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Resumo

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Resumo

O Detector de Diferença de cAMP In Situ (cADDis) é um novo biossensor que permite a medição contínua dos níveis de cAMP em células vivas. O biossensor é criado a partir de uma proteína fluorescente permutada circularmente ligada à região da dobradiça de Epac2. Isso cria um único biossensor de fluoróforo que exibe fluorescência aumentada ou diminuída após a ligação do cAMP. O biossensor existe em versões ascendentes vermelhas e verdes, bem como versões verdes descendentes e várias versões vermelhas e verdes direcionadas a locais subcelulares. Para ilustrar a eficácia do biossensor, foi utilizada a versão verde para baixo, que diminui a fluorescência após a ligação do cAMP. Dois protocolos usando este sensor são demonstrados: um utilizando um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços compatível com triagem de alto rendimento e outro utilizando imagens de célula única em um microscópio fluorescente. No leitor de placas, células HEK-293 cultivadas em placas de 96 poços foram estimuladas com 10 μM de forscolina ou 10 nM de isoproterenol, o que induziu reduções rápidas e grandes na fluorescência na versão verde para baixo. O biossensor foi usado para medir os níveis de cAMP em células individuais do músculo liso das vias aéreas humanas (HASM) monitoradas sob um microscópio fluorescente. O biossensor verde descendente exibiu respostas semelhantes às populações de células quando estimulado com forscolina ou isoproterenol. Este ensaio de célula única permite a visualização da localização do biossensor com ampliação de 20x e 40x. Assim, este biossensor de cAMP é sensível e flexível, permitindo a medição em tempo real de cAMP em células imortalizadas e primárias, e com células únicas ou populações de células. Esses atributos tornam o cADD uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica da sinalização do cAMP em células vivas.

Introdução

A adenosina 3',5'-monofosfato cíclico, cAMP, desempenha um papel central na comunicação celular e na coordenação de vários processos fisiológicos. O AMPc atua como um segundo mensageiro, retransmitindo sinais externos de hormônios, neurotransmissores ou outras moléculas extracelulares para iniciar uma cascata de eventos intracelulares1. Além disso, o cAMP está intrinsecamente envolvido em várias vias de sinalização, incluindo aquelas associadas a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e adenilil ciclases. Compreender o papel do AMPc na sinalização celular é fundamental para desvendar os mecanismos complexos subjacentes às funções celulares normais e o desenvolvimento de terapias potenciais para uma ampla gama de condições médicas2.

No passado, vários métodos foram empregados para medir o cAMP direta ou indiretamente. Estes incluíram radiomarcação de pools de ATP celular seguidos de purificação em coluna, HPLC, radioimunoensaios e imunoensaios enzimáticos 1,2. Esses ensaios legados são limitados pelo fato de serem medidas de ponto final, exigindo um grande número de amostras para construir respostas dependentes do tempo. Mais recentemente, os sensores de Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência (FRET) foram desenvolvidos para criar ensaios em células vivas, produzindo dados dinâmicos em tempo real e permitindo que os sensores sejam direcionados em diferentes locais subcelulares3. O FRET aproveita dois fluoróforos, um doador fluorescente e um aceptor fluorescente que, quando próximo, o fluoróforo aceitador será excitado pela saída fluorescente do doador. Os dois fluoróforos mais utilizados são a proteína fluorescente ciano (CFP) e a proteína fluorescente amarela (YFP), uma vez que estas possuem propriedades de excitação e emissão compatíveis. Além de CFP e YFP, a utilização da proteína fluorescente verde (GFP) e da proteína fluorescente vermelha (RFP) é comumente usada para biossensores FRET. Os biossensores cAMP FRET operam tendo um doador e um aceptor em extremidades opostas da proteína de ligação ao cAMP Epac2. A ligação do cAMP altera a confirmação de Epac e aumenta a distância entre os fluoróforos doadores e aceptores 3,4. Essa mudança conformacional é detectada por uma perda de FRET, ou seja, a excitação do fluoróforo aceitador pela energia transferida das gotas de fluoróforo doador3. Embora seja um processo aparentemente simples, há uma abundância de limitações e problemas com o biossensor FRET para pesquisa de cAMP5. Uma delas é a seleção de proteínas fluorescentes, por exemplo, GFP, que podem dimerizar naturalmente, reduzindo assim a sensibilidade6. Os biossensores cAMP baseados em FRET foram direcionados para microdomínios específicos7, mas pode haver limitações devido ao grande tamanho de uma construção com dois fluoróforos6. Outra questão significativa é a baixa relação sinal-ruído dos sinais FRET resultante da sobreposição entre excitação e emissão do fluoróforo, resultando em alta frequência de amostragem e complicando a análise dos resultados 4,5.

Mais recentemente, o novo biossensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, resolveu essas e outras limitações quando se trata de estudar a regulação da sinalização do cAMP8. Uma melhoria importante é a dependência de um único fluoróforo. Isso permite um sinal rápido e eficiente com uma faixa dinâmica mais ampla e uma alta relação sinal-ruído. Como resultado, pode haver mais precisão, pois há um escopo menos amplo de comprimentos de onda para vasculhar8. Como as sondas FRET, o biossensor tem sido direcionado para locais subcelulares, permitindo a pesquisa sobre a teoria da compartimentação e a exploração em jangadas lipídicas e não jangadas e outros domínios subcelulares9. Talvez o mais importante seja a adequação de um único biossensor de fluoróforo para triagem de alto rendimento, que melhorou a sensibilidade e a reprodutibilidade em relação aos biossensores baseados em FRET. O biossensor é empacotado em um vetor BacMam para facilitar a transdução de uma ampla gama de tipos de células e controle preciso sobre a expressão de proteínas.

O controle de expressão por meio do vetor BacMam pode ser particularmente útil em ensaios usando ortólogos GPCR de diferentes espécies para facilitar a interpretação de dados de estudos em animais. Além disso, o controle sobre a expressão do receptor é fundamental para medir os diferentes graus de eficácia do medicamento (por exemplo, agonistas inversos e agonistas parciais), e baixos níveis de expressão do receptor são úteis para mimetizar os baixos níveis encontrados no tecido animal. O BacMam é um vetor de baculovírus que foi modificado para transduzir células de mamíferos, como culturas de células primárias e linhas HEK-29310. Marcadores selecionáveis dominantes permitem que o BacMam forneça mais estabilidade em relação às infecções plasmídicas tradicionais11. Esses promotores seletivos permitem uma entrega e expressão gênica mais eficientes. Além disso, a adição de tricostatina A (um inibidor da histona desacetilase) aumenta os níveis de proteína repórter11. Os níveis de expressão podem ser controlados por meio do título do vírus BacMam usado e devem ser otimizados para cada tipo de célula. No caso deste biossensor, uma proteína fluorescente vermelha ou verde está ligada ao Epac nos terminais N e C. Quando o cAMP se liga, uma mudança conformacional no biossensor move os aminoácidos adjacentes à proteína fluorescente. Tal mudança move a absorbância do estado aniônico para o estado neutro a 400 nm, diminuindo assim a fluorescência.

Existem 90-120 GPCRs expressos em uma única célula que respondem a uma ampla variedade de sinais neuro-humorais12. Portanto, pode-se supor que pelo menos várias dezenas de GPCRs por célula podem estimular ou inibir o cAMP por meio do acoplamento Gs ou Gi, respectivamente. Embora tenha havido progresso no monitoramento desse segundo mensageiro em tempo real, como o FRET, são necessários métodos mais eficientes. A metodologia para monitorar a síntese e degradação de sinais de cAMP usando cADDis em tempo real é apresentada aqui. A mudança na fluorescência pode ser monitorada em tempo real usando um leitor de placas de fluorescência para ensaios de alto rendimento ou usando um microscópio fluorescente para ensaios de célula única. Esses métodos são úteis para uma ampla gama de questões biológicas relacionadas à sinalização GPCR via cAMP.

Protocolo

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Ensaio de alto rendimento do espectrofotômetro de leitura de placas

  1. Semeando células HEK-293 com o vetor cADDis BacMam em uma placa de 96 poços (Dia 1)
    1. Dividir e infectar células em um capuz viral.
      1. Meio HEK quente (Tabela 1) e tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
      2. Desinfete o capô e os materiais limpando-os com lenços embebidos em EtOH.
      3. Remover e eliminar os meios HEK do balão com uma pipeta serológica.
      4. Adicionar 5 ml de DPBS livre de Mg2+ e Ca2+ (37 °C) com uma pipeta serológica. Incline o frasco para frente e para trás para lavar o fundo com DPBS. Remova e descarte a SPBD com uma pipeta sorológica.
      5. Tripsinize as células adicionando 3 mL de tripsina-EDTA a 0,25% aquecida com uma pipeta sorológica. Inclinar o balão para garantir que o reagente cobre totalmente o fundo do balão. Coloque a tampa no frasco e deixe o reagente descansar por 3-5 min para permitir que as células se desprendam do frasco.
        NOTA: Este experimento é otimizado para um frasco de 75 cm2 ; Ajustes de volume para reagentes podem precisar ser feitos se um aparelho de cultura de tamanho diferente for usado.
      6. Retire 5 mL de meio fresco contendo antibióticos. Expulsar e retirar o volume do balão para lavar as paredes do balão e separar fisicamente as células.
      7. Recolher o volume total do balão (8 ml) e centrifugar (25 °C) num tubo de 15 ml a 200 x g durante 5 min.
      8. Após centrifugação, remover o sobrenadante com uma pipeta serológica, com o cuidado de não perturbar o sedimento.
      9. Para lavar as células sem perturbar o pellet, adicione 500 μL de DPBS sem Mg2+ e Ca2+ DPBS na lateral do tubo de 15 mL. Depois de adicionar suavemente o DPBS, remova e descarte o máximo de tampão possível sem perturbar o pellet. Repita mais uma vez.
      10. Conte as células e ajuste para uma densidade celular de 250.000 células / mL de células.
      11. Faça uma mistura mestre com base nos volumes de reagentes necessários por poço de uma placa preta e transparente de 96 poços. Isso é chamado de "placa de tecido". Veja os volumes abaixo:
        NOTA: Exemplo de 1 poço (volume total 200 μL): 40 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de 2 x 1010 genes virais / mL), 2 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM; concentração final 1 μM), 158 μL de densidade celular de 250.000 células / mL. Exemplo de 10 poços (volume total 2 mL): 400 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de 2 x 1010 genes virais /mL), 20 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM), 1.580 μL de meio com densidade celular de 250.000 células/mL.
      12. Adicione 200 μL de master mix por poço. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 numa incubadora durante 24 h antes de utilizar o espectrofotómetro de leitura de placas.
  2. Executando em um leitor de placas
    1. Em uma bancada, remova cuidadosamente todos os meios em cada poço e substitua por 180 μL de DPBS com Mg2+ e Ca2+ a 37 ° C.
    2. Inspecione as células em um microscópio para confirmar a saúde celular.
    3. Embrulhe a placa em papel alumínio e incube a 37 °C por 30 min-1 h.
    4. Durante a incubação, prepare os medicamentos para a leitura na diluição de 1:10 (também chamada de 10 vezes) para a dose final desejada. Assim, prepare 100 μM de forscolina e 100 nM de isoproterenol.
    5. Adicione 60 μL de cada medicamento de forma colunar a uma placa transparente de 96 poços (chamada de "placa de medicamento").
      NOTA: Com a diluição adequada do medicamento e para otimizar a leitura, os medicamentos são adicionados a uma placa transparente de 96 poços, chamada de "placa do medicamento", para ser transferida no momento da leitura para a "placa de tecido" usando um pipetador múltiplo de 96, permitindo que o medicamento seja adicionado a todos os poços simultaneamente e seja lido rapidamente pelo espectrofotômetro fluorescente.
  3. Configuração do leitor de placa de fluorescência
    1. Ajuste as configurações do leitor de placa de fluorescência.
      1. Modo de leitura: fluorescência. Tipo de leitura: cinético. Leitura dos comprimentos de onda: 494 nm e 522 nm.
      2. Tempo de leitura: Insira 3 min para a leitura fluorescente da linha de base e 7 min para a adição pós-medicamento. Intervalo" é inserido como 00:00:30 por 30 s entre cada leitura.
        NOTA: O tempo de leitura pode ser otimizado e aumentado com base no tempo necessário.
  4. Aquisição de dados
    1. Remova a placa de tecido da incubadora, remova a folha de alumínio e a tampa da placa e coloque a placa de tecido no leitor de placas. Feche a gaveta do leitor para permitir que a placa de tecido descanse e se equilibre à temperatura do leitor (37 °C).
    2. Coloque a placa transparente de 96 poços (placa de medicamento) com as diluições do medicamento sob a pipeta de 96 multi e pratique a extração de 20 μL dos poços. Certifique-se de que haja um volume uniforme de medicamento puxado nas pontas do pipetador.
    3. Inicie uma execução de medição de "linha de base".
      NOTA: 40 RFU ou mais são considerados dados viáveis. Se os dados estiverem abaixo desse valor, o experimento deverá ser interrompido e descartado.
    4. A placa de tecido será ejetada do leitor no final da execução da linha de base. Adicione rápida e cuidadosamente 20 μL da placa transparente do medicamento à placa de tecido preto. Em seguida, comece rapidamente a execução do "tratamento". A placa de tecido não deve ficar fora do leitor por mais de 30 s após a adição dos medicamentos.
      NOTA: Se o medicamento for adicionado muito rapidamente, as células se desprendem da placa de tecido, criando um experimento inutilizável. Além disso, as células são infectadas com uma proteína fluorescente verde sensível à luz; Assim, adicionar rápida e prontamente os medicamentos e iniciar a segunda leitura é imperativo para evitar perder a parte inicial da resposta.
    5. Quando a segunda leitura estiver concluída, certifique-se de que a placa de tecido seja ejetada do leitor e a coleta de dados seja concluída.
      NOTA: Antes de descartar a placa de tecido, é uma prática recomendada verificar se as células ainda estão presas à placa. Observe as células ao microscópio. Se as células forem desanexadas, os resultados serão inválidos e deverão ser descartados. O experimento precisará ser repetido.
    6. Exporte os dados resultantes como um arquivo do Excel.
    7. Abra os dados legíveis exportados do Excel do leitor de chapas e copie e cole as informações relevantes no modelo de conversão do Excel. Os dados serão transformados do leitor de placas configurado para leituras de coluna de poço único à direita dos dados copiados.
      NOTA: As colunas de fluorescência para um poço ao longo do tempo são listadas em RFUs (intituladas transformação de coluna) e como uma mudança decimal em relação à leitura de RFU na leitura inicial (t0 intitulado Delta F). No modelo do Excel, a tabela Delta F é definida como a última leitura de linha de base antes da adição do medicamento. Este é o6º ponto de coleta de dados.
    8. Após a transformação dos dados, copie os dados do Delta F e cole-os no software de análise de dados como decaimento ou decaimento relativo na fluorescência ao longo do tempo.
    9. Altere o título X para "tempo (s)" e o título Y para "ΔF/F0" para valores decimais relativos.

2. Ensaio de célula única usando um microscópio fluorescente invertido

  1. Semeando células (HASM) com o vetor cADDis BacMam em um prato de 35 mm (Dia 1)
    1. Dividir e infectar células em um capuz viral.
      1. Meio HASM quente (Tabela 1), tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
      2. Desinfete o capô e os materiais e limpe o capô com lenços embebidos em EtOH.
      3. Retirar e eliminar os meios HASM do balão com uma pipeta serológica.
      4. Adicionar 5 ml de Mg2+ e Ca2+ DPBS livre (37 °C) com uma nova pipeta serológica e inclinar o balão para lavar o fundo com a DPBS.
      5. Tripsinize as células adicionando 3 mL de tripsina-EDTA a 0,25% aquecida com uma pipeta sorológica. Inclinar o balão para garantir que o reagente cobre totalmente o fundo do balão. Deixe o reagente agir por 3-5 min para permitir que as células se desprendam do frasco.
      6. Retire 5 ml de meios frescos contendo antibióticos e expulse a pipeta para remover as células do fundo do frasco.
      7. Recolher o volume total da centrífuga do balão (8 ml) num tubo de centrifugação a 200 x g durante 5 min.
      8. Após centrifugação, remover o sobrenadante com uma pipeta serológica, com o cuidado de não perturbar o sedimento.
      9. Sem perturbar o pellet, adicione 500 μL de DPBS sem Mg2+ e Ca2+ DPBS na lateral do tubo da centrífuga. Remova e descarte o máximo de líquido possível e repita mais uma vez.
        NOTA: Este experimento é otimizado para um frasco de 75 cm2 ; Ajustes de volume para reagentes podem precisar ser feitos se um aparelho de cultura de tamanho diferente for usado.
      10. Conte as células e ajuste para a densidade celular de 40.000 células/mL.
      11. Fazer uma mistura principal com base no volume de reagente necessário por alvéolo de uma placa de 35 mm. Veja os volumes abaixo:
        NOTA: Exemplo de 1 poço (volume total 500 μL): 20 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de 2 x 1010 genes virais /mL), 5 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM, concentração final 1 μM), 500 μL de densidade celular de 40.000 células/mL. Exemplo para 4 poços (volume total de 2 mL): 80 μL do vetor biossensor BacMam (estoque de genes virais /mL), 20 μL de tricostatina A (estoque de 100 μM, concentração final de 1 μM), 2000 μL de densidade celular de 40.000 células/mL.
      12. Adicione 500 μL de master mix por poço. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 durante 24 h antes de prosseguir a experiência.
        NOTA: O número de células pode variar de acordo com a linhagem celular. Para evitar a sobreposição de células para a análise, use números baixos de células.
  2. Preparação de agentes farmacológicos (Dia 2)
    1. Remova cuidadosamente o meio em cada poço e substitua por 450 μL de DPBS com Mg2+ e Ca2+ a 37 °C.
    2. Embrulhar a placa em papel alumínio e incubar o disco de 35 mm a 37 °C durante 30 min-1 h.
    3. Inspecione as células em um microscópio para confirmar a saúde celular.
    4. Enquanto isso, prepare os medicamentos para a leitura de 1 unidade logarítmica acima da concentração final desejada (10 vezes maior). Assim, prepare 100 μM de forscolina e 100 nM de isoproterenol.
    5. Para títulos de dose logarítmica, prepare o medicamento a 10 mM e use diluições seriadas para atingir 100 μM de forscolina e 100 nM de isoproterenol.
  3. Aquisição de dados
    NOTA: As configurações a seguir são para um microscópio invertido fluorescente. O software que acompanha cada microscópio pode ser diferente; As configurações gerais usadas no protocolo atual são descritas aqui.
    1. Ligue o hub central e, em seguida, o microscópio fluorescente invertido.
    2. Abra o software que será usado para a captura e escolha a opção de captura de lapso de tempo .
    3. Coloque um porta-amostras de prato de 35 mm no microscópio stage.
    4. Defina a lente objetiva para x20.
    5. Use o foco automático e obtenha uma imagem o mais nítida possível. Se for difícil encontrar células individuais, comece com uma objetiva 4x e depois passe para 20x. Foque a amostra manualmente se o microscópio não tiver um recurso de foco automático.
      NOTA: A ampliação de 40x pode ser usada se forem necessários detalhes morfológicos celulares mais significativos.
    6. Ajuste as seguintes configurações para obter a aquisição de dados ideal: Brilho automático (exposição), Comprimento de onda de excitação, Equilíbrio de preto (para reduzir o ruído de fundo), Foco automático.
    7. Depois de encontrar uma área de visão com várias células fluorescentes citoplasmáticas, adquira dados usando a captura de lapso de tempo por 20 minutos a cada 30 s.
    8. Clique em ir para iniciar a leitura.
    9. Corra por 3 min para coletar a linha de base. Assim que a captura de 3 minutos for feita, adicione suavemente 50 μL do medicamento ao poço apropriado. Quando os medicamentos são adicionados, a concentração final no prato será de 10 μM de forscolina e 10 nM de isoproterenol.
      NOTA: O medicamento deve ser adicionado com cuidado; Não toque na placa com a ponta da pipeta, pois isso pode mover o campo de visão feito e tornar a amostra incapaz de ser analisada.
    10. Deixe o experimento ser executado por mais 17 minutos com captura de dados a cada 30 s.
    11. Depois que o teste for concluído, certifique-se de que os dados estejam prontos para análise.
      NOTA: Embora o protocolo atual não incorpore um controle para desvio focal, pode ser benéfico incluir um no experimento. Por exemplo, o uso de corantes nucleares pode ajudar no gerenciamento do desvio focal durante a análise microscópica, especialmente ao capturar imagens de células vivas por períodos prolongados. Os biossensores cADDis são normalmente distribuídos amplamente dentro da célula, tornando um plano focal amplo a captura mais eficaz e reduzindo a necessidade de controlar o desvio focal9.
  4. Analisando os dados
    NOTA: O software que acompanha cada microscópio pode ser diferente, portanto, as configurações gerais que devem ser usadas para analisar as imagens capturadas são descritas aqui.
    1. Abra os arquivos de imagem capturados durante o experimento.
    2. Use a ferramenta polígono ou círculo para selecionar a região de interesse de cada célula para realizar a análise. A análise deve fornecer o brilho de cada célula em cada ponto de tempo.
      NOTA: A melhor prática é selecionar células individuais e não células que tocam a parede do prato ou outras células. Isso garante a melhor coleta de dados possível. Selecione um mínimo de 5 células para análise dentro de cada condição e replique o experimento pelo menos três vezes.
    3. Depois de analisar os dados, abra os dados em uma planilha do Excel e calcule o brilho médio para cada condição em cada foto, começando na imagem antes de adicionar os agentes farmacológicos ou veículo. Neste exemplo, na marca de 3 minutos ou na6ª foto tirada no microscópio, já que cada foto é tirada a cada 30 s.
    4. Calcule ΔF/F0 para cada valor médio em cada condição.
    5. Carregue em um software de análise estatística e plote ΔF / F0 em relação ao tempo em s.
      NOTA: A Figura 1 fornece uma visão geral esquemática das principais etapas dos protocolos.

Resultados

O presente estudo validou o biossensor citosólico em ensaios de leitura de placas e microscópio. Uma vez que as células expressaram o biossensor, elas foram estimuladas com 10 μM de forscolina (um ativador direto da adenilil ciclase), 10 nM de isoproterenol (um agonista em ß1AR e ß2AR) ou veículo (Figura 1). As mudanças subsequentes na fluorescência, indicativas da produção de cAMP, foram capturadas a cada 30 s.

Os dados foram tran...

Discussão

A medição precisa e sensível do cAMP é crucial para entender seu papel em vários processos celulares e para estudar a atividade das vias de sinalização dependentes do cAMP. Existem vários métodos comumente empregados para medir os níveis de cAMP, incluindo ELISA, radioimunoensaio, biossensores FRET e o ensaio GloSensor cAMP 14,15,16,17,18. Cada ensai...

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (NHLBI) (HL169522).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate Corning3904Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscopeKeyence
Calcium chloride (IM)Quality Biological IncE506For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+ Gibco14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+Corning14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D systemsS11195For HEK and HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham's F-12K Gibco21127022For HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080For HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Drug
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotic for HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagent
Sodium hydroxide solutionSigmaS2770For HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagent
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagent

Referências

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  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
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