעות ריאגנטים כגון סידן יונופור מבלי לקלוט את הזרע. נוסף על כך, ניתן לחקור שינויים אפשריים בסידן אקרוזומלי בתאים שאינם קבוליים בתגובה לגירויים שונים.
5. השתמש בזרע תוך 3-5 שעות מאיסוף, תוך שמירה על זמן קצר ככל האפשר ועקבי בין ניסויים ניסיוניים.
6. בצע את כל שלבי האיסוף והשטיפה בטמפרטורה של 37°C באמצעות MW בינוני, תוך שימוש בשיטות למזעור הנזק לממברנה. זה כולל את השימוש פיפטות העברת פלסטיק גדול או קצוות פיפטה גדול, אשר מומלץ לשימוש במהלך כל שלבי ההליך.

2. ציפוי פולי-D-ליזין של צלחות כיסוי להדמיה

הערה: יש להכין מנות פולי-D-ליזין (PDL) טריות לפני כל ניסוי.

1. יש להוציא טיפה של 0.5 מיקרוליטר PDL (0.5 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) במרכז צלחת כיסוי.
2. בעזרת קצה מדורג של 10 μL, מרחו את טיפת ה-PDL על פני הכיסוי (תבנית קרוסקרוס כפי שמוצג באיור 1B).
3. הניחו לייבוש ב-37°C למשך 10 דקות. יש לשמור כלים מצופים PDL מכוסים ובטמפרטורה של 37°C עד לשימוש.

3. משיכה נימית, העמסה לנשיפה

1. משוך נימי זכוכית בורוסיליקט (O.D, 2 מ"מ, תעודת זהות, 1.56 מ"מ, ראה טבלת חומרים) באמצעות הגדרות כדלקמן- חום: 330, משיכה: 250, מהירות: 250, וזמן: 70. שלב זה צריך להיות מותאם עבור המושך הספציפי בשימוש.
2. לפני כל ניסוי, טען נימי יחיד בתמיסה מעוררת המכילה ריכוז של פי 3-5 מהתמריץ (כדי להסביר את הדיפוזיה המהירה של התמיסה בעת הנשיפה). לפני המילוי, השתמשו בפינצטה עדינה כדי לפתוח את קצה הנימים בערך 1-2 מ"מ מהסוף. זה אמור לייצר קוטר פתיחה של ∼5 מיקרומטר. אין צורך בליטוש חום.
3. בעזרת פיפטת העברה דקה מפלסטיק, מזריקים לאט את התמיסה המגרה לתוך הנימים עד ששלושת רבעי אורכו מלאים.
4. הסר את כל בועות האוויר שנוצרו במהלך המילוי על ידי תנועה עדינה של הנימים.
5. הר נימי מלא על המיקרומניפולטור (ראה טבלת חומרים).

4. הכנת משלוח של גירוי עבור נשיפה

הערה: כדי למזער את הסיכון לפגיעה במשתמש, יש להרכיב משקפי מגן במהלך פעולת הליך הנשיפה.

1. הגדר את הגדרות מערכת המסירה של תא יחיד כדי לספק פעימה של 10 שניות ב- 5 psi.
2. חבר את נימי הבורוסיליקט למחזיק פיפטה של מערכת העברה חד-תאית. ודאו שהאטמים הדוקים.
3. בעת התבוננות בקצה הנימים, יש למרוח נשיפה קצרה של 2 שניות ב-20 psi כדי לוודא שאכן התמיסה מופצת דרך קצה הקצה (טיפה קטנה צריכה להיות ברורה בסוף הקצה).

5. מיקרוסקופיה ורכישת תמונה

הערה: מספר מותגים של מיקרוסקופים זמינים וניתן להשתמש בהם; עם זאת, רצוי קצב מסגרות מינימלי של 3 מסגרות לשנייה. לגבי טמפרטורה ובקרת סביבה, שים לב כי הטמפרטורה בפועל של המדיום בצלחת צריכה להיות מאושרת, למשל, באמצעות מדחום אינפרא אדום ללא מגע.

1. הוסף 80 μL של זרע מדולל למרכז צלחת כיסוי 35 מ"מ מצופה פולי-D-ליזין. עבור רוב הניסויים הכוללים קיבול זרע עכבר, ריכוז סופי של 5-10 מיליון זרע / מ"ל משמש.
2. הוסף לאט לזרע 3 מ"ל של מדיה בסיסית חמה (37 ° C) MW בתוספת 10 mM CaCl₂.
   הערה: אפשר לבצע ניסויים בטמפרטורת החדר כדי להאט תהליכים תאיים, אך חשוב לציין שמכיוון שקיבול מתווך על ידי חילופי שומנים ונזילות של מיקרו ומאקרו-דומיינים, יש לזכור שקיבול רלוונטי פיזיולוגית ואקסוציטוזה אקרוזומית הם תהליכים תלויי טמפרטורה.
3. הר את המנה עם הזרע על המיקרוסקופ (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס).
4. הרגש את GCaMP3 באמצעות קו לייזר של 488 ננומטר והצג באמצעות מסנן פס פס (BP) של 505-550 ננומטר. הרגש את mCherry באמצעות קו לייזר של 555 ננומטר והצג עם מסנן BP של 575-615 ננומטר.
5. באמצעות מיקרומניפולטור (מומלץ להצמיד את המניפולטור לשולחן האוויר שעליו הוצב המיקרוסקופ), מקם את קצה הנימים כ-100 מיקרומטר בצד וכ-5-10 מיקרומטר מעל מישור התא המעניין.
   הערה: התמיסות הממריצות מיוצרות בריכוז גבוה פי 3-5 מהריכוז הרגיל כדי לפצות על הדיפוזיה המהירה המתרחשת בנפח שבין הנימים לתא.
6. התחל את רצף ההדמיה במיקרוסקופ.
7. דמיינו תאי זרע בקצב פריימים גבוה, רצוי >10 פריימים לשנייה. כאן נעשה שימוש בסורק תהודה המאפשר הדמיה במהירות של 33ms/frame.
8. עשר שניות לאחר תחילת רכישת התמונה במיקרוסקופ, הפעל את מערכת ההעברה של תא בודד כדי להתחיל את הנשיפה של 10 שניות של ממריץ.
9. תמונה של תאים למשך 10-15 דקות.
10. באמצעות מערכת ההעברה של תא בודד, דמיינו תאים מרובים מצלחת אחת בהתאם למיקומים המופיעים באיור 1B.
    הערה: זרע לא מטופל / לא מגורה תחת המיקרוסקופ צריך להופיע בעיקר אדום, עם עוצמה נמוכה של האות הירוק. ראשי זרע צריכים להיות מחוברים לתלוש הכיסוי, וניתן לזהות זרע חי על ידי זנבותיהם הנעים. בזרע שעובר AE, האות הירוק GCaMP3 יגדל בתחילה, וגם האות האדום mCherry וגם האות הירוק GCaMP3 ייעלמו אם AE שלם, כפי שמודגם באיור 2. הפחתת פלואורסצנטיות mCherry מספקת אינדיקטור ספציפי יותר לזמן שבו AE מתחיל מכיוון ששינויים בריכוזי Ca²⁺ יגרמו ללא הרף לשינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3.

6. ניתוח תמונות ונתונים

הערה: ניתוח תמונה לא מקוון מתבצע באמצעות ImageJ (ראה טבלת חומרים). בעבר, דווח על מספר שלבי ביניים בתהליך המוביל ל-AE, כולל עליית סידן אקרוזומלית (ACR), ואיחוי מלא של הממברנה. האחרון מוביל לאובדן פלואורסצנטיות mCherry ולכן מייצג AE מלא. בתאים מסוימים, אותות הדומים לאירועי כף רגל טרום ספייק (PSF) נצפים בעת שימוש בגישות אמפרומטריות במחקרים של אקסוציטוזה (לפרטים נוספים, ראה²). קיימות מספר שיטות אופציונליות לניתוח הנתונים הגולמיים של AcroSensE לכימות ACR, AE ושלבי הביניים שלהם. להלן תיאור של כמה מהשיטות האנליטיות הבסיסיות.

1. בהתאם לסיומת הקובץ הספציפית של מערכת המיקרוסקופ, השתמש בכלי הערוץ המפוצל (Image > Colors > Split Channels) כדי ליצור חלונות נפרדים עבור ערוצי GCaMP3 ו- mCherry.
2. סנכרן את החלונות הבודדים באמצעות הכלי "סנכרן חלון" (ניתוח כלי > > סינכרון חלונות).
3. בחרו אזור עניין (ROI) סביב ראש הזרע בתעלה האדומה כדי לכלול את אזור האקרוזום (איור 3A,B). כלי הסנכרון מאפשר להחיל את אותו אזור בחירת באופן אוטומטי על הערוץ הירוק, שבו הזרע עדיין עמום מכדי להיות גלוי.
4. בחר תוסף "Z Profiler" (תוספים > ערימות > Z Profiler) או "מנתח סדרות זמן" (תוספים > ערימות > מנתח סדרות זמן) כדי להתוות את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות כפונקציה של מסגרות / זמן עבור כל אחד משני הערוצים.
5. העתק נתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Microsoft Excel) לצורך תכנון וניתוח נוסף.
   הערה: לאחר העתקת הנתונים לגיליון אלקטרוני, ניתן לחלץ פרמטרים מרובים לניתוח, כולל הפרמטרים הבאים, כפי שמודגם באיור 4.
   1. שעת התחלה של Fusion Pore (FP): מדוד את הזמן מנקודת זמן 0 לנקודת הזמן שבה אות GCaMP3 מתחיל לעלות. פרמטר זה מציין את ההשהיה בין הגירוי לבין תגובת ACR הזרע.
   2. זמן התחלה AE: מדוד את הזמן מנקודת זמן 0 לנקודת הזמן שבה אות mCherry מתחיל לדעוך. פרמטר זה מציין את ההשהיה בין הגירוי לבין תגובת AE הזרע. פרמטר זה יכול לשמש גם לחישוב ההשהיה בין היווצרות FP לבין תגובת AE.
   3. משרעת FP שיא: למדוד את האות הפלואורסצנטי מהבסיס לשיא עליית האות GCaMP3. פרמטר זה מציין את הגידול הכולל בתגובת ACR.
   4. קצב אובדן mCherry: קבע פרמטר זה על ידי התאמה ליניארית או מעריכית על החלק של אובדן האות mCherry (כפי שמצוין על ידי "שיפוע" באיור 4B).
      הערה: לחלופין, קבע את קצב הדעיכה לפי שיטת האות השיורי (R) בנקודות זמן שונות (לדוגמה, R60: משך זמן בשניות לאות שיורי של 60% מקו הבסיס של אות mCherry). ניתן להשתמש בפרמטר זה כדי לכמת את הקצב שבו התוכן האקרוזומלי מפוזר על AE.
   5. ירידת אות עבור אובדן mCherry: קבע את ההבדל באמפליטודה בין עוצמת הפלואורסצנטיות mCherry הבסיסית לבין האות שלאחר AE. פרמטר זה מציין את הכמות הכוללת של תוכן אקרוזומלי המפוזר על AE.
   6. התווה את השינויים בפלואורסצנטיות (F) עבור הערוצים האדומים והירוקים כאחד כנתונים גולמיים, או נרמל אותם על ידי הפלואורסצנטיות הראשונית (F0) ובטא אותם כ- ΔF/F0. האחרון מספק הדמיה טובה יותר של השינויים הן באדום והן בירוק בחלקה אחת (למשל, ראו איור 3D ואיור 3H).
      הערה: לבסוף, ניתן להשוות את הפרמטרים השונים שנמדדו בין תנאים שונים כדי לקבוע את הקשר בין שינויים בריכוז הסידן האקרוזומלי לבין AE. לדוגמאות להשוואות שונות בין מצבי ניסוי, ראו הפניה².

תוצאות

איור 2 מספק המחשה פשוטה שמראה את רצף השינויים הפלואורסצנטיים הצפויים בעקבות גירוי מוצלח של זרע. הפאנל העליון של איור 2 מדגים את השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3, כאשר האות עמום בתחילה (ריכוזי הסידן האקרוזומליים הבסיסיים נמוכים מ-GCaMP3 KD), ועם כניסתם של יו...

Discussion

כאן, מתוארת שיטה מבוססת מיקרוסקופיה המשתמשת במודל העכבר החדש שנוצר AcroSensE לניטור וניתוח בזמן אמת, תא בודד של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן אקרוזומלית ושלבי ביניים המובילים ל- AE. יחד עם גישות גנטיות זמינות, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או עריכת גנים, מודל ושיטה אלה מספקים מערכת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III