Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) הוא חיישן ביולוגי חדשני המאפשר מדידה רציפה של רמות cAMP בתאים חיים. הביוסנסור נוצר מחלבון פלואורסצנטי בעל תמורות מעגליות המקושר לאזור הציר של Epac2. זה יוצר חיישן ביולוגי פלואורופור יחיד המציג פלואורסצנטיות מוגברת או מופחתת בעת קשירת cAMP. הביוסנסור קיים בגרסאות אדומות וירוקות כלפי מעלה, כמו גם בגרסאות ירוקות כלפי מטה, ובמספר גרסאות אדומות וירוקות הממוקדות למיקומים תת-תאיים. כדי להמחיש את יעילותו של הביוסנסור נעשה שימוש בגרסה הירוקה כלפי מטה, אשר פוחתת בפלואורסצנטיות בעת קשירת cAMP. שני פרוטוקולים המשתמשים בחיישן זה מודגמים: האחד משתמש בספקטרופוטומטר קריאת לוחות של 96 בארות התואם לסינון בתפוקה גבוהה והשני באמצעות הדמיה של תא בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקורא הצלחות, תאי HEK-293 שגודלו בתרבית בצלחות 96 בארות עוררו עם 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול, מה שגרם לירידות מהירות וגדולות בפלואורסצנטיות בגרסה הירוקה כלפי מטה. הביוסנסור שימש למדידת רמות cAMP בתאי שריר חלק של דרכי נשימה אנושיות בודדות (HASM) המנוטרות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הביוסנסור הירוק כלפי מטה הראה תגובות דומות לאוכלוסיות של תאים כאשר הוא מגורה באמצעות פורסקולין או איזופרוטרנול. בדיקה חד-תאית זו מאפשרת הדמיה של מיקום הביו-חיישן בהגדלה של פי 20 ו-40. לפיכך, חיישן ביולוגי cAMP זה רגיש וגמיש, ומאפשר מדידה בזמן אמת של cAMP הן בתאים אימורטליים והן בתאים ראשוניים, ועם תאים בודדים או אוכלוסיות של תאים. תכונות אלה הופכות את cADDis לכלי רב ערך לחקר דינמיקת איתות cAMP בתאים חיים.

Introduction

אדנוזין 3′,5′-מונופוספט מחזורי, cAMP, ממלא תפקיד מרכזי בתקשורת התאית ובתיאום תהליכים פיזיולוגיים שונים. cAMP פועל כשליח שני, ומעביר אותות חיצוניים מהורמונים, מוליכים עצביים או מולקולות חוץ-תאיות אחרות כדי ליזום שרשרת של אירועים תוך-תאיים1. יתר על כן, cAMP מעורב באופן מורכב במסלולי איתות שונים, כולל אלה הקשורים לקולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) וציקלזות אדניליל. הבנת התפקיד של cAMP באיתות תאי היא בסיסית לפענוח המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס תפקודים תאיים נורמליים ופיתוח טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מצבים רפואיים2.

בעבר ננקטו שיטות שונות למדידת cAMP במישרין או בעקיפין. אלה כללו תיוג רדיואקטיבי של מאגרי ATP תאיים ולאחר מכן טיהור עמודות, HPLC, בדיקות רדיואימוניות ובדיקות חיסוניות הקשורות לאנזימים 1,2. מבחני מורשת אלה מוגבלים על ידי העובדה שהם מדדי נקודת קצה, הדורשים מספר רב של דגימות כדי לבנות תגובות תלויות זמן. לאחרונה פותחו חיישני העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי ליצור בדיקות בתאים חיים, לייצר נתונים דינמיים בזמן אמת ולאפשר מיקוד חיישנים במקומות תת-תאיים שונים3. FRET ממנף שני פלואורופורים, תורם פלואורסצנטי אחד ומקבל פלואורסצנטי אחד שכאשר הוא נמצא בקרבת מקום, פלואורופור המקבל יתרגש מפלט הפלואורסצנט של התורם. שני הפלואורופורים הנפוצים ביותר הם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מכיוון שיש להם תכונות עירור ופליטה תואמות. בנוסף ל-CFP ול-YFP, השימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) ובחלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP) משמש בדרך כלל עבור ביו-חיישנים של FET. חיישנים ביולוגיים של cAMP FRET פועלים על ידי תורם ומקבל בקצוות מנוגדים של חלבון הקישור של Epac2 cAMP. כריכת cAMP משנה את האישור של Epac ומגדילה את המרחק בין פלואורופוריםשל תורם ומקבל 3,4. שינוי קונפורמטיבי זה מזוהה על ידי אובדן של FRET, כלומר, עירור של פלואורופור מקבל על ידי אנרגיה המועברת מן טיפות פלואורופור התורם3. בעוד תהליך פשוט לכאורה, יש שפע של מגבלות ובעיות עם biosensor FRET עבור מחקר cAMP5. אחד מהם הוא הבחירה של חלבונים פלואורסצנטיים, למשל, GFP, אשר יכול dimerize באופן טבעי, ובכך להפחית את הרגישות6. ביו-חיישנים מבוססי CFET cAMP כוונו למיקרו-דומיינים ספציפיים7, אך ייתכנו מגבלות בשל גודלו הגדול של מבנה עם שני פלואורופורים6. בעיה משמעותית נוספת היא יחס האות לרעש הנמוך של אותות FRET כתוצאה מהחפיפה בין עירור ופליטה של הפלואורופור, וכתוצאה מכך תדירות דגימה גבוהה וניתוח מסובך של התוצאות 4,5.

לאחרונה, biosensor החדש (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis פתר מגבלות אלה ואחרות כשמדובר בחקר הרגולציה של איתות cAMP8. שיפור חשוב אחד הוא התלות בפלואורופור יחיד. הדבר מאפשר אות מהיר ויעיל עם טווח דינמי רחב יותר ויחס אות לרעש גבוה. כתוצאה מכך, יכול להיות דיוק רב יותר מכיוון שיש טווח פחות רחב של אורכי גל לסרוק דרך8. בדומה לגשושיות RET, הביו-סנסור כוון למיקומים תת-תאיים, מה שמאפשר מחקר בתיאוריית המידור וחקר רפסודות שומנים ולא רפסודות, ותחומים תת-תאיים אחרים9. אולי החשוב ביותר הוא ההתאמה של biosensor פלואורופור יחיד עבור סינון תפוקה גבוהה, אשר שיפר את הרגישות ואת יכולת השחזור על פני biosensors מבוסס FRET. הביוסנסור ארוז לתוך וקטור BacMam להתמרה קלה של מגוון רחב של סוגי תאים ושליטה מדויקת על ביטוי חלבונים.

בקרת ביטוי באמצעות וקטור BacMam יכולה להיות שימושית במיוחד בבדיקות באמצעות אורתולוגים GPCR ממינים שונים כדי להקל על פירוש נתונים ממחקרים בבעלי חיים. יתר על כן, שליטה על ביטוי הקולטן היא קריטית למדידת דרגות שונות של יעילות התרופה (למשל, אגוניסטים הפוכים ואגוניסטים חלקיים), ורמות נמוכות של ביטוי קולטן שימושיות כדי לחקות את הרמות הנמוכות הנמצאות ברקמת בעלי חיים. BacMam הוא וקטור baculovirus כי כבר שונה כדי להתמיר תאים יונקים כגון תרביות תאים ראשוניים HEK-293 שורות10. סמנים דומיננטיים הניתנים לבחירה מאפשרים ל- BacMam לספק יציבות רבה יותר על פני זיהומי פלסמיד מסורתיים11. מקדמים סלקטיביים כאלה מאפשרים העברה וביטוי גנים יעילים יותר. בנוסף, הוספת טריכוסטטין A (מעכב היסטון דאצטילאז) משפרת את רמות החלבון11. ניתן לשלוט ברמות הביטוי באמצעות הטיטר של וירוס BacMam המשמש ויש להתאים אותו לכל סוג תא. במקרה של ביוסנסור זה, חלבון פלואורסצנטי אדום או ירוק מקושר ל- Epac ב- N- ו- C-termini. כאשר cAMP נקשר, שינוי קונפורמטיבי בחיישן הביולוגי מזיז חומצות אמינו הסמוכות לחלבון הפלואורסצנטי. שינוי כזה מעביר את הספיגה מהמצב האניוני למצב הניטרלי ב-400 ננומטר, ובכך מקטין את הפלואורסצנטיות.

ישנם 90-120 GPCRs המבוטאים בתא בודד המגיבים למגוון רחב של אותות נוירוהומורליים12. לכן, ניתן לשער כי לפחות כמה עשרות GPCRs לכל תא יכולים לעורר או לעכב cAMP באמצעות צימוד Gs או Gi, בהתאמה. אמנם חלה התקדמות בניטור שליח שני זה בזמן אמת, כגון FRET, אך יש צורך בשיטות יעילות יותר. המתודולוגיה לניטור הסינתזה וההשפלה של אותות cAMP באמצעות cADDis בזמן אמת מוצגת כאן. ניתן לנטר את השינוי בפלואורסצנטיות בזמן אמת באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי למבחני תפוקה גבוהה או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לבדיקות חד-תאיות. שיטות אלה שימושיות למגוון רחב של שאלות ביולוגיות בנוגע לאיתות GPCR באמצעות cAMP.

Protocol

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בדיקת ספקטרופוטומטר לקריאת לוחות בתפוקה גבוהה

  1. זריעת תאי HEK-293 עם וקטור cADDis BacMam בצלחת 96 בארות (יום 1)
    1. לפצל ולהדביק תאים במכסה מנוע נגיפי.
      1. חומרי HEK חמים (טבלה 1) ו-0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
      2. יש לחטא את מכסה המנוע ואת החומרים על ידי ניגובם ברקמות ספוגות EtOH.
      3. מוציאים ומשליכים מדיה HEK מהבקבוק עם פיפטה סרולוגית.
      4. הוסף 5 מ"ל של Mg2+ ו- Ca2+ DPBS חופשי (37 ° C) עם פיפטה סרולוגית. הטה את הבקבוק קדימה ואחורה כדי לשטוף את התחתית עם DPBS. יש להסיר ולהשליך DPBS בעזרת פיפטה סרולוגית.
      5. טריפסיניזציה של התאים על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% מחומם טריפסין-EDTA עם פיפטה סרולוגית. הטה את הבקבוק כדי להבטיח שהמגיב מצפה באופן מלא את תחתית הצלוחית. שים את המכסה על הבקבוק ולתת מגיב לשבת במשך 3-5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מן הצלוחית.
        הערה: ניסוי זה ממוטבעבור 2 צלוחיות בגודל 75 ס"מ; ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות נפח עבור ריאגנטים אם נעשה שימוש במנגנון תרבית בגודל שונה.
      6. צייר 5 מ"ל של מדיה טרייה המכילה אנטיביוטיקה. לגרש ולצייר את נפח הבקבוק כדי לשטוף את הקירות של הבקבוק פיזית לנתק תאים.
      7. אסוף את הנפח הכולל של הבקבוק (8 מ"ל), והצנטריפוגה (25 ° C) בצינור 15 מ"ל ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
      8. לאחר הצנטריפוגה, מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית, נזהרים שלא להפריע לכדור.
      9. כדי לשטוף את התאים מבלי להפריע לכדור, הוסף 500 μL של DPBS ללא Mg2+ ו- Ca2+ DPBS לצד הצינור של 15 מ"ל. לאחר הוספה עדינה של ה-DPBS, יש להסיר ולהשליך חיץ רב ככל האפשר מבלי להפריע לכדור. חזור על הפעולה פעם נוספת.
      10. ספור את התאים והתאם לצפיפות תאים של 250,000 תאים/מ"ל תאים.
      11. הכינו תערובת מאסטר המבוססת על נפחי הריאגנט הדרושים לכל באר של צלחת תחתונה שחורה ושקופה בעלת 96 בארות. זה נקרא "צלחת רקמות". ראה כרכים בהמשך:
        הערה: דוגמה של באר אחת (נפח כולל 200 μL): 40 μL של וקטור BacMam biosensor (מלאי של 2 x10 10 גנים נגיפיים /mL), 2 μL trichostatin A (מלאי של 100 μM; ריכוז סופי 1 μM), 158 μL של 250,000 תאים / mL צפיפות התא. דוגמה של 10 בארות (נפח כולל 2 מ"ל): 400 μL של וקטור biosensor BacMam (מלאי של 2 x10 10 גנים נגיפיים /mL), 20 μL של trichostatin A (מלאי של 100 μM), מדיה 1,580 μL עם 250,000 תאים / mL צפיפות התא.
      12. מוסיפים 200 μL של תערובת מאסטר לכל באר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 באינקובטור במשך 24 שעות לפני שתרוצו על ספקטרופוטומטר קריאת הצלחות.
  2. פועל על קורא צלחות
    1. על ספסל, בזהירות להסיר את כל המדיה בכל באר ולהחליף עם 180 μL של DPBS עם Mg2+ ו Ca2+ ב 37 ° C.
    2. בדוק תאים במיקרוסקופ כדי לאשר את בריאות התא.
    3. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות-שעה אחת.
    4. בזמן הדגירה, להכין את התרופות לקריאה בדילול 1:10 (המכונה גם פי 10) עבור המינון הסופי הרצוי. לכן, להכין 100 μM forskolin ו 100 nM isoproterenol.
    5. הוסף 60 μL של כל תרופה בצורה עמודית לצלחת שקופה של 96 בארות (המכונה "צלחת התרופה").
      הערה: עם דילול התרופה הנכון וכדי לייעל את הקריאה, התרופות מתווספות לצלחת שקופה של 96 בארות, המכונה "צלחת התרופה", שתועבר בזמן הקריאה ל"צלחת הרקמה" באמצעות פיפטור 96-multi, מה שמאפשר להוסיף את התרופה לכל הבארות בו זמנית ולהיקרא במהירות על ידי ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי.
  3. הגדרת קורא לוחות פלואורסצנטי
    1. התאם את ההגדרות של קורא לוחות הפלואורסצנציה.
      1. מצב קריאה: פלואורסצנטיות. סוג קריאה: קינטי. אורכי גל קוראים: 494 ננומטר ו-522 ננומטר.
      2. זמן קריאה: הזן 3 דקות לקריאת הפלורסנט הבסיסית ו-7 דקות לתוספת שלאחר התרופה". מרווח" מוזן כ- 00:00:30 למשך 30 שניות בין כל קריאה.
        הערה: ניתן למטב ולהגדיל את זמן הקריאה בהתאם לזמן הנדרש.
  4. איסוף נתונים
    1. מוציאים את לוחית הרקמה מהאינקובטור, מסירים את רדיד האלומיניום ואת מכסה הצלחת ומניחים את לוחית הרקמה בקורא הלוחות. סגור את מגירת הקורא כדי לאפשר ללוח הטישו לנוח ולהתאזן לטמפרטורת הקורא (37 מעלות צלזיוס).
    2. מניחים את הצלחת השקופה של 96 בארות (צלחת סמים) עם דילול התרופה מתחת לפיפטה 96-multi ומתרגלים שאיבת 20 μL מהבארות. ודא כי יש נפח שווה של התרופה נמשך קצות פיפטור.
    3. התחל ריצת מדידה "בסיסית".
      הערה: 40 RFU ומעלה נחשבים לנתונים בני קיימא. אם הנתונים נמוכים מערך זה, יש לעצור את הניסוי ולהשליכו.
    4. לוחית הרקמה תיפלט מהקורא בסוף ריצת קו הבסיס. במהירות ובזהירות להוסיף 20 μL מן צלחת התרופה שקופה צלחת רקמה שחורה. לאחר מכן, התחל במהירות את ריצת "הטיפול". צלחת הרקמה לא צריך להיות מחוץ לקורא במשך יותר מ -30 שניות לאחר הוספת תרופות.
      הערה: אם מוסיפים את התרופה מהר מדי, התאים מתנתקים מצלחת הרקמה, ויוצרים ניסוי בלתי שמיש. בנוסף, התאים נגועים בחלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש לאור; לכן, הוספה מהירה ומהירה של התרופות ותחילת הקריאה השנייה היא הכרחית כדי לא לפספס את החלק הראשון של התגובה.
    5. לאחר השלמת הקריאה השנייה, ודא כי לוחית הרקמה נפלטת מהקורא ואיסוף הנתונים מסתיים.
      הערה: לפני השלכת צלחת הרקמה, מומלץ לוודא שהתאים עדיין מחוברים לצלחת. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ. אם התאים מתנתקים, התוצאות אינן חוקיות ויש להשליכן. יהיה צורך לחזור על הניסוי.
    6. יצא את הנתונים המתקבלים כקובץ Excel.
    7. פתח את הנתונים הקריאים המיוצאים של Excel מקורא הלוחות והעתק והדבק מידע רלוונטי לתוך תבנית ההמרה של Excel. הנתונים יהפכו מקורא הלוחות המוגדר לקריאה בודדת של עמודות מימין לנתונים המועתקים.
      הערה: עמודות פלואורסצנטיות עבור באר לאורך זמן רשומות ב- RFUs (שכותרתו טרנספורמציית עמודה) וכשינוי עשרוני ביחס לקריאת RFU בקריאה הראשונית (t0 שכותרתו דלתא F). בתבנית Excel, טבלת Delta F מוגדרת לקריאה הבסיסית האחרונה לפני הוספת תרופות. זוהי נקודת איסוף הנתוניםהשישית .
    8. לאחר המרת הנתונים, העתק את הנתונים מדלתא F והדבק אותם בתוכנת ניתוח נתונים כדעיכה או דעיכה יחסית בפלואורסצנטיות לאורך זמן.
    9. שנה את כותרת X ל- "time (s)" ואת כותרת Y ל- "ΔF/F0" עבור ערכים עשרוניים יחסיים.

2. בדיקת תא בודד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך

  1. תאי זריעה (HASM) עם וקטור cADDis BacMam בצלחת 35 מ"מ (יום 1)
    1. לפצל ולהדביק תאים במכסה מנוע נגיפי.
      1. חומרי HASM חמים (טבלה 1), 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
      2. יש לחטא את מכסה המנוע ואת החומרים ולנגב את מכסה המנוע ברקמות ספוגות EtOH.
      3. מוציאים ומשליכים מדיית HASM מהבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגית.
      4. הוסף 5 מ"ל של Mg2+ ו- Ca2+ DPBS חופשי (37 ° C) עם פיפטה סרולוגית חדשה והטה את הבקבוק כדי לשטוף את התחתית עם DPBS.
      5. טריפסיניזציה של תאים על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% מחומם טריפסין-EDTA עם פיפטה סרולוגית. הטה את הבקבוק כדי להבטיח שהמגיב מצפה באופן מלא את תחתית הצלוחית. תן מגיב לשבת במשך 3-5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מן הצלוחית.
      6. צייר 5 מ"ל של מדיה טרייה המכילה אנטיביוטיקה ולגרש את פיפטה כדי להסיר את התאים מתחתית הצלוחית.
      7. אסוף את הנפח הכולל של צנטריפוגת הבקבוק (8 מ"ל) בצינור צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
      8. לאחר הצנטריפוגה, מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית, נזהרים שלא להפריע לכדור.
      9. מבלי להפריע לכדור, הוסף 500 μL של DPBS ללא Mg2+ ו- Ca2+ DPBS לצד צינור הצנטריפוגה. מוציאים ומשליכים כמה שיותר נוזלים וחוזרים על הפעולה פעם נוספת.
        הערה: ניסוי זה ממוטבעבור 2 צלוחיות בגודל 75 ס"מ; ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות נפח עבור ריאגנטים אם נעשה שימוש במנגנון תרבית בגודל שונה.
      10. ספור תאים והתאם לצפיפות תאים של 40,000 תאים/מ"ל.
      11. הכינו תערובת מאסטר המבוססת על נפח המגיב הדרוש לכל באר של צלחת 35 מ"מ. ראה כרכים בהמשך:
        הערה: דוגמה של באר 1 (נפח כולל 500 μL): 20 μL של וקטור BacMam biosensor (מלאי של 2 x10 10 גנים נגיפיים /mL), 5 μL trichostatin A (מלאי של 100 μM, ריכוז סופי 1 μM), 500 μL של 40,000 תאים / mL צפיפות התא. דוגמה עבור 4 בארות (נפח כולל 2 מ"ל): 80 μL של biosensor וקטור BacMam (מלאי של גנים נגיפיים /mL), 20 μL של trichostatin A (מלאי של 100 μM, ריכוז סופי 1 μM), 2000 μL מדיה 40,000 תאים / mL צפיפות התא.
      12. מוסיפים 500 μL של תערובת מאסטר לכל באר. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 24 שעות לפני המשך הניסוי.
        הערה: מספר התא עשוי להשתנות בהתאם לקו התא. כדי להימנע מתאים חופפים עבור הניתוח, השתמש במספרי תאים נמוכים.
  2. הכנת חומרים פרמקולוגיים (יום 2)
    1. בזהירות להסיר את המדיה בכל באר ולהחליף עם 450 μL של DPBS עם Mg2+ ו Ca2+ ב 37 ° C.
    2. עטפו את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרו על דיסקת 35 מ"מ בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות-שעה אחת.
    3. בדוק תאים במיקרוסקופ כדי לאשר את בריאות התא.
    4. בינתיים, הכינו את התרופות לקריאת יחידת יומן 1 מעל הריכוז הסופי הרצוי (פי 10). לכן, להכין 100 μM forskolin ו 100 nM isoproterenol.
    5. עבור titers מינון יומן, להכין את התרופה ב 10 mM ולהשתמש דילולים סדרתיים כדי להשיג 100 μM של forskolin ו 100 ננומטר של isoproterenol.
  3. איסוף נתונים
    הערה: ההגדרות הבאות הן עבור מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי. התוכנה המלווה כל מיקרוסקופ יכולה להיות שונה; ההגדרות הכלליות המשמשות בפרוטוקול הנוכחי מתוארות כאן.
    1. הפעל את הרכזת המרכזית, ולאחר מכן את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך.
    2. פתח את התוכנה שתשמש ללכידה ובחר באפשרות לכידת קיטועי זמן .
    3. מניחים מחזיק דגימת צלחת 35 מ"מ בשלב המיקרוסקופ.
    4. הגדר עדשה אובייקטיבית ל - x20.
    5. השתמש במיקוד אוטומטי וקבל תמונה ברורה ככל האפשר. אם קשה למצוא תאים בודדים, התחל במטרה 4x ולאחר מכן עבור ל- 20x. מקדו את הדגימה באופן ידני אם במיקרוסקופ חסרה תכונת מיקוד אוטומטי.
      הערה: ניתן להשתמש בהגדלה של 40x אם יש צורך בפירוט מורפולוגי משמעותי יותר של התא.
    6. התאם את ההגדרות הבאות לקבלת איסוף נתונים מיטבי: בהירות אוטומטית (חשיפה), אורך גל עירור, איזון שחור (להפחתת רעשי רקע), מיקוד אוטומטי.
    7. לאחר מציאת אזור ראייה עם מספר תאים פלואורסצמיים ציטופלזמיים, רכוש נתונים באמצעות לכידת קיטועי זמן למשך 20 דקות כל 30 שניות.
    8. לחץ על Go כדי להתחיל את הקריאה.
    9. הפעל במשך 3 דקות כדי לאסוף את קו הבסיס. ברגע 3 דקות ללכוד נלקח, בעדינות להוסיף 50 μL של התרופה לבאר המתאימה. כאשר התרופות מתווספות, הריכוז הסופי על המנה יהיה 10 μM forskolin ו 10 ננומטר של isoproterenol.
      הערה: יש להוסיף את התרופה בזהירות; אין לגעת בצלחת עם קצה הפיפטה, מכיוון שהדבר עלול להזיז את שדה הראייה שנוצר ולהפוך את הדגימה לבלתי ניתנת לניתוח.
    10. השאר את הניסוי לרוץ במשך 17 דקות נוספות עם לכידת נתונים כל 30 שניות.
    11. לאחר השלמת הבדיקה, ודא שהנתונים מוכנים לניתוח.
      הערה: בעוד שהפרוטוקול הנוכחי אינו כולל בקרה על סחף מוקדי, זה יכול להיות מועיל לכלול אחד בניסוי. לדוגמה, השימוש בצבעים גרעיניים יכול לסייע בניהול סחף מוקד במהלך ניתוח מיקרוסקופ, במיוחד בעת לכידת תמונות של תאים חיים לאורך פרקי זמן ממושכים. חיישנים ביולוגיים של cADDis מפוזרים בדרך כלל באופן נרחב בתוך התא, מה שהופך מישור מוקד רחב ללכידה היעילה ביותר ומפחית את הצורך בשליטה על סחף מוקד9.
  4. ניתוח הנתונים
    הערה: התוכנה המלווה כל מיקרוסקופ יכולה להיות שונה, ולכן ההגדרות הכלליות שיש להשתמש בהן כדי לנתח את התמונות שצולמו מתוארות כאן.
    1. פתח את קובצי התמונה שצולמו במהלך הניסוי.
    2. השתמש בכלי מצולע או עיגול כדי לבחור את אזור העניין של כל תא לביצוע הניתוח. הניתוח צריך לתת את הבהירות של כל תא בכל נקודת זמן.
      הערה: שיטת העבודה המומלצת היא לבחור תאים בודדים ולא תאים הנוגעים בדופן הצלחת או תאים אחרים. זה מבטיח את איסוף הנתונים הטוב ביותר האפשרי. בחר מינימום של 5 תאים לניתוח בתוך כל תנאי, ושכפל את הניסוי לפחות שלוש פעמים.
    3. לאחר ניתוח הנתונים, פתח את הנתונים בגיליון אקסל וחשב את הבהירות הממוצעת עבור כל מצב בכל תמונה, החל מהתמונה ממש לפני הוספת החומרים הפרמקולוגיים או הרכב. בדוגמה זו, בסימן 3 דקות או בתמונההשישית שצולמה במיקרוסקופ, מכיוון שכל תמונה מצולמת כל 30 שניות.
    4. חשב ΔF/F0 עבור כל ערך ממוצע בכל תנאי.
    5. טען לתוך תוכנת ניתוח סטטיסטי והתווה ΔF/F0 כנגד הזמן ב- s.
      הערה: איור 1 מספק סקירה סכמטית של השלבים העיקריים של הפרוטוקולים.

תוצאות

המחקר הנוכחי אימת את הביוסנסור הציטוסולי הן בקורא לוחות והן במבחני מיקרוסקופ. ברגע שהתאים ביטאו את הביו-סנסור, הם עוררו באמצעות 10 מיקרומטר פורסקולין (מפעיל ישיר של ציקלז אדניליל), איזופרוטרנול 10 ננומטר (אגוניסט ב-ß1AR ו-ß2AR), או רכב (איור 1). השינויים הבאים בפלואורס?...

Discussion

מדידה מדויקת ורגישה של cAMP חיונית להבנת תפקידו בתהליכים תאיים שונים ולחקר הפעילות של מסלולי איתות תלויי cAMP. ישנן מספר שיטות נפוצות למדידת רמות cAMP, כולל ELISA, radioimmunoassay, חיישנים ביולוגיים של FRET ובדיקת cAMP של GloSensor 14,15,16,17,18.<...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI) (HL169522).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate Corning3904Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscopeKeyence
Calcium chloride (IM)Quality Biological IncE506For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+ Gibco14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+Corning14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D systemsS11195For HEK and HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham's F-12K Gibco21127022For HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080For HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Drug
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotic for HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagent
Sodium hydroxide solutionSigmaS2770For HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagent
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagent

References

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CAMP BiosensorCADDisEpac2CAMP DynamicsHEK 293HASM96CAMP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved