Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada sunulan protokol, cAMP Fark Dedektörünün In Situ olarak cAMP ölçümündeki etkinliğini iki yöntemle göstermektedir. Bir yöntem, HEK-293 hücreli 96 oyuklu bir plaka okuma spektrofotometresi kullanır. Diğer yöntem, bir floresan mikroskobu altında tek tek HASM hücrelerini gösterir.

Özet

cAMP Fark Dedektörü In Situ (cADDis), canlı hücrelerde cAMP seviyelerinin sürekli olarak ölçülmesini sağlayan yeni bir biyosensördür. Biyosensör, Epac2'nin menteşe bölgesine bağlı dairesel olarak permütasyonlu bir floresan proteinden oluşturulur. Bu, cAMP'nin bağlanması üzerine artan veya azalan floresan gösteren tek bir florofor biyosensörü oluşturur. Biyosensör, kırmızı ve yeşil yukarı doğru versiyonların yanı sıra yeşil aşağı versiyonlarda ve hücre altı konumları hedefleyen birkaç kırmızı ve yeşil versiyonda bulunur. Biyosensörün etkinliğini göstermek için, cAMP bağlanması üzerine floresan olarak azalan yeşil aşağı doğru versiyon kullanıldı. Bu sensörü kullanan iki protokol gösterilmiştir: biri yüksek verimli tarama ile uyumlu 96 oyuklu bir plaka okuma spektrofotometresi kullanır ve diğeri floresan mikroskopta tek hücreli görüntüleme kullanır. Plaka okuyucuda, 96 oyuklu plakalarda kültürlenen HEK-293 hücreleri, 10 μM forskolin veya 10 nM izoproterenol ile uyarıldı, bu da yeşil aşağı doğru versiyonda floresanda hızlı ve büyük düşüşlere neden oldu. Biyosensör, floresan mikroskobu altında izlenen bireysel insan hava yolu düz kas (HASM) hücrelerindeki cAMP seviyelerini ölçmek için kullanıldı. Yeşil aşağı doğru biyosensör, forskolin veya izoproterenol ile uyarıldığında hücre popülasyonlarına benzer tepkiler gösterdi. Bu tek hücreli tahlil, biyosensör konumunun 20x ve 40x büyütmede görselleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, bu cAMP biyosensörü hassas ve esnektir, hem ölümsüzleştirilmiş hem de birincil hücrelerde ve tek hücrelerde veya hücre popülasyonlarında cAMP'nin gerçek zamanlı ölçümüne izin verir. Bu özellikler, cADD'yi canlı hücrelerde cAMP sinyal dinamiklerini incelemek için değerli bir araç haline getirir.

Giriş

Adenozin 3',5'-siklik monofosfat, cAMP, hücresel iletişimde ve çeşitli fizyolojik süreçlerin koordinasyonunda merkezi bir rol oynar. cAMP, hücre içi olaylar dizisi başlatmak için hormonlardan, nörotransmiterlerden veya diğer hücre dışı moleküllerden gelen dış sinyalleri ileten ikinci bir haberci görevi görür1. Ayrıca, cAMP, G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) ve adenilil siklazlar ile ilişkili olanlar dahil olmak üzere çeşitli sinyal yollarında karmaşık bir şekilde yer alır. cAMP'nin hücresel sinyallemedeki rolünü anlamak, normal hücresel fonksiyonların altında yatan karmaşık mekanizmaların çözülmesi ve çok çeşitli tıbbi durumlar için potansiyel tedavilerin geliştirilmesi için esastır2.

Geçmişte, cAMP'yi doğrudan veya dolaylı olarak ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Bunlar, hücresel ATP havuzlarının radyo-etiketlenmesini ve ardından kolon saflaştırma, HPLC, radyoimmünoassay ve enzime bağlı immünolojik testleriiçeriyordu 1,2. Bu eski tahliller, zamana bağlı yanıtlar oluşturmak için çok sayıda numune gerektiren son nokta ölçümleri olmaları gerçeğiyle sınırlıdır. Daha yakın zamanlarda, canlı hücrelerde tahliller oluşturmak, gerçek zamanlı, dinamik veriler üretmek ve sensörlerin farklı hücre altı konumlarda hedeflenmesine izin vermek için Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) sensörleri geliştirildi3. FRET iki florofor, bir floresan donörü ve bir floresan alıcısı kullanır, bu da yakın olduğunda, alıcı florofor donör floresan çıkışı tarafından uyarılır. En çok kullanılan iki florofor, camgöbeği floresan proteini (CFP) ve sarı floresan proteinidir (YFP), çünkü bunlar uyumlu uyarma ve emisyon özelliklerine sahiptir. CFP ve YFP'ye ek olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ve kırmızı floresan proteininin (RFP) kullanımı FRET biyosensörleri için yaygın olarak kullanılmaktadır. cAMP FRET biyosensörleri, Epac2 cAMP bağlayıcı proteinin zıt uçlarında bir verici ve alıcıya sahip olarak çalışır. cAMP bağlanması, Epac'ın onayını değiştirir ve verici ile alıcı floroforlar 3,4 arasındaki mesafeyi artırır. Bu konformasyonel değişiklik, bir FRET kaybı, yani alıcı floroforun donör florofor damlalarından3 aktarılan enerji ile uyarılması ile tespit edilir. Görünüşte basit bir süreç olsa da, cAMP araştırması için FRET biyosensörüyle ilgili çok sayıda sınırlama ve sorun vardır5. Bunlardan biri, floresan proteinlerin, örneğin doğal olarak dimerize olabilen ve böylece hassasiyeti azaltabilen GFP'nin seçimidir6. FRET tabanlı cAMP biyosensörleri belirli mikro alanlara7 hedeflenmiştir, ancak iki floroforlu bir yapının büyük boyutu nedeniylesınırlamalar olabilir 6. Bir diğer önemli konu, floroforun uyarılması ve emisyonu arasındaki örtüşmeden kaynaklanan FRET sinyallerinin düşük sinyal-gürültü oranıdır, bu da yüksek örnekleme frekansı ve sonuçların analizini zorlaştırır 4,5.

Son zamanlarda, yeni biyosensör (cAMP Fark Dedektörü In Situ), cADDis, cAMP sinyalizasyonunun düzenlenmesi söz konusu olduğunda bu ve diğer sınırlamaları çözdü8. Önemli bir gelişme, tek bir florofora bağımlılıktır. Bu, daha geniş bir dinamik aralık ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile hızlı ve verimli bir sinyal sağlar. Sonuç olarak,8'i taramak için daha az geniş bir dalga boyu kapsamı olduğundan daha fazla doğruluk olabilir. FRET probları gibi, biyosensör de hücre altı konumlara hedeflenmiştir, bu da lipit sallarında ve sal olmayanlarda ve diğer hücre altı alanlarda bölmeli teori araştırmalarına ve keşiflerine izin vermiştir9. Belki de en önemlisi, FRET tabanlı biyosensörlere göre daha iyi hassasiyet ve tekrarlanabilirliğe sahip olan yüksek verimli tarama için tek bir florofor biyosensörünün uygunluğudur. Biyosensör, çok çeşitli hücre tiplerinin kolay transdüksiyonu ve protein ekspresyonu üzerinde hassas kontrol için bir BacMam vektörüne paketlenmiştir.

BacMam vektörü aracılığıyla ekspresyon kontrolü, hayvan çalışmalarından elde edilen verilerin yorumlanmasını kolaylaştırmak için farklı türlerden GPCR ortologları kullanılarak yapılan tahlillerde özellikle yararlı olabilir. Ayrıca, reseptör ekspresyonu üzerindeki kontrol, farklı ilaç etkinliği derecelerini ölçmek için kritik öneme sahiptir (ör., ters agonistler ve kısmi agonistler) ve düşük reseptör ekspresyonu seviyeleri, hayvan dokusunda bulunan düşük seviyeleri taklit etmek için yararlıdır. BacMam, birincil hücre kültürleri ve HEK-293 hatları10 gibi memeli hücrelerini dönüştürmek için modifiye edilmiş bir bakulovirüs vektörüdür. Baskın seçilebilir belirteçler, BacMam'ın geleneksel plazmit enfeksiyonlarına göre daha fazla stabilite sağlamasına izin verir11. Bu tür seçici promotörler, daha verimli gen iletimi ve ekspresyonuna izin verir. Ek olarak, trikostatin A (bir histon deasetilaz inhibitörü) eklemek, raportör protein seviyelerini11 arttırır. Ekspresyon seviyeleri, kullanılan BacMam virüsünün titresi ile kontrol edilebilir ve her hücre tipi için optimize edilmelidir. Bu biyosensör durumunda, kırmızı veya yeşil bir floresan protein, N- ve C-terminallerinde Epac'a bağlanır. cAMP bağlandığında, biyosensördeki konformasyonel bir değişiklik, floresan proteine bitişik amino asitleri hareket ettirir. Böyle bir kayma, absorbansı anyonik durumdan 400 nm'de nötr duruma hareket ettirir ve böylece floresansı azaltır.

Çok çeşitli nörohumoral sinyallere yanıt veren tek bir hücrede eksprese edilen 90-120 GPCR vardır12. Bu nedenle, hücre başına en az birkaç düzine GPCR'nin, sırasıyla Gs veya Gi eşleşmesi yoluyla cAMP'yi uyarabileceği veya inhibe edebileceği varsayılabilir. Bu ikinci haberciyi FRET gibi gerçek zamanlı olarak izlemede ilerleme kaydedilmiş olsa da, daha verimli yöntemlere ihtiyaç vardır. cADDis kullanarak cAMP sinyallerinin sentezini ve bozunmasını gerçek zamanlı olarak izleme metodolojisi burada sunulmaktadır. Floresanstaki değişiklik, yüksek verimli deneyler için bir floresan plaka okuyucu veya tek hücreli deneyler için bir floresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bu yöntemler, cAMP aracılığıyla GPCR sinyalizasyonu ile ilgili çok çeşitli biyolojik sorular için kullanışlıdır.

Protokol

Çalışma için kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Plaka okuma spektrofotometresi yüksek verimli tahlil

  1. HEK-293 hücrelerinin cADDis BacMam vektörü ile 96 oyuklu bir plakada tohumlanması (1. Gün)
    1. Hücreleri bir viral başlıkta bölün ve enfekte edin.
      1. Sıcak HEK ortamı (Tablo 1) ve 37 ° C'lik bir su banyosunda% 0.25 tripsin-EDTA.
      2. Davlumbazı ve malzemeleri EtOH ile ıslatılmış mendillerle silerek dezenfekte edin.
      3. HEK ortamını serolojik bir pipetle şişeden çıkarın ve atın.
      4. Serolojik bir pipet ile 5 mL Mg2+ ve Ca2+ serbest DPBS (37 ° C) ekleyin. Altını DPBS ile yıkamak için şişeyi ileri geri eğin. DPBS'yi serolojik bir pipetle çıkarın ve atın.
      5. Serolojik bir pipet ile 3 mL ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri tripsinize edin. Reaktifin şişenin altını tam olarak kapladığından emin olmak için şişeyi eğin. Kapağı şişenin üzerine koyun ve hücrelerin şişeden ayrılmasını sağlamak için reaktifin 3-5 dakika oturmasına izin verin.
        NOT: Bu deney 75cm2'lik bir şişe için optimize edilmiştir; Farklı boyutta bir kültür aparatı kullanılıyorsa, reaktifler için hacim ayarlamalarının yapılması gerekebilir.
      6. Antibiyotik içeren 5 mL taze besiyeri çizin. Şişenin duvarlarını yıkamak ve hücreleri fiziksel olarak ayırmak için şişenin hacmini dışarı atın ve çizin.
      7. Şişenin toplam hacmini (8 mL) toplayın ve santrifüjleyin (25 ° C) 15 mL'lik bir tüpte 200 x g'de 5 dakika boyunca toplayın.
      8. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı serolojik bir pipetle çıkarın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.
      9. Hücreleri peleti bozmadan yıkamak için, 15 mL'lik tüpün yan tarafına Mg2+ ve Ca2+ DPBS içermeyen 500 μL DPBS ekleyin. DPBS'yi nazikçe ekledikten sonra, peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla tamponu çıkarın ve atın. Bir kez daha tekrarlayın.
      10. Hücreleri sayın ve 250.000 hücre/mL hücre hücre yoğunluğuna ayarlayın.
      11. Siyah, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına hangi reaktif hacimlerinin gerekli olduğuna bağlı olarak bir ana karışım yapın. Buna "doku plakası" denir. Aşağıdaki ciltlere bakın:
        NOT: 1 kuyucuk örneği (toplam hacim 200 μL): 40 μL biyosensör BacMam vektörü (2 x 1010 viral gen / mL stoğu), 2 μL trikostatin A (100 μM stok; nihai konsantrasyon 1 μM), 158 μL 250.000 hücre / mL hücre yoğunluğu. 10 kuyucuk örneği (toplam hacim 2 mL): 400 μL biyosensör BacMam vektörü (2 x 1010 viral gen / mL stoğu), 20 μL trikostatin A (100 μM stok), 250.000 hücre/mL hücre yoğunluğuna sahip 1.580 μL ortam.
      12. Kuyucuk başına 200 μL ana karışım ekleyin. Plaka okuma spektrofotometresi üzerinde çalıştırmadan önce hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2'de 24 saat boyunca bir inkübatörde inkübe edin.
  2. Bir plaka okuyucu üzerinde çalışıyor
    1. Bir tezgah üzerinde, her bir kuyucuktaki tüm ortamları dikkatlice çıkarın ve 37 ° C'de Mg2+ ve Ca2+ ile 180 μL DPBS ile değiştirin.
    2. Hücre sağlığını doğrulamak için hücreleri mikroskopta inceleyin.
    3. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve 37 °C'de 30 dk-1 saat inkübe edin.
    4. İnkübasyon sırasında, istenen son doz için ilaçları 1: 10 seyreltmede (10 kat olarak da adlandırılır) okuma için hazırlayın. Böylece, 100 μM forskolin ve 100 nM izoproterenol hazırlayın.
    5. Her ilacın 60 μL'sini sütunlu bir şekilde 96 oyuklu şeffaf bir plakaya ("ilaç plakası" olarak adlandırılır) ekleyin.
      NOT: Uygun ilaç seyreltmesi ile ve okumayı optimize etmek için, ilaçlar, okuma sırasında bir 96-çoklu pipetleyici kullanılarak "doku plakasına" aktarılmak üzere "ilaç plakası" olarak adlandırılan şeffaf bir 96 oyuklu plakaya eklenir, ilacın tüm kuyucuklara aynı anda eklenmesine ve floresan spektrofotometre tarafından hızlı bir şekilde okunmasına izin verir.
  3. Floresan plaka okuyucu kurulumu
    1. Floresan plaka okuyucunun ayarlarını yapın.
      1. Okuma Modu: floresan. Okuma Türü: kinetik. Okunan dalga boyları: 494 nm ve 522 nm.
      2. Okuma süresi: Temel floresan okuması için 3 dakika ve ilaç sonrası ilavesi için 7 dakika girin. Aralık", her okuma arasında 30 saniye boyunca 00:00:30 olarak girilir.
        NOT: Okuma süresi, gereken süreye göre optimize edilebilir ve artırılabilir.
  4. Veri toplama
    1. Doku plakasını inkübatörden çıkarın, alüminyum folyoyu ve plaka kapağını çıkarın ve doku plakasını plaka okuyucuya yerleştirin. Kağıt mendil plakasının dinlenmesini ve okuyucunun sıcaklığına (37 °C) dengelenmesini sağlamak için okuyucu çekmecesini kapatın.
    2. Şeffaf 96 oyuklu plakayı (ilaç plakası) ilaç seyreltmeleriyle birlikte 96-çoklu pipetin altına yerleştirin ve oyuklardan 20 μL çekme alıştırması yapın. Pipetleyici uçlarına eşit miktarda ilaç çekildiğinden emin olun.
    3. Bir "temel" ölçüm çalıştırması başlatın.
      NOT: 40 RFU veya üzeri, geçerli veri olarak kabul edilir. Veriler bu değerin altındaysa, deney durdurulmalı ve atılmalıdır.
    4. Doku plakası, temel çalışmanın sonunda okuyucudan çıkacaktır. Şeffaf ilaç plakasından siyah doku plakasına hızlı ve dikkatli bir şekilde 20 μL ekleyin. Ardından, hızlı bir şekilde "tedavi" çalışmasına başlayın. Doku plakası, ilaçlar eklendikten sonra 30 saniyeden fazla okuyucunun dışında kalmamalıdır.
      NOT: İlaç çok hızlı eklenirse, hücreler doku plakasından ayrılır ve kullanılamaz bir deney oluşturur. Ek olarak, hücreler ışığa duyarlı yeşil bir floresan proteini ile enfekte edilir; Bu nedenle, yanıtın erken kısmını kaçırmamak için ilaçları hızlı ve hızlı bir şekilde eklemek ve ikinci okumaya başlamak zorunludur.
    5. İkinci okuma tamamlandıktan sonra, doku plakasının okuyucudan çıkarıldığından ve veri toplamanın tamamlandığından emin olun.
      NOT: Doku plakasını atmadan önce, hücrelerin hala plakaya bağlı olduğunu doğrulamak en iyi uygulamadır. Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler ayrılırsa, sonuçlar geçersizdir ve atılmalıdır. Deneyin tekrarlanması gerekecektir.
    6. Elde edilen verileri bir Excel dosyası olarak dışa aktarın.
    7. Dışa aktarılan Excel okunabilir verilerini plaka okuyucudan açın ve ilgili bilgileri kopyalayıp Excel dönüştürme şablonuna yapıştırın. Veriler, plaka okuyucu kurulumundan, kopyalanan verilerin sağındaki tek kuyulu, sütun okumalarına dönüşecektir.
      NOT: Zaman içinde bir kuyu için floresan sütunları, RFU'larda (başlıklı sütun dönüşümü) ve ilk okumadaki RFU okumasına göre ondalık bir değişiklik olarak (t0 Delta F başlıklı) listelenir. Excel şablonunda, Delta F tablosu, ilaç eklemeden önceki son temel okumaya ayarlanır. Burası 6. veri toplamanoktasıdır .
    8. Veri dönüşümünden sonra, verileri Delta F'den kopyalayın ve zaman içinde floresanda bozunma veya bağıl bozulma olarak veri analizi yazılımına yapıştırın.
    9. Göreli ondalık değerler için X başlığını "zaman (s)" ve Y başlığını "ΔF/F0" olarak değiştirin.

2. Ters çevrilmiş floresan mikroskobu kullanarak tek hücreli test

  1. 35 mm'lik bir tabakta cADDis BacMam vektörü ile hücrelerin tohumlanması (1. Gün)
    1. Hücreleri bir viral başlıkta bölün ve enfekte edin.
      1. Sıcak HASM ortamı (Tablo 1), 37 ° C su banyosunda% 0.25 tripsin-EDTA.
      2. Başlığı ve malzemeleri dezenfekte edin ve başlığı EtOH ile ıslatılmış mendillerle silin.
      3. HASM ortamını serolojik bir pipetle şişeden çıkarın ve atın.
      4. Yeni bir serolojik pipet ile 5 mL Mg2+ ve Ca2+ serbest DPBS (37 ° C) ekleyin ve altını DPBS ile yıkamak için şişeyi eğin.
      5. Serolojik bir pipet ile 3 mL ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri tripnize edin. Reaktifin şişenin altını tam olarak kapladığından emin olmak için şişeyi eğin. Hücrelerin şişeden ayrılmasına izin vermek için reaktifi 3-5 dakika bekletin.
      6. Antibiyotik içeren 5 mL taze besiyeri çizin ve hücreleri şişenin dibinden çıkarmak için pipeti dışarı atın.
      7. Şişe (8 mL) santrifüjünün toplam hacmini 5 dakika boyunca 200 x g'da bir santrifüj tüpünde toplayın.
      8. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı serolojik bir pipetle çıkarın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.
      9. Peleti bozmadan, santrifüj tüpünün yan tarafına Mg2+ ve Ca2+ DPBS içermeyen 500 μL DPBS ekleyin. Mümkün olduğu kadar çok sıvıyı çıkarın ve atın ve bir kez daha tekrarlayın.
        NOT: Bu deney 75cm2'lik bir şişe için optimize edilmiştir; Farklı boyutta bir kültür aparatı kullanılıyorsa, reaktifler için hacim ayarlamalarının yapılması gerekebilir.
      10. Hücreleri sayın ve 40.000 hücre/mL hücre yoğunluğuna ayarlayın.
      11. 35 mm'lik bir tabağın oyuğu başına gereken reaktif hacmine dayalı bir ana karışım yapın. Aşağıdaki ciltlere bakın:
        NOT: 1 kuyucuk örneği (toplam hacim 500 μL): 20 μL biyosensör BacMam vektörü (2 x 1010 viral gen / mL stoğu), 5 μL trikostatin A (100 μM stok, nihai konsantrasyon 1 μM), 500 μL 40.000 hücre / mL hücre yoğunluğu. 4 kuyu için örnek (toplam hacim 2 mL): 80 μL biyosensör BacMam vektörü (viral gen stoğu /mL), 20 μL trikostatin A (100 μM stok, nihai konsantrasyon 1 μM), 2000 μL ortam 40.000 hücre/mL hücre yoğunluğu.
      12. Kuyucuk başına 500 μL ana karışım ekleyin. Deneye devam etmeden önce hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin.
        NOT: Hücre numarası, hücre satırına göre değişebilir. Analiz için çakışan hücrelerden kaçınmak için, düşük hücre sayıları kullanın.
  2. Farmakolojik ajanların hazırlanması (2. Gün)
    1. Her bir oyuktaki ortamı dikkatlice çıkarın ve 37 ° C'de Mg2+ ve Ca2+ ile 450 μL DPBS ile değiştirin.
    2. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve 35 mm'lik diski 37 °C'de 30 dk-1 saat inkübe edin.
    3. Hücre sağlığını doğrulamak için hücreleri mikroskopta inceleyin.
    4. Bu arada, ilaçları istenen nihai konsantrasyonun (10 kat daha fazla) üzerinde 1 log birimi okumak için hazırlayın. Böylece, 100 μM forskolin ve 100 nM izoproterenol hazırlayın.
    5. Log doz titreleri için, ilacı 10 mM'de hazırlayın ve 100 μM forskolin ve 100 nM izoproterenol elde etmek için seri seyreltmeler kullanın.
  3. Veri toplama
    NOT: Aşağıdaki ayarlar floresan ters çevrilmiş mikroskop içindir. Her mikroskoba eşlik eden yazılım farklı olabilir; Geçerli protokolde kullanılan genel ayarlar burada açıklanmıştır.
    1. Merkezi göbeği ve ardından ters çevrilmiş floresan mikroskobu açın.
    2. Yakalama için kullanılacak yazılımı açın ve hızlandırılmış yakalama seçeneğini seçin.
    3. Mikroskop tablasına 35 mm'lik bir tabak numune tutucu yerleştirin.
    4. Objektif lensi x20 olarak ayarlayın.
    5. Otomatik odaklamayı kullanın ve mümkün olduğunca net bir resim elde edin. Tek tek hücreleri bulmak zorsa, 4x'lik bir hedefle başlayın, ardından 20x'e geçin. Mikroskopta otomatik odaklama özelliği yoksa numuneyi manuel olarak odaklayın.
      NOT: 40x büyütme, daha önemli hücre morfolojik detayına ihtiyaç duyulduğunda kullanılabilir.
    6. En iyi veri alımını elde etmek için aşağıdaki ayarları yapın: Otomatik Parlaklık (pozlama), Uyarma Dalga Boyu, Siyah Dengesi (arka plan gürültüsünü azaltmak için), Otomatik Odaklama.
    7. Birkaç sitoplazmik floresan hücreye sahip bir görüş alanı bulduktan sonra, her 30 saniyede bir 20 dakika boyunca hızlandırılmış yakalama kullanarak veri elde edin.
    8. Okumaya başlamak için harekete tıklayın.
    9. Taban çizgisini toplamak için 3 dakika koşun. 3 dakikalık yakalama yapılır yapılmaz, ilacın 50 μL'sini uygun kuyuya nazikçe ekleyin. İlaçlar eklendiğinde, tabak üzerindeki son konsantrasyon 10 μM forskolin ve 10 nM izoproterenol olacaktır.
      NOT: İlaç dikkatli bir şekilde eklenmelidir; Plakaya pipet ucuyla dokunmayın, çünkü bu, yapılan görüş alanını hareket ettirebilir ve numunenin analiz edilememesine neden olabilir.
    10. Her 30 saniyede bir veri yakalama ile denemeyi 17 dakika daha çalışacak şekilde bırakın.
    11. Test tamamlandıktan sonra, verilerin analiz için hazır olduğundan emin olun.
      NOT: Mevcut protokol odak kayması için bir kontrol içermese de, deneye bir tane dahil etmek faydalı olabilir. Örneğin, nükleer boyaların kullanımı, mikroskop analizi sırasında, özellikle uzun süreler boyunca canlı hücrelerin görüntülerini yakalarken, odak kaymasının yönetilmesine yardımcı olabilir. cADDis biyosensörleri tipik olarak hücre içinde geniş bir şekilde dağıtılır, bu da geniş bir odak düzlemini en etkili yakalama haline getirir ve odak kaymasını kontrol etme ihtiyacını azaltır9.
  4. Verileri analiz etme
    NOT: Her mikroskoba eşlik eden yazılım farklı olabilir, bu nedenle yakalanan görüntüleri analiz etmek için kullanılması gereken genel ayarlar burada açıklanmıştır.
    1. Deney sırasında yakalanan görüntü dosyalarını açın.
    2. Analizi gerçekleştirmek için her hücrenin ilgilendiği bölgeyi seçmek için çokgen veya daire aracını kullanın. Analiz, her zaman noktasında her hücrenin parlaklığını vermelidir.
      NOT: En iyi uygulama, tabağın duvarına veya diğer hücrelere değen hücreleri değil, tek tek hücreleri seçmektir. Bu, mümkün olan en iyi veri toplamayı sağlar. Her koşulda analiz için en az 5 hücre seçin ve denemeyi en az üç kez tekrarlayın.
    3. Verileri analiz ettikten sonra, verileri bir Excel sayfasında açın ve farmakolojik ajanları veya aracı eklemeden hemen önce resimden başlayarak her fotoğraftaki her koşul için ortalama parlaklığı hesaplayın. Bu örnekte, her resim her 3 saniyede bir çekildiği için mikroskopta çekilen 6. dakika işaretinde veya 30. fotoğrafta.
    4. Her koşuldaki her ortalama değer için ΔF/F0'ı hesaplayın.
    5. Bir istatistiksel analiz yazılımına yükleyin ve ΔF/F0'ı s cinsinden zamana karşı çizin.
      NOT: Şekil 1 , protokollerin ana adımlarına şematik bir genel bakış sağlar.

Sonuçlar

Bu çalışma, sitozolik biyosensörü hem plaka okuyucu hem de mikroskop testlerinde doğruladı. Hücreler biyosensörü eksprese ettikten sonra, 10 μM forskolin (adenilil siklazın doğrudan aktivatörü), 10 nM izoproterenol (ß1AR ve ß2AR'de bir agonist) veya araç ile uyarıldı (Şekil 1). cAMP üretiminin göstergesi olan floresanstaki müteakip değişiklikler her 30 saniyede bir yakalandı.

Veriler, ilk floresanstan (ΔF/F0

Tartışmalar

cAMP'nin doğru ve hassas ölçümü, çeşitli hücresel süreçlerdeki rolünü anlamak ve cAMP'ye bağlı sinyal yollarının aktivitesini incelemek için çok önemlidir. ELISA, radyoimmünoassay, FRET biyosensörleri ve GloSensor cAMP testi 14,15,16,17,18 dahil olmak üzere cAMP seviyelerini ölçmek için yaygın olarak kullanılan çeşitli yöntemler vardır.

Açıklamalar

Yazarların rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) (HL169522) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate Corning3904Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscopeKeyence
Calcium chloride (IM)Quality Biological IncE506For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+ Gibco14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+Corning14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D systemsS11195For HEK and HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham's F-12K Gibco21127022For HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080For HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Drug
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotic for HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagent
Sodium hydroxide solutionSigmaS2770For HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagent
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagent

Referanslar

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

CAMP Biyosens rCADDisEpac2Floresan ProteinCAMP Dinami iGer ek Zamanl l mHEK 293 H creleriHASM H creleri96 Kuyulu PlakaFloresan MikroskopiY ksek Verimli TaramaCAMP Sinyalizasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır