Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos

Resumo

O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.

Resumo

A exocitose acrossômica (AE), na qual a única vesícula exocitótica do espermatozoide se funde com a membrana plasmática, é um processo complexo, cálcio-dependente, essencial para a fecundação. No entanto, nossa compreensão de como a sinalização do cálcio regula o EA ainda é incompleta. Em particular, a interação entre a dinâmica intra-acrossomal do cálcio e as etapas intermediárias que levam ao EA não é bem definida. Aqui, descrevemos um método que fornece informações espaciais e temporais sobre a dinâmica do cálcio acrossomal e sua relação com a fusão de membrana e subsequente exocitose da vesícula acrossomal. O método utiliza um novo camundongo transgênico expressando um sensor para exocitose (AcroSensE) direcionado a um acrossoma. O sensor combina um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP) fundido com mCherry. Esta proteína de fusão foi projetada especificamente para permitir a observação simultânea da dinâmica do cálcio acrossomal e eventos de fusão de membrana. O monitoramento em tempo real da dinâmica do cálcio acrossomal e AE em espermatozoides vivos AcroSensE é obtido usando uma combinação de imagens de alta taxa de quadros e um sistema de entrega de estimulantes que pode atingir um único espermatozoide. Este protocolo também fornece vários exemplos de métodos básicos para quantificar e analisar os dados brutos. Como o modelo AcroSensE é codificado geneticamente, seu significado científico pode ser aumentado usando ferramentas genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou métodos baseados em edição genética (CRISPR). Com essa estratégia, os papéis de vias de sinalização adicionais na capacitação e fertilização espermática podem ser resolvidos. Em resumo, o método descrito aqui fornece uma ferramenta conveniente e eficaz para estudar a dinâmica do cálcio em um compartimento subcelular específico - o acrossoma espermático - e como essas dinâmicas regulam as etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e à exocitose acrossomal.

Introdução

Os espermatozoides adquirem a capacidade de fecundar durante um processo chamado capacitação¹. Um ponto final desse processo é que os espermatozoides adquirem a capacidade de sofrer EA. Mais de duas décadas de dados suportam a presença de um modelo complexo e de várias etapas de EA em espermatozoides de mamíferos (resumido em ^2,3). No entanto, estudar EA em espermatozoides vivos é um desafio, e os métodos atualmente disponíveis para monitorar esse processo com resolução adequada são complicados e requerem várias etapas de preparação⁴, são limitados à detecção da etapa final do EA (por exemplo, usando PNA⁵), são limitados a medidas de alterações no cálcio citosólico (em contraste com a dinâmica do cálcio acrossomal), ou limitam-se a medidas da dinâmica citosólica do cálcio ou AE⁶.

Para superar algumas das principais limitações dos estudos de EA em tempo real sob condições fisiológicas e permitir a investigação da interação entre a dinâmica do cálcio e EA, um modelo único de camundongo foi gerado. Neste modelo de camundongo, uma proteína de fusão composta pelo sensor Ca²⁺ codificado geneticamente (GCaMP3) e mCherry é expressa e direcionada para o acrossoma usando um promotor de acrosina e peptídeo de sinalização². O sensor duplo GCaMP3-mCherry direcionado permite medições simultâneas em tempo real das concentrações de cálcio e do estado do conteúdo acrossomal em espermatozoides vivos em condições fisiológicas usando microscopia e um sistema de liberação de estimulante de célula única (Figura 1). Como componente da matriz acrisomal, a fusão da membrana e o AE resultariam na perda da fluorescência mCherry fotosestável e insensível ao pH do espermatozoide, uma vez que essa proteína se difunde para fora da vesícula do acrossoma. Nesse sentido, a capacidade do modelo de refletir o momento e a ocorrência de EA é semelhante aos benefícios da linhagem de camundongos GFP direcionada para acrossoma7,8,9.

A variante GCaMP3 usada nesta linha de camundongos transgênicos tem um KD aproximado de 400 μM e uma faixa dinâmica para Ca²⁺ de 10-4-10-3 M¹⁰, o que é adequado para esta vesícula. Mostramos que essa combinação de características da GCaMP3 poderia revelar a formação de poros de fusão entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal externa (MAO)². A detecção de poros de fusão é resultado do tamanho dos poros ser muito pequeno para permitir que a proteína AcroSensE se disperse para fora do acrossoma (através da perda de conteúdo acrossomo) enquanto fornece um "canal" de membrana que permite o influxo de íons Ca²⁺ no lúmen acrossomo, levando a um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP3.

A proteína fluorescente brilhante, monomérica e não sensível ao cálcio mCherry suporta a visualização do acrossoma enquanto o sinal GCaMP3 é fraco (por exemplo, antes da ligação de Ca²⁺ , Figura 2) e, importante, também permite a identificação de espermatozoides intactos de acrossoma adequados para exames de imagem.

O protocolo a seguir descreve a utilização do modelo único de camundongos AcroSensE e os métodos de microscopia usados experimentalmente para estudar a dinâmica do cálcio espermático e AE com alta resolução espacial e temporal.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell (#2002-0095). Camundongos AcroSensE² com 8-10 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Pedidos de informação sobre a disponibilidade dos ratos AcroSensE podem ser submetidos ao autor correspondente.

1. Coleta e lavagem de espermatozoides

1. Coletar espermatozoides epididimais caudais (mais detalhes sobre este procedimento são fornecidos em¹¹) de camundongos AcroSensE. Permitir 15 min de procedimento de nadar em uma placa de cultura de tecidos de 3,5 cm contendo 0,5 mL de meio de Whitten modificado (MW) a 37 °C. A placa deve ser coberta para reduzir a evaporação do MW, e deve ser inclinada para que o meio tenha profundidade suficiente para cobrir a cauda dos epidídimos.
   NOTA: O meio de Whitten modificado (MW) inclui 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM ácido pirúvico, 4,8 mM ácido láctico hemi-Ca²⁺ sal, pH 7,35. Glicose (5,5 mM), NaHCO₃ (10 mM) e 2-hidroxipropil-ciclodextrina (CD; 3 mM) são suplementados (ver Tabela de Materiais) conforme necessário para indução de capacitação, e as concentrações podem ser modificadas para experimentos específicos. Além disso, aceptores alternativos de esterol poderiam ser usados em vez de CD (por exemplo, albumina de soro bovino ou lipoproteínas de alta densidade).
2. Usando pinças finas, remova qualquer tecido epididimal da placa de coleta de natação. Transfira o meio contendo os espermatozoides para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a suspensão a 100 x g por 1 min em um rotor de balde oscilante à temperatura ambiente. Usando uma pipeta de plástico, remova o sobrenadante MW que contém os espermatozoides de qualquer detrito de tecido grosseiro que terá peletizado nesta etapa.
3. Levar o sobrenadante de MW contendo os espermatozoides a um volume total de 3 mL adicionando MW a 37 °C. Centrifugar a 400 x g durante 8 min (à temperatura ambiente) num tubo de fundo redondo. Remova lentamente o sobrenadante de MW dos espermatozoides soltos.
4. Se viável, o espermatozoide deve aparecer como uma pelota de aparência "fofa". Ressuspenda suavemente os espermatozoides através da trituração com uma pipeta de transferência de furo grande ou através de toques manuais suaves no tubo ("toque do dedo"). Uma vez ressuspensos uniformemente, transfira-os para um novo tubo de fundo redondo. Use 10-20 μL da suspensão de espermatozoides para contar e avaliar a motilidade. Diluir os espermatozoides em MW para uso.
   NOTA: Para a maioria dos experimentos envolvendo a capacitação de espermatozoides de camundongos, uma concentração final de 5-10 milhões de espermatozoides/mL MW é utilizada. O protocolo de imagem aqui descrito não requer a capacitação dos espermatozoides, embora seja necessário que os espermatozoides adquiram a capacidade de se submeter a exocitose acrossômica fisiologicamente relevante. Pode-se estudar exocitose patológica ou exocitose induzida através de reagentes como um ionóforo de cálcio sem capacitar os espermatozoides. Adicionalmente, pode-se explorar possíveis alterações no cálcio acrossomal em células não capacitadas em resposta a vários estímulos.
5. Use os espermatozoides dentro de 3-5 h da coleta, mantendo o tempo o mais curto possível e consistente entre os ensaios experimentais.
6. Realizar todas as etapas de coleta e lavagem a 37 °C utilizando meio MW, empregando métodos para minimizar os danos à membrana. Isso inclui o uso de pipetas de transferência de plástico de grande calibre ou pontas de pipeta de orifício grande, que são recomendadas para uso durante todas as etapas do procedimento.

2. Revestimento poli-D-lisina de placas de deslizamento para imagem

NOTA: Pratos de poli-D-lisina (PDL) devem ser preparados frescos antes de cada experimento.

1. Dispense uma gota de PDL de 0,5 μL (0,5 mg/mL, ver Tabela de Materiais) no centro de uma placa de cobertura.
2. Usando uma ponta graduada de 10 μL, esfregue a gota PDL através da lamínula (padrão cruzado como mostrado na Figura 1B).
3. Deixe secar a 37 °C durante 10 min. Mantenha os pratos revestidos com PDL cobertos e a 37 °C até usar.

3. Tração capilar, carregamento para puffing

1. Puxe os capilares de vidro borossilicato (O.D, 2 mm, I.D, 1,56 mm, consulte a Tabela de Materiais) usando as seguintes configurações: Calor: 330, Puxar: 250, Velocidade: 250 e Tempo: 70. Esta etapa deve ser otimizada para o extrator específico em uso.
2. Antes de cada experimento, carregar um único capilar com a solução estimulante contendo 3-5x a concentração do estimulante (para explicar a rápida difusão da solução ao puffing). Antes do enchimento, use uma pinça fina para abrir a ponta capilar a aproximadamente 1-2 mm da extremidade. Isso deve produzir um diâmetro de abertura de ∼5 μm. Não é necessário polimento térmico.
3. Usando uma pipeta de transferência de plástico fina, injete lentamente a solução estimulante no capilar até que três quartos de seu comprimento esteja cheio.
4. Remova quaisquer bolhas de ar formadas durante o enchimento por meio de movimentos suaves do capilar.
5. Monte capilar preenchido no micromanipulador (ver Tabela de Materiais).

4. Preparação da aplicação de estimulação para puffing

NOTA: Para minimizar o risco de lesão do usuário, óculos de segurança devem ser usados durante a operação do procedimento de puffing.

1. Configure as configurações do sistema de entrega de célula única para fornecer um pulso de 10 s a 5 psi.
2. Conecte o capilar de borossilicato ao suporte da pipeta do sistema de entrega de célula única. Certifique-se de que as vedações estejam apertadas.
3. Ao observar a ponta capilar, aplique um sopro curto de 2 s a 20 psi para garantir que a solução seja realmente dispensada através da extremidade da ponta (uma pequena gota deve ser óbvia no final da ponta).

5. Microscopia e aquisição de imagens

NOTA: Várias marcas de microscópios estão disponíveis e podem ser usados; no entanto, uma taxa de quadros mínima de 3 quadros / s é desejável. Em relação à temperatura e ao controle ambiental, observe que a temperatura real do meio no prato deve ser confirmada, por exemplo, usando um termômetro infravermelho sem contato.

1. Adicionar 80 μL de esperma diluído ao centro de uma placa de cobertura de 35 mm revestida com poli-D-lisina. Para a maioria dos experimentos envolvendo a capacitação de espermatozoides em camundongos, uma concentração final de 5-10 milhões de espermatozoides/mL é utilizada.
2. Adicionar lentamente ao esperma 3 mL de meio base MW morno (37 °C) suplementado com CaCl₂ 10 mM.
   NOTA: Pode-se realizar experimentos à temperatura ambiente para retardar os processos celulares, mas é importante notar que, como a capacitação é mediada pelas trocas lipídicas e pela fluidez dos micro e macrodomínios, deve-se ter em mente que a capacitação fisiologicamente relevante e a exocitose acrossômica são processos dependentes da temperatura.
3. Monte o prato com os espermatozoides no microscópio (pré-aquecido a 37 °C).
4. Excite o GCaMP3 usando uma linha de laser de 488 nm e visualize com um filtro passa-banda (BP) de 505-550 nm. Excite o mCherry usando uma linha laser de 555 nm e visualize com um filtro BP de 575-615 nm.
5. Usando um micromanipulador (recomenda-se fixar o manipulador à mesa de ar na qual o microscópio foi montado.), posicione a ponta do capilar aproximadamente 100 μm ao lado e 5-10 μm acima do plano da célula de interesse.
   NOTA: As soluções estimulantes são feitas a 3-5x a concentração normal para compensar a rápida difusão que ocorre no volume entre o capilar e a célula.
6. Inicie a sequência de imagens no microscópio.
7. Imagem de espermatozoides a uma alta taxa de quadros, de preferência >10 quadros/s. Aqui, foi utilizado um scanner ressonante que permite a obtenção de imagens a 33 ms/frame.
8. Dez segundos após iniciar a aquisição da imagem ao microscópio, ative o sistema de liberação unicelular para iniciar o sopro de 10 s do estimulante.
9. Células de imagem por uma duração de 10-15 min.
10. Usando o sistema de liberação de célula única, imagine várias células de um único prato de acordo com os locais fornecidos na Figura 1B.
    NOTA: Os espermatozoides não tratados/não estimulados ao microscópio devem aparecer principalmente vermelhos, com baixa intensidade do sinal verde. As cabeças de espermatozoides devem ser presas à lamínula, e os espermatozoides vivos podem ser identificados por suas caudas em movimento. Nos espermatozoides que sofrem EA, o sinal verde GCaMP3 aumentará inicialmente, e tanto o sinal vermelho mCherry quanto o sinal verde GCaMP3 desaparecerão se o AE estiver completo, como ilustrado na Figura 2. A redução da fluorescência mCherry fornece um indicador mais específico do momento em que o AE começa, pois mudanças nas concentrações de Ca²⁺ causarão continuamente mudanças na intensidade da fluorescência GCaMP3.

6. Análise de imagens e dados

NOTA: A análise de imagem off-line é realizada usando o ImageJ (consulte a Tabela de Materiais). Anteriormente, várias etapas intermediárias foram relatadas no processo que levou ao EA, incluindo elevação do cálcio acrossomal (RAC) e fusão completa da membrana. Este último leva à perda da fluorescência mCherry e, portanto, representa AE completo. Em algumas células, sinais semelhantes a eventos pré-pé de espícula (PSF) são observados ao usar abordagens amperométricas em estudos de exocitose (para mais detalhes, consulte²). Vários métodos opcionais estão disponíveis para analisar os dados brutos do AcroSensE para quantificar ACR, AE e suas etapas intermediárias. A seguir, descrevemos alguns dos métodos analíticos básicos.

1. Dependendo da extensão de arquivo do sistema do microscópio específico, use a ferramenta de canal dividido (Image > Colors > Split Channels) para gerar janelas individuais para os canais GCaMP3 e mCherry.
2. Sincronize as janelas individuais usando a ferramenta "Sincronizar janela" (Analisar > Ferramentas > Sincronizar Windows).
3. Selecione uma região de interesse (ROI) ao redor da cabeça do espermatozoide no canal vermelho para incluir a região acrossômica (Figura 3A,B). A ferramenta de sincronização permite que a mesma seleção de área seja aplicada automaticamente no canal verde, no qual os espermatozoides ainda estão muito escuros para serem visíveis.
4. Escolha o plugin "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) ou "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) para plotar a mudança na intensidade da fluorescência em função de quadros/tempo para cada um dos dois canais.
5. Copie os dados para um software de planilha (por exemplo, Microsoft Excel) para plotagem e análise adicional.
   Observação : uma vez que os dados são copiados para uma planilha, vários parâmetros podem ser extraídos para análise, incluindo o seguinte, conforme ilustrado na Figura 4.
   1. Tempo de início do Fusion Pore (FP): meça o tempo do ponto de tempo 0 até o ponto de tempo em que o sinal GCaMP3 começa a subir. Esse parâmetro indica o atraso entre a estimulação e a resposta do ACR espermático.
   2. Hora de início AE: meça o tempo do ponto de tempo 0 até o ponto de tempo onde o sinal mCherry começa a decair. Esse parâmetro indica o atraso entre a estimulação e a resposta espermática AE. Esse parâmetro também pode ser usado para calcular o atraso entre a formação do PF e a resposta do EA.
   3. Pico de amplitude de FP: mede o sinal de fluorescência da base até o pico de elevação do sinal GCaMP3. Esse parâmetro indica o aumento total na resposta do ACR.
   4. Taxa de perda de mCherry: determine este parâmetro por um ajuste linear ou exponencial na seção da perda do sinal mCherry (como indicado por "inclinação" na Figura 4B).
      NOTA: Alternativamente, determine a taxa de decaimento pelo método do sinal residual (R) em vários pontos de tempo (por exemplo, R60: tempo de duração em segundos para um sinal residual de 60% da linha de base do sinal mCherry). Esse parâmetro pode ser usado para quantificar a taxa de dispersão do conteúdo arossomal sobre EA.
   5. Diminuição do sinal para perda de mCherry: determine a diferença de amplitude entre a intensidade de fluorescência mCherry basal e o sinal após AE. Esse parâmetro indica a quantidade total de conteúdo acrossomal disperso sobre EA.
   6. Plotar as mudanças na fluorescência (F) para os canais vermelho e verde como dados brutos, ou normalizá-los pela fluorescência inicial (F0) e expressá-los como ΔF/F0. Este último fornece melhor visualização das mudanças em vermelho e verde em um único gráfico (por exemplo, veja a Figura 3D e a Figura 3H).
      NOTA: Finalmente, os diferentes parâmetros medidos podem ser comparados entre diferentes condições para determinar a relação entre mudanças na concentração de cálcio acrossomal e EA. Para exemplos de várias comparações de condições experimentais, ver referência².

Resultados

A Figura 2 fornece uma ilustração simplificada mostrando a sequência de mudanças de fluorescência esperadas após a estimulação bem-sucedida dos espermatozoides. O painel superior da Figura 2 ilustra as mudanças na intensidade da fluorescência do GCaMP3, onde o sinal é inicialmente fraco (as concentrações basais de cálcio acrossomal são menores que o GCaMP3 KD), e na entrada de íons cálcio através dos poros de fusão, a fluorescência a...

Discussão

Aqui, um método baseado em microscopia é descrito para utilizar o modelo de camundongo AcroSensE recém-gerado para monitoramento em tempo real, de célula única e análise da interação entre a dinâmica do cálcio acrossomal e as etapas intermediárias que levam ao EA. Juntamente com abordagens genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou edição de genes, este modelo e método fornecem um sistema poderoso para estudar o papel de vários componentes e vias qu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III