Canlı fare sperminde akrozomal kalsiyum dinamiği ve ekzositozun gerçek zamanlı görüntülenmesi

Özet

Burada açıklanan AcroSensE fare modeli ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri, sperm akrozomunun hücre altı bölmesindeki kalsiyum dinamiklerini ve bunların membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar.

Özet

Spermin tek ekzositik vezikülünün plazma zarı ile birleştiği akrozom ekzositozu (AE), döllenme için gerekli olan karmaşık, kalsiyuma bağımlı bir süreçtir. Bununla birlikte, kalsiyum sinyalinin AE'yi nasıl düzenlediğine dair anlayışımız hala eksiktir. Özellikle, intraakrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye giden ara adımlar arasındaki etkileşim iyi tanımlanmamıştır. Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ve bunların membran füzyonu ve ardından akrozom vezikülünün ekzositozu ile ilişkisi hakkında uzamsal ve zamansal bilgiler sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, Ekzositoz için Akrozom hedefli bir Sensörü (AcroSensE) eksprese eden yeni bir transgenik fare kullanır. Sensör, mCherry ile kaynaşmış genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesini (GCaMP) birleştirir. Bu füzyon proteini, akrozomal kalsiyum dinamiği ve membran füzyon olaylarının eşzamanlı gözlemini sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Canlı AcroSensE sperminde akrozomal kalsiyum dinamiklerinin ve AE'nin gerçek zamanlı izlenmesi, yüksek kare hızlı görüntüleme ve tek spermi hedefleyebilen bir uyarıcı dağıtım sisteminin bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Bu protokol ayrıca ham verileri ölçmek ve analiz etmek için birkaç temel yöntem örneği sağlar. AcroSensE modeli genetik olarak kodlandığından, diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme (CRISPR) tabanlı yöntemler gibi hazır genetik araçlar kullanılarak bilimsel önemi artırılabilir. Bu strateji ile ek sinyal yolaklarının sperm kapasitasyonu ve döllenmedeki rolleri çözülebilir. Özetle, burada açıklanan yöntem, belirli bir hücre altı bölmedeki (sperm akrozomunda) kalsiyum dinamiklerini ve bu dinamiklerin membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için uygun ve etkili bir araç sağlar.

Giriş

Sperm, kapasitasyon¹ adı verilen bir işlem sırasında döllenme yeteneği kazanır. Bu sürecin bir son noktası, spermin AE'ye girme yeteneğini kazanmasıdır. Yirmi yılı aşkın veriler, memeli sperminde karmaşık, çok adımlı bir AE modelinin varlığını desteklemektedir (^2,3'te özetlenmiştir). Bununla birlikte, AE'yi canlı spermde incelemek zordur ve bu süreci yeterli çözünürlükle izlemek için şu anda mevcut olan yöntemler zahmetlidir ve birden fazla hazırlık adımı gerektirir⁴, AE'nin son adımının tespiti ile sınırlıdır (ör., PNA⁵ kullanılarak), sitozolik kalsiyumdaki değişikliklerin ölçümleri ile sınırlıdır (akrozomal kalsiyum dinamiklerinin aksine), veya sitozolik kalsiyum dinamiği veya AE⁶ ölçümleriyle sınırlıdır.

Fizyolojik koşullar altında gerçek zamanlı AE çalışmalarının bazı temel sınırlamalarının üstesinden gelmek ve kalsiyum dinamiği ile AE arasındaki etkileşimin araştırılmasını sağlamak için benzersiz bir fare modeli oluşturuldu. Bu fare modelinde, genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} sensörü (GCaMP3) ve mCherry'den oluşan bir füzyon proteini eksprese edilir ve bir akrosin promotörü ve sinyal peptidi² kullanılarak akrozoma hedeflenir. Hedeflenen çift GCaMP3-mCherry sensörü, mikroskopi ve tek hücreli uyarıcı dağıtım sistemi kullanılarak fizyolojik koşullar altında canlı spermdeki kalsiyum konsantrasyonlarının ve akrozomal içeriğin durumunun eş zamanlı gerçek zamanlı ölçümlerini sağlar (Şekil 1). Akrozomal matrisin bir bileşeni olarak, membran füzyonu ve AE, bu protein akrozom vezikülünden dışarı yayıldığından, spermden fototable ve pH'a duyarsız mCherry floresansının kaybına neden olur. Bu bağlamda, modelin AE'nin zamanlamasını ve oluşumunu yansıtma yeteneği, akrozom hedefli GFP fare serisi 7,8,9'un faydalarına benzer.

Bu transgenik fare serisinde kullanılan GCaMP3 varyantı, yaklaşık 400 μM'lik bir KD'ye ve bu vezikül için uygun olan 10-4-10-3 M ^10'luk Ca²⁺ için dinamik bir aralığa sahiptir. GCaMP3'ün bu özellik kombinasyonunun, plazma membranı ile dış akrozomal membran (OAM)² arasında füzyon gözenek oluşumunu ortaya çıkarabileceğini gösterdik. Füzyon gözenek tespiti, gözenek boyutunun AcroSensE proteininin akrozomdan dağılmasına izin vermeyecek kadar küçük olmasının bir sonucudur (akrozom içeriğinin kaybı yoluyla) ve Ca²⁺ iyonlarının akrozom lümenine akışını sağlayan bir membran "kanalı" sağlar, GCaMP3'ün floresan yoğunluğunda bir artışa yol açar.

Parlak, monomerik, kalsiyuma duyarlı olmayan floresan protein mCherry, GCaMP3 sinyali zayıfken (örneğin, Ca²⁺ bağlanmadan önce, Şekil 2) akrozomun görselleştirilmesini destekler ve daha da önemlisi, görüntüleme için uygun akrozom-bozulmamış sperm hücrelerinin tanımlanmasına da izin verir.

Aşağıdaki protokol, benzersiz AcroSensE fare modelinin kullanımını ve AE ve sperm kalsiyum dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle incelemek için deneysel olarak kullanılan mikroskopi yöntemlerini açıklamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri yönergelere göre gerçekleştirildi ve Cornell Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (#2002-0095). Bu çalışma için 8-10 haftalık AcroSensE fareleri² kullanıldı. AcroSensE farelerin kullanılabilirliği hakkında bilgi talepleri ilgili yazara gönderilebilir.

1. Sperm toplama ve yıkama

1. AcroSensE farelerinden kauda epididimal spermi toplayın (bu prosedürle ilgili daha fazla ayrıntı^11'de verilmiştir). 37 ° C'de 0,5 mL Modifiye Whitten ortamı (MW) içeren 3,5 cm'lik bir doku kültürü kabında 15 dakikalık yüzme prosedürüne izin verin. MW'nin buharlaşmasını azaltmak için çanak örtülmeli ve ortam kauda epididimitlerini örtmek için yeterli derinliğe sahip olacak şekilde eğilmelidir.
   NOT: Modifiye Whitten'in ortamı (MW), 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM pirüvik asit, 4.8 mM laktik asit hemi-Ca²⁺ tuzu, pH 7.35 içerir. Glikoz (5.5 mM), NaHCO₃ (10 mM) ve 2-hidroksipropil - siklodekstrin (CD; 3 mM), kapasitasyon indüksiyonu için gerektiği gibi desteklenir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve konsantrasyonlar spesifik deneyler için değiştirilebilir. Ek olarak, CD yerine alternatif sterol alıcıları kullanılabilir (ör., sığır serum albümini veya yüksek yoğunluklu lipoproteinler).
2. İnce forseps kullanarak, yüzme toplama kabından herhangi bir epididimal dokuyu çıkarın. Sperm içeren ortamı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve süspansiyonu oda sıcaklığında sallanan bir kova rotorunda 1 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Plastik bir pipet kullanarak, spermi içeren MW süpernatanı, bu adımda peletlenecek herhangi bir brüt doku kalıntısından çıkarın.
3. Spermi içeren MW süpernatanı 37 ° C'de MW ekleyerek toplam 3 mL hacme getirin. Yuvarlak tabanlı bir tüpte 400 x g'da 8 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin. MW'nin süpernatantını gevşek peletlenmiş spermden yavaşça çıkarın.
4. Canlıysa, sperm "kabarık" görünümlü bir topak olarak görünmelidir. Spermi, büyük delikli bir transfer pipeti ile öğütme yoluyla veya tüpe hafif manuel dokunuşlarla ("parmak hareketi") nazikçe yeniden süspanse edin. Eşit şekilde yeniden süspanse edildikten sonra, bunları yeni bir yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. Hareketliliği saymak ve değerlendirmek için 10-20 μL sperm süspansiyonu kullanın. Kullanım için spermi MW cinsinden seyreltin.
   NOT: Fare sperm kapasitasyonunu içeren çoğu deney için, 5-10 milyon sperm / mL MW'lık bir nihai konsantrasyon kullanılır. Burada tarif edilen görüntüleme protokolü, spermin fizyolojik olarak ilgili akrozom ekzositozuna girme yeteneğini kazanması gerekmesine rağmen, spermin kapasitasyonunu gerektirmez. Spermi kapasitif hale getirmeden kalsiyum iyonofor gibi reaktifler yoluyla indüklenen patolojik ekzositoz veya ekzositoz incelenebilir. Ek olarak, çeşitli uyaranlara yanıt olarak kapasitif olmayan hücrelerde akrozomal kalsiyumdaki potansiyel değişiklikler araştırılabilir.
5. Spermi toplandıktan sonra 3-5 saat içinde kullanın, süreyi mümkün olduğunca kısa tutun ve deneysel denemeler arasında tutarlı olun.
6. Membran hasarını en aza indirecek yöntemler kullanarak MW ortamı kullanarak tüm toplama ve yıkama adımlarını 37 °C'de gerçekleştirin. Bu, prosedürün tüm aşamalarında kullanılması önerilen büyük delikli plastik transfer pipetlerinin veya büyük delikli pipet uçlarının kullanımını içerir.

2. Görüntüleme için lamel tabakların poli-D-lizin kaplaması

NOT: Poli-D-lizin (PDL) kapları her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.

1. Bir lamel kabının ortasına 0,5 μL'lik bir PDL damlası (0,5 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın.
2. 10 μL dereceli bir uç kullanarak, PDL damlacığını lamel boyunca sürün ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi çapraz desen).
3. 37 °C'de 10 dakika kurumaya bırakın. PDL kaplı tabakları kullanana kadar kapalı ve 37 °C'de tutun.

3. Kılcal çekme, şişirme için yükleme

1. Borosilikat cam kılcal damarları (OD, 2 mm, ID, 1.56 mm, Malzeme Tablosuna bakın) aşağıdaki ayarları kullanarak çekin: Isı: 330, Çekme: 250, Hız: 250 ve Zaman: 70. Bu adım, kullanımdaki belirli çektirme için optimize edilmelidir.
2. Her deneyden önce, uyarıcının konsantrasyonunun 3-5 katını içeren uyarıcı çözelti ile tek bir kılcal damar yükleyin (çözeltinin şişirildikten sonra hızlı difüzyonunu hesaba katmak için). Doldurmadan önce, kılcal ucu uçtan yaklaşık 1-2 mm uzakta kırmak için ince cımbız kullanın. Bu, ∼5 μm'lik bir açıklık çapı üretmelidir. Isı parlatma gerekli değildir.
3. İnce bir plastik transfer pipeti kullanarak, uyarıcı çözeltiyi, uzunluğunun dörtte üçü dolana kadar kılcal damara yavaşça enjekte edin.
4. Doldurma sırasında oluşan hava kabarcıklarını kılcal damarı hafifçe vurarak çıkarın.
5. Doldurulmuş kılcal damarı mikromanipülatöre monte edin (Malzeme Tablosuna bakın).

4. Şişirme için stimülasyon verilmesinin hazırlanması

NOT: Kullanıcının yaralanma riskini en aza indirmek için, şişirme prosedürünün çalışması sırasında koruyucu gözlük takılmalıdır.

1. Tek hücreli dağıtım sistemi ayarlarını 10 psi'de 5 s'lik bir darbe sağlayacak şekilde ayarlayın.
2. Borosilikat kılcalını tek hücreli dağıtım sistemi pipet tutucusuna bağlayın. Contaların sıkı olduğundan emin olun.
3. Kılcal ucu gözlemlerken, çözeltinin gerçekten ucun ucundan dağıtıldığından emin olmak için 2 psi'de 20 s'lik kısa bir nefes uygulayın (ucun ucunda küçük bir damla belirgin olmalıdır).

5. Mikroskopi ve görüntü elde etme

NOT: Birden fazla mikroskop markası mevcuttur ve kullanılabilir; Bununla birlikte, minimum 3 kare/sn kare hızı arzu edilir. Sıcaklık ve çevre kontrolü ile ilgili olarak, çanaktaki ortamın gerçek sıcaklığının, örneğin temassız bir kızılötesi termometre kullanılarak doğrulanması gerektiğini lütfen unutmayın.

1. Poli-D-lizin kaplı 35 mm'lik bir lamel kabının ortasına 80 μL seyreltilmiş sperm ekleyin. Fare sperm kapasitasyonunu içeren çoğu deney için, 5-10 milyon sperm / mL'lik bir nihai konsantrasyon kullanılır.
2. Sperme, 10 mM CaCl₂ ile desteklenmiş 3 mL ılık (37 ° C) MW baz ortamını yavaşça ekleyin.
   NOT: Hücresel süreçleri yavaşlatmak için oda sıcaklığında deneyler yapılabilir, ancak kapasitasyona lipid değişimleri ve mikro ve makro alanların akışkanlığı aracılık ettiğinden, fizyolojik olarak ilgili kapasitasyon ve akrozom ekzositozunun sıcaklığa bağlı süreçler olduğu akılda tutulmalıdır.
3. Çanağı sperm ile mikroskoba monte edin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış).
4. GCaMP3'ü 488 nm lazer çizgisi kullanarak heyecanlandırın ve 505-550 nm bant geçiren (BP) filtreyle görüntüleyin. 555 nm lazer çizgisi kullanarak mCherry'yi heyecanlandırın ve 575-615 nm BP filtresiyle görüntüleyin.
5. Bir mikromanipülatör kullanarak (manipülatörün mikroskobun kurulduğu hava tablasına takılması önerilir.), kılcal damarın ucunu yaklaşık 100 μm yana ve ilgilenilen hücrenin düzleminin 5-10 μm yukarısına yerleştirin.
   NOT: Uyarıcı çözeltiler, kılcal damar ve hücre arasındaki hacimde meydana gelen hızlı difüzyonu telafi etmek için normal konsantrasyonun 3-5 katında yapılır.
6. Mikroskopta görüntüleme dizisini başlatın.
7. Sperm hücrelerini yüksek kare hızında, tercihen >10 kare/sn'de görüntüleyin. Burada, 33 ms/karede görüntülemeyi sağlayan bir rezonans tarayıcı kullanıldı.
8. Mikroskopta görüntü alımını başlattıktan on saniye sonra, 10 saniyelik uyarıcı nefesini başlatmak için tek hücreli dağıtım sistemini etkinleştirin.
9. 10-15 dakikalık bir süre için görüntü hücreleri.
10. Tek hücreli dağıtım sistemini kullanarak, Şekil 1B'de verilen konumlara göre tek bir tabaktan birden fazla hücreyi görüntüleyin.
    NOT: Mikroskop altında tedavi edilmemiş/uyarılmamış spermler, yeşil sinyalin düşük yoğunluğu ile çoğunlukla kırmızı görünmelidir. Sperm başları lamel üzerine tutturulmalıdır ve canlı spermler hareketli kuyrukları ile tanımlanabilir. AE geçiren spermlerde, GCaMP3 yeşil sinyali başlangıçta artacak ve Şekil 2'de gösterildiği gibi AE tamamlandığında hem mCherry kırmızı sinyali hem de GCaMP3 yeşil sinyali kaybolacaktır. mCherry floresansının azaltılması, AE'nin başladığı zamanın daha spesifik bir göstergesini sağlar, çünkü Ca²⁺ konsantrasyonlarındaki değişiklikler sürekli olarak GCaMP3 floresan yoğunluğunda değişikliklere neden olacaktır.

6. Görüntü ve veri analizi

NOT: Çevrimdışı görüntü analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Daha önce, AE'ye yol açan süreçte akrozomal kalsiyum artışı (ACR) ve tam membran füzyonu dahil olmak üzere birkaç ara adım bildirilmişti. İkincisi, mCherry floresan kaybına yol açar ve bu nedenle tam AE'yi temsil eder. Bazı hücrelerde, ekzositoz çalışmalarında amperometrik yaklaşımlar kullanılırken başak öncesi ayak olaylarına (PSF) benzer sinyaller gözlenir (daha fazla ayrıntı için lütfen^{bkz. 2}). ACR, AE ve ara adımlarını ölçmek için AcroSensE ham verilerini analiz etmek için çeşitli isteğe bağlı yöntemler mevcuttur. Aşağıda bazı temel analitik yöntemler açıklanmaktadır.

1. Belirli mikroskop sistemi dosya uzantısına bağlı olarak, GCaMP3 > mCherry kanalları için ayrı pencereler oluşturmak üzere bölünmüş kanal aracını (Görüntü > Renkler ve Bölünmüş Kanallar) kullanın.
2. "Pencereyi Senkronize Et" aracını kullanarak tek tek pencereleri senkronize edin (Pencereleri Senkronize Et > > Araçlarını Analiz Et).
3. Akrozom bölgesini dahil etmek için kırmızı kanaldaki sperm başının etrafında bir ilgi alanı (ROI) seçin (Şekil 3A,B). Senkronizasyon aracı, aynı alan seçiminin, spermin hala görülemeyecek kadar loş olduğu yeşil kanala otomatik olarak uygulanmasını sağlar.
4. Floresan yoğunluğundaki değişimi iki kanalın her biri için karelerin/zamanın bir fonksiyonu olarak çizmek için "Z Profiler" eklentisini (Eklentiler > Yığınları > Z Profiler) veya "Zaman Serisi Çözümleyicisi" (Zaman Serisi Çözümleyicisi > Yığınları > Eklentileri) seçin.
5. Çizim ve daha fazla analiz için verileri bir elektronik tablo yazılımına (örneğin, Microsoft Excel) kopyalayın.
   NOT: Veriler bir elektronik tabloya kopyalandıktan sonra, Şekil 4'te gösterildiği gibi aşağıdakiler de dahil olmak üzere analiz için birden fazla parametre çıkarılabilir.
   1. Fusion Pore (FP) başlangıç zamanı: 0 zaman noktasından GCaMP3 sinyalinin yükselmeye başladığı zaman noktasına kadar geçen süreyi ölçün. Bu parametre, stimülasyon ile sperm ACR yanıtı arasındaki gecikmeyi gösterir.
   2. AE başlangıç zamanı: 0 zaman noktasından mCherry sinyalinin bozulmaya başladığı zaman noktasına kadar geçen süreyi ölçün. Bu parametre, stimülasyon ile sperm AE yanıtı arasındaki gecikmeyi gösterir. Bu parametre, FP oluşumu ile AE yanıtı arasındaki gecikmeyi hesaplamak için de kullanılabilir.
   3. Tepe FP genliği: floresan sinyalini tabandan GCaMP3 sinyal artışının zirvesine kadar ölçün. Bu parametre, ACR yanıtındaki toplam artışı gösterir.
   4. mCherry kayıp oranı: bu parametreyi mCherry sinyal kaybının kesitine doğrusal veya üstel bir uyumla belirleyin ( Şekil 4B'de "eğim" ile gösterildiği gibi).
      NOT: Alternatif olarak, çeşitli zaman noktalarında artık (R) sinyal yöntemiyle bozunma oranını belirleyin (örneğin, R60: mCherry sinyalinin taban çizgisinden% 60'lık bir artık sinyale saniye cinsinden süre). Bu parametre, akrozomal içeriğin AE üzerine dağılma hızını ölçmek için kullanılabilir.
   5. mCherry kaybı için sinyal azalması: temel mCherry floresan yoğunluğu ile AE'yi takip eden sinyal arasındaki genlik farkını belirleyin. Bu parametre, AE üzerine dağılmış toplam akrozomal içerik miktarını gösterir.
   6. Hem kırmızı hem de yeşil kanallar için floresanstaki (F) değişiklikleri ham veri olarak çizin veya bunları ilk floresan (F0) ile normalleştirin ve ΔF/F0 olarak ifade edin. İkincisi, tek bir grafikte hem kırmızı hem de yeşil renkteki değişikliklerin daha iyi görselleştirilmesini sağlar (örneğin, bkz. Şekil 3D ve Şekil 3H).
      NOT: Son olarak, akrozomal kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler ile AE arasındaki ilişkiyi belirlemek için ölçülen farklı parametreler farklı koşullar arasında karşılaştırılabilir. Çeşitli deneysel koşul karşılaştırmalarının örnekleri için referans^2'ye bakın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 2 , spermin başarılı bir şekilde uyarılmasını takiben beklenen floresan değişikliklerinin sırasını gösteren basitleştirilmiş bir resim sunmaktadır. Şekil 2'nin üst paneli, sinyalin başlangıçta loş olduğu (temel akrozomal kalsiyum konsantrasyonları GCaMP3 KD'den daha düşüktür) ve kalsiyum iyonlarının füzyon gözeneklerinden girmesi üzerine GCaMP3 floresan yoğunluğundaki değişiklikleri göstermektedir. Son olarak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye yol açan ara adımlar arasındaki etkileşimin gerçek zamanlı, tek hücreli izlenmesi ve analizi için yeni oluşturulan AcroSensE fare modelini kullanmak için mikroskopi tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme gibi hazır genetik yaklaşımlarla birlikte, bu model ve yöntem, kapasitasyon, AE ve döllenme ile ilgili sperm sinyal yollarında yer alan çeşitli bileşenlerin ve yolların rolünü incelemek ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III