Визуализация в режиме реального времени акросомальной динамики кальция и экзоцитоза в живых сперматозоидах мышей

Резюме

Мышиная модель AcroSensE и описанные здесь методы визуализации живых клеток обеспечивают новый подход к изучению динамики кальция в субклеточном компартменте акросомы сперматозоида и того, как они регулируют промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.

Аннотация

Экзоцитоз акросом (АЭ), при котором единственный экзоцитотический везикул сперматозоида сливается с плазматической мембраной, является сложным, кальций-зависимым процессом, необходимым для оплодотворения. Тем не менее, наше понимание того, как кальциевая сигнализация регулирует АЭ, все еще не завершено. В частности, взаимосвязь между внутриакросомальной динамикой кальция и промежуточными стадиями, ведущими к НЯ, четко не определена. Здесь мы описываем метод, который дает пространственное и временное представление о акросомальной динамике кальция и ее связи со слиянием мембран и последующим экзоцитозом акросомного везикулы. В методе используется новая трансгенная мышь, экспрессирующая сенсор экзоцитоза, нацеленный на акросомы (AcroSensE). Датчик сочетает в себе генетически кодируемый кальциевый индикатор (GCaMP), смешанный с mCherry. Этот гибридный белок был специально разработан для одновременного наблюдения за акросомальной динамикой кальция и событиями слияния мембран. Мониторинг акросомальной динамики кальция и АЭ в живых сперматозоидах AcroSensE в режиме реального времени достигается с помощью комбинации визуализации с высокой частотой кадров и системы доставки стимулятора, которая может быть нацелена на один сперматозоид. Этот протокол также содержит несколько примеров основных методов количественной оценки и анализа необработанных данных. Поскольку модель AcroSensE является генетически закодированной, ее научная значимость может быть увеличена за счет использования легкодоступных генетических инструментов, таких как скрещивание с другими генетическими моделями мышей или методы, основанные на редактировании генов (CRISPR). С помощью этой стратегии можно решить роль дополнительных сигнальных путей в капажировании и оплодотворении сперматозоидов. Таким образом, описанный здесь метод представляет собой удобный и эффективный инструмент для изучения динамики кальция в специфическом субклеточном компартменте – акросоме сперматозоида – и того, как эта динамика регулирует промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.

Введение

Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению во время процесса, называемого капациацией¹. Одной из конечных точек этого процесса является то, что сперматозоиды приобретают способность подвергаться НЯ. Данные, собранные за два десятилетия, подтверждают наличие сложной, многоступенчатой модели НЯ в сперматозоидах млекопитающих (обобщенная в ^2,3). Однако изучение НЯ в живых сперматозоидах является сложной задачей, а имеющиеся в настоящее время методы мониторинга этого процесса с адекватным разрешением громоздки и требуют нескольких подготовительных этапов⁴, ограничиваются выявлением конечной стадии АЭ (например, с помощью ПНА⁵), ограничиваются измерениями изменений цитозольного кальция (в отличие от акросомальной динамики кальция), или ограничиваются измерениями цитозольной динамики кальция или АЭ⁶.

Чтобы преодолеть некоторые из ключевых ограничений исследований АЭ в реальном времени в физиологических условиях и исследовать взаимодействие между динамикой кальция и АЭ, была создана уникальная модель мышей. В этой мышиной модели гибридный белок, состоящий из генетически кодируемого сенсора Ca²⁺ (GCaMP3) и mCherry, экспрессируется и нацелен на акросому с помощью промотора акрозина и сигнального пептида². Прицельный двойной датчик GCaMP3-mCherry позволяет в режиме реального времени одновременно измерять концентрацию кальция и состояние акросомального содержимого в живых сперматозоидах в физиологических условиях с помощью микроскопии и одноклеточной системы доставки стимулятора (рис. 1). Как компонент акросомального матрикса, слияние мембран и АЭ приводят к потере фотостабильной и pH-нечувствительной флуоресценции mCherry из сперматозоидов, поскольку этот белок диффундирует из везикулы акросомы. В этом отношении способность модели отражать время и возникновение АЭ сродни преимуществам акросомно-ориентированной линии GFP ^7,8,9.

Вариант GCaMP3, используемый в этой линейке трансгенных мышей, имеет приблизительный KD 400 мкМ и динамический диапазон для Ca²⁺ 10-4-10-3 M¹⁰, что подходит для этого везикулы. Мы показали, что эта комбинация признаков GCaMP3 может выявить образование пор слияния между плазматической мембраной и наружной акросомальной мембраной (ОАМ)². Обнаружение слияния пор является результатом того, что размер пор слишком мал, чтобы позволить белку AcroSensE диспергироваться из акросомы (за счет потери содержимого акросомы), обеспечивая при этом мембранный «канал», который обеспечивает приток ионов Ca²⁺ в просвет акросомы, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции GCaMP3.

Яркий, мономерный, не чувствительный к кальцию флуоресцентный белок mCherry поддерживает визуализацию акросомы при слабом сигнале GCaMP3 (например, до связывания^Ca2+ , рис. 2), и, что важно, он также позволяет идентифицировать акросомные интактные сперматозоиды, пригодные для визуализации.

В следующем протоколе описывается использование уникальной модели мыши AcroSensE и методов микроскопии, используемых экспериментально для изучения динамики НЯ и кальция сперматозоидов с высоким пространственным и временным разрешением.

протокол

Все процедуры на животных были выполнены в соответствии с рекомендациями и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Корнелльском университете (#2002-0095). Для настоящего исследования были использованы мыши AcroSensE² в возрасте 8-10 недель. Запросы на получение информации о наличии мышей AcroSensE могут быть отправлены соответствующему автору.

1. Сбор и промывка спермы

1. Соберите сперматозоиды придатка яичка хвоста (подробнее об этой процедуре приведены в¹¹) у мышей AcroSensE. Выплавайте в течение 15 минут в чашке для культуры тканей диаметром 3,5 см, содержащей 0,5 мл модифицированной среды Уиттена (MW) при температуре 37 °C. Чашка должна быть накрыта, чтобы уменьшить испарение МВ, и должна быть наклонена так, чтобы среда имела достаточную глубину для покрытия придатков хвоста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированная среда Уиттена (MW) включает 22 мМ HEPES, 1,2 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1 мМ пировиноградной кислоты, 4,8 мМ молочной кислоты геми-Ca²⁺ соли, pH 7,35. Глюкоза (5,5 мМ), NaHCO₃ (10 мМ) и 2-гидроксипропил-циклодекстрин (CD; 3 мМ) добавляются (см. таблицу материалов) по мере необходимости для индукции капацитации, а концентрации могут быть изменены для конкретных экспериментов. Кроме того, вместо CD можно использовать альтернативные акцепторы стеринов (например, бычий сывороточный альбумин или липопротеины высокой плотности).
2. С помощью тонких щипцов удалите ткань придатка яичка из выплывающей чашки. Переложите среду, содержащую сперму, в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте суспензию при 100 x g в течение 1 мин в роторе с качающимся ведром при комнатной температуре. С помощью пластиковой пипетки удалите надосадочную жидкость MW, содержащую сперматозоиды, от любого крупного тканевого мусора, который будет гранулирован на этом этапе.
3. Довести СВ-надосадочную жидкость, содержащую сперматозоиды, до общего объема 3 мл, добавив МВт при 37 °C. Центрифуга при 400 x g в течение 8 мин (при комнатной температуре) в пробирке с круглым дном. Медленно удалите надосадочную жидкость MW из рыхло гранулированного сперматозоида.
4. Если сперматозоиды жизнеспособны, они должны выглядеть как «пушистые» гранулы. Осторожно ресуспендируйте сперматозоиды с помощью пипетки для переноса с большим отверстием или с помощью осторожных ручных постукиваний по трубке («щелканье пальцем»). После равномерного ресуспендирования переложите их в новую трубку с круглым дном. Используйте 10-20 мкл суспензии сперматозоидов для подсчета и оценки подвижности. Разведите сперматозоиды в MW для использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства экспериментов, связанных с капацитацией сперматозоидов мышей, используется конечная концентрация 5-10 миллионов сперматозоидов/мл МВт. Описанный здесь протокол визуализации не требует капацитации сперматозоидов, хотя это необходимо для того, чтобы сперматозоиды приобрели способность подвергаться физиологически значимому экзоцитозу акросом. Можно изучать патологический экзоцитоз или экзоцитоз, индуцированный с помощью реагентов, таких как ионофор кальция, без капацитации сперматозоидов. Кроме того, можно исследовать потенциальные изменения акросомального кальция в некапабельных клетках в ответ на различные стимулы.
5. Используйте сперму в течение 3-5 часов после забора, чтобы время было как можно короче и соответствовало экспериментальным испытаниям.
6. Выполняйте все этапы сбора и промывки при 37 °C с использованием СВЧ-среды, используя методы, позволяющие свести к минимуму повреждение мембраны. Это включает в себя использование пластиковых трансферных пипеток большого диаметра или наконечников для пипеток с большим отверстием, которые рекомендуется использовать на всех этапах процедуры.

2. Поли-D-лизиновое покрытие покровных стаканов для визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом блюда с поли-D-лизином (PDL) следует готовить свежими.

1. Дозируйте 0,5 мкл капли PDL (0,5 мг/мл, см. Таблицу материалов) в центр покровной чашки.
2. С помощью градуированного наконечника объемом 10 мкл нанесите каплю PDL на покровное стекло (крест-накрест, как показано на рисунке 1B).
3. Дайте высохнуть при температуре 37 °C в течение 10 минут. Храните посуду с покрытием PDL накрытой и при температуре 37 °C до использования.

3. Капиллярное вытягивание, загрузка для затяжки

1. Потяните капилляры боросиликатного стекла (наружный диаметр, 2 мм, внутренний диаметр, 1,56 мм, см. Таблицу материалов), используя следующие настройки: Нагрев: 330, Тяга: 250, Скорость: 250 и Время: 70. Этот шаг должен быть оптимизирован для конкретного используемого съемника.
2. Перед каждым экспериментом нагружайте один капилляр стимулирующим раствором, содержащим в 3-5 раз большую концентрацию стимулятора (чтобы учесть быструю диффузию раствора при затяжке). Перед наполнением тонким пинцетом разломите кончик капилляра примерно в 1-2 мм от конца. В результате должен получиться диаметр отверстия ∼5 мкм. Термическая полировка не требуется.
3. С помощью тонкой пластиковой трансферной пипетки медленно вводите стимулирующий раствор в капилляр до тех пор, пока не будет заполнено три четверти его длины.
4. Удалите все пузырьки воздуха, образовавшиеся во время наполнения, легким щелчком капилляра.
5. Установите заполненный капилляр на микроманипулятор (см. таблицу материалов).

4. Подготовка подачи стимуляции к затяжке

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму риск получения травмы пользователем, во время процедуры надувания следует надевать защитные очки.

1. Настройте параметры системы доставки одной ячейки так, чтобы она обеспечивала импульс длительностью 10 с при давлении 5 фунтов на квадратный дюйм.
2. Подсоедините боросиликатный капилляр к держателю дозатора одноклеточной системы доставки. Убедитесь, что уплотнения плотно прилегают.
3. Наблюдая за кончиком капилляра, сделайте короткую затяжку продолжительностью 2 с под давлением 20 фунтов на квадратный дюйм, чтобы убедиться, что раствор действительно дозируется через конец наконечника (небольшая капля должна быть заметна на конце наконечника).

5. Микроскопия и получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопы различных марок доступны и могут использоваться; Тем не менее, желательна минимальная частота кадров 3 кадра в секунду. Что касается контроля температуры и окружающей среды, обратите внимание, что фактическая температура среды в тарелке должна быть подтверждена, например, с помощью бесконтактного инфракрасного термометра.

1. Добавьте 80 мкл разбавленной спермы в центр 35-миллиметровой покровной чашки, покрытой поли-D-лизином. Для большинства экспериментов, связанных с капацитацией сперматозоидов мышей, используется конечная концентрация 5-10 миллионов сперматозоидов/мл.
2. Медленно добавьте к сперматозоиду 3 мл теплой (37 °C) МВ-среды с добавлением 10 мМ CaCl₂.
   Примечание: Можно проводить эксперименты при комнатной температуре, чтобы замедлить клеточные процессы, но важно отметить, что, поскольку капацитация опосредована липидным обменом и текучестью микро- и макродоменов, следует иметь в виду, что физиологически значимая капативность и экзоцитоз акросом являются температурно-зависимыми процессами.
3. Установите чашку со спермой на микроскоп (предварительно нагретый до 37 °C).
4. Возбуждайте GCaMP3 с помощью лазерной линии с длиной волны 488 нм и просматривайте с помощью полосового фильтра 505-550 нм. Возбудите mCherry с помощью лазерной линии 555 нм и просматривайте с помощью фильтра BP 575-615 нм.
5. С помощью микроманипулятора (рекомендуется прикрепить манипулятор к воздушному столу, на котором установлен микроскоп) расположите кончик капилляра примерно на 100 мкм сбоку и на 5-10 мкм выше плоскости интересующей ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулирующие растворы производятся в 3-5 раз выше нормальной концентрации, чтобы компенсировать быструю диффузию, происходящую в объеме между капилляром и клеткой.
6. Запустите последовательность визуализации на микроскопе.
7. Изображение сперматозоидов с высокой частотой кадров, предпочтительно >10 кадров/с. Здесь был использован резонансный сканер, который позволяет получать изображения с частотой 33 мс/кадр.
8. Через десять секунд после начала получения изображения на микроскопе активируйте систему доставки одной клетки, чтобы инициировать 10-секундную затяжку стимулятора.
9. Изображение ячеек в течение 10-15 мин.
10. Используя одноклеточную систему доставки, визуализируйте несколько ячеек из одной чашки в соответствии с местоположениями, указанными на рисунке 1B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные/нестимулированные сперматозоиды под микроскопом должны выглядеть в основном красными, с низкой интенсивностью зеленого сигнала. Головки сперматозоидов должны быть прикреплены к покровному стекле, а живые сперматозоиды могут быть идентифицированы по их движущимся хвостам. В сперматозоидах, которые подвергаются АЭ, зеленый сигнал GCaMP3 сначала будет увеличиваться, и как вишнево-красный сигнал, так и зеленый сигнал GCaMP3 исчезнут, если АЭ завершена, как показано на рисунке 2. Снижение флуоресценции mCherry обеспечивает более точный индикатор времени начала АЭ, поскольку изменения в концентрациях Ca²⁺ будут постоянно вызывать изменения интенсивности флуоресценции GCaMP3.

6. Анализ изображений и данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Автономный анализ изображений проводится с помощью ImageJ (см. Таблицу материалов). Ранее сообщалось о нескольких промежуточных стадиях процесса, ведущего к НЯ, включая акросомальное повышение кальция (ACR) и полное слияние мембран. Последнее приводит к потере флуоресценции mCherry и, следовательно, представляет собой полную АЭ. В некоторых клетках при использовании амперометрических подходов в исследованиях экзоцитоза наблюдаются сигналы, сходные с предспайковыми событиями (PSF) (подробнее см.²). Существует несколько дополнительных методов анализа необработанных данных AcroSensE для количественной оценки ACR, AE и их промежуточных этапов. Ниже описаны некоторые из основных аналитических методов.

1. В зависимости от конкретного расширения системного файла микроскопа, используйте инструмент разделения каналов (Image > Colors > Split Channels) для создания отдельных окон для каналов GCaMP3 и mCherry.
2. Синхронизируйте отдельные окна с помощью инструмента «Синхронизировать окно» («Анализ > инструментов» > «Синхронизация окон»).
3. Выберите область интереса (ROI) вокруг головки сперматозоида в красном канале, чтобы включить область акросомы (рис. 3A, B). Инструмент синхронизации позволяет автоматически применить тот же выбор области к зеленому каналу, в котором сперматозоиды еще слишком тусклые, чтобы их можно было увидеть.
4. Выберите плагин "Z Profiler" (Плагины > стеки > Z Profiler) или "Анализатор временных рядов" (Плагины > стеки > Анализатор временных рядов), чтобы построить график изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от кадров/времени для каждого из двух каналов.
5. Копирование данных в программное обеспечение для работы с электронными таблицами (например, Microsoft Excel) для построения графиков и дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как данные скопированы в электронную таблицу, можно извлечь несколько параметров для анализа, включая следующие, как показано на рисунке 4.
   1. Время начала сварки пор (FP): измеряет время от точки 0 до точки времени, когда сигнал GCaMP3 начинает нарастать. Этот параметр указывает на задержку между стимуляцией и ответом ACR сперматозоида.
   2. Время начала AE: измеряет время от точки времени 0 до точки времени, когда сигнал mCherry начинает затухать. Этот параметр указывает на задержку между стимуляцией и ответом АЭ сперматозоидов. Этот параметр также может быть использован для расчета задержки между формированием ФП и откликом АЭ.
   3. Пиковая амплитуда FP: измерение сигнала флуоресценции от основания до пика нарастания сигнала GCaMP3. Этот параметр указывает на общее увеличение отклика ACR.
   4. Скорость потерь mCherry: определите этот параметр линейной или экспоненциальной аппроксимацией на участке потерь сигнала mCherry (как указано словом «наклон» на рисунке 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно определить скорость затухания методом остаточного (R) сигнала в различные моменты времени (например, R60: время длительности в секундах до остаточного сигнала 60% от базовой линии сигнала mCherry). Этот параметр может быть использован для количественной оценки скорости, с которой акросомальное содержимое рассеивается при АЭ.
   5. Снижение сигнала при потере mCherry: определите разницу в амплитуде между базовой интенсивностью флуоресценции mCherry и сигналом, следующим за AE. Этот параметр указывает на общее количество акросомального содержимого, диспергированного при АЭ.
   6. Постройте график изменений флуоресценции (F) для красного и зеленого каналов в виде исходных данных или нормализуйте их по начальной флуоресценции (F0) и выразите их как ΔF/F0. Последний обеспечивает лучшую визуализацию изменений как красного, так и зеленого цвета на одном графике (см., например, рис. 3D и рис. 3H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконец, различные измеренные параметры могут быть сравнены в различных условиях, чтобы определить взаимосвязь между изменениями концентрации кальция в акросомальной области и АЭ. Примеры различных сравнений экспериментальных условий см. в ссылке².

Результаты

На рисунке 2 представлена упрощенная иллюстрация, показывающая последовательность изменений флуоресценции, ожидаемых после успешной стимуляции сперматозоидов. Верхняя панель рисунка 2 иллюстрирует изменения интенсивности флуоресценции GCaMP3, где сигн?...

Обсуждение

В данной работе описан метод, основанный на микроскопии, использующий недавно сгенерированную модель мыши AcroSensE для мониторинга отдельных клеток в режиме реального времени и анализа взаимодействия между акросомальной динамикой кальция и промежуточными этапами, ведущими к АЭ. Вместе ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III