АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол, представленный в этом исследовании, иллюстрирует эффективность дифференциального детектора цАМФ in situ в измерении цАМФ с помощью двух методов. В одном из методов используется 96-луночный планшетный спектрофотометр с ячейками HEK-293. Другой метод демонстрирует отдельные клетки HASM под флуоресцентным микроскопом.

Аннотация

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) — это новый биосенсор, который позволяет непрерывно измерять уровни цАМФ в живых клетках. Биосенсор создается из циркулярно переставленного флуоресцентного белка, связанного с шарнирной областью Epac2. В результате создается один флуорофорный биосенсор, который демонстрирует либо повышенную, либо пониженную флуоресценцию при связывании цАМФ. Биосенсор существует в красной и зеленой версиях вверх, а также в зеленой версии вниз, а также в нескольких красных и зеленых версиях, предназначенных для субклеточных мест. Чтобы проиллюстрировать эффективность биосенсора, была использована зеленая версия вниз, которая снижает флуоресценцию при связывании с цАМФ. Продемонстрированы два протокола с использованием этого датчика: один с использованием 96-луночного спектрофотометра, совместимого с высокопроизводительным скринингом, а другой с использованием визуализации одиночных клеток на флуоресцентном микроскопе. На планшете клетки HEK-293, культивируемые в 96-луночных планшетах, стимулировали 10 мкМ форсколином или 10 нМ изопротеренолом, что вызывало быстрое и значительное снижение флуоресценции в зеленом нисходящем варианте. Биосенсор был использован для измерения уровней цАМФ в отдельных клетках гладких мышц дыхательных путей человека (HASM), контролируемых под флуоресцентным микроскопом. Зеленый направленный вниз биосенсор показал аналогичную реакцию на популяции клеток при стимуляции форсколином или изопротеренолом. Этот анализ одиночных клеток позволяет визуализировать местоположение биосенсора при 20-кратном и 40-кратном увеличении. Таким образом, этот биосенсор цАМФ является чувствительным и гибким, что позволяет измерять цАМФ в режиме реального времени как в иммортализированных и первичных клетках, так и в отдельных клетках или популяциях клеток. Эти характеристики делают cADDs ценным инструментом для изучения динамики передачи сигналов цАМФ в живых клетках.

Введение

Аденозин-3',5'-циклический монофосфат, цАМФ, играет центральную роль в клеточной коммуникации и координации различных физиологических процессов. цАМФ действует как второй посредник, ретранслируя внешние сигналы от гормонов, нейротрансмиттеров или других внеклеточных молекул, чтобы инициировать каскад внутриклеточных событий1. Кроме того, цАМФ неразрывно связан с различными сигнальными путями, в том числе связанными с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и аденилатциклазами. Понимание роли цАМФ в передаче клеточной сигнализации имеет основополагающее значение для разгадки сложных механизмов, лежащих в основе нормальных клеточных функций, и разработки потенциальных методов лечения широкого спектразаболеваний.

В прошлом для прямого или косвенного измерения цАМФ использовались различные методы. Они включали радиоактивное мечение клеточных пулов АТФ с последующей очисткой колонки, ВЭЖХ, радиоиммунными анализами и иммуноферментными анализами 1,2. Эти устаревшие анализы ограничены тем фактом, что они являются конечными измерениями, требующими большого количества образцов для построения зависимых от времени ответов. Совсем недавно были разработаны датчики флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для создания анализов в живых клетках, производящих динамические данные в режиме реального времени и позволяющих нацеливаться на датчики в различных субклеточных местоположениях. FRET использует два флуорофора, один флуоресцентный донор и один флуоресцентный акцептор, которые при нахождении в непосредственной близости от акцептора флуорофора будут возбуждаться донорским флуоресцентным выходом. Двумя наиболее часто используемыми флуорофорами являются голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), поскольку они обладают совместимыми свойствами возбуждения и излучения. В дополнение к CFP и YFP, использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (RFP) обычно используется для биосенсоров FRET. Биосенсоры cAMP FRET работают за счет наличия донора и акцептора на противоположных концах связывающего белка Epac2 cAMP. Связывание цАМФ изменяет подтверждение Epac и увеличивает расстояние между донором и акцепторными флуорофорами 3,4. Это конформационное изменение обнаруживается потерей FRET, то есть возбуждением акцепторного флуорофора энергией, передаваемойот капель донорного флуорофора3. Несмотря на кажущуюся простоту процесса, существует множество ограничений и проблем с биосенсором FRET для исследований цАМФ5. Одним из них является отбор флуоресцентных белков, например, GFP, которые могут димеризоваться естественным образом, снижая таким образом чувствительность6. Биосенсоры cAMP на основе FRET были нацелены на конкретные микродомены7, но могут быть ограничения из-за большого размера конструкции с двумя флуорофорами6. Другой существенной проблемой является низкое отношение сигнал/шум сигналов FRET в результате перекрытия между возбуждением и излучением флуорофора, что приводит к высокой частоте дискретизации и усложнению анализа результатов 4,5.

Совсем недавно новый биосенсор (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis решил эти и другие ограничения, когда дело доходит до изучения регуляции передачи сигналов cAMP8. Одним из важных улучшений является зависимость от одного флуорофора. Это обеспечивает быстрый и эффективный сигнал с более широким динамическим диапазоном и высоким соотношением сигнал/шум. В результате может быть больше точности, так как существует менее широкий диапазон длин волн для прочесывания8. Как и FRET-зонды, биосенсор был нацелен на субклеточные места, что позволяет проводить исследования в области теории компартментации и исследовать липидные рафты и не-рафты, а также другие субклеточныедомены. Возможно, наиболее важным является пригодность одного флуорофорного биосенсора для высокопроизводительного скрининга, который имеет улучшенную чувствительность и воспроизводимость по сравнению с биосенсорами на основе FRET. Биосенсор упакован в вектор BacMam, что обеспечивает легкую трансдукцию широкого спектра типов клеток и точный контроль экспрессии белков.

Контроль экспрессии с помощью вектора BacMam может быть особенно полезен при анализах с использованием ортологов GPCR различных видов для облегчения интерпретации данных исследований на животных. Кроме того, контроль над экспрессией рецепторов имеет решающее значение для измерения различных степеней эффективности лекарств (например, обратных агонистов и частичных агонистов), а низкие уровни экспрессии рецепторов полезны для имитации низких уровней, обнаруженных в тканях животных. BacMam представляет собой бакуловирусный вектор, который был модифицирован для трансдукции клеток млекопитающих, таких как первичные клеточные культуры и линии HEK-29310. Доминирующие селективные маркеры позволяют BacMam обеспечивать большую стабильность по сравнению с традиционными плазмидными инфекциями11. Такие селективные промоторы обеспечивают более эффективную доставку и экспрессию генов. Кроме того, добавление трихостатина А (ингибитора гистондеацетилазы) повышает уровень репортерного белка11. Уровни экспрессии можно контролировать с помощью титра используемого вируса BacMam, и они должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. В случае этого биосенсора красный или зеленый флуоресцентный белок связан с Epac на N- и C-концах. Когда цАМФ связывается, конформационное изменение в биосенсоре перемещает аминокислоты, прилегающие к флуоресцентному белку. Такой сдвиг перемещает поглощение из анионного состояния в нейтральное состояние с длиной волны 400 нм, тем самым уменьшая флуоресценцию.

В одной клетке экспрессируется 90-120 GPCR, которые реагируют на широкий спектр нейрогуморальных сигналов12. Таким образом, можно предположить, что по крайней мере несколько десятков GPCR на клетку могут стимулировать или ингибировать цАМФ через Gs или Gi-связь соответственно. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в мониторинге этого второго мессенджера в режиме реального времени, такого как FRET, необходимы более эффективные методы. Представлена методология мониторинга синтеза и деградации сигналов cAMP с помощью cADDis в режиме реального времени. Изменение флуоресценции можно контролировать в режиме реального времени с помощью считывателя флуоресцентных планшетов для высокопроизводительных анализов или с помощью флуоресцентного микроскопа для анализа отдельных клеток. Эти методы полезны для решения широкого круга биологических вопросов, касающихся передачи сигналов GPCR через цАМФ.

протокол

Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Планшетный спектрофотометр высокопроизводительного анализа

  1. Посев клеток HEK-293 вектором cADDis BacMam в 96-луночный планшет (день 1)
    1. Расщепляйте и заражайте клетки в вирусном колпаке.
      1. Теплая среда HEK (Таблица 1) и 0,25% трипсин-ЭДТА в водяной бане при температуре 37 °C.
      2. Продезинфицируйте капюшон и материалы, протерев их салфетками, смоченными в этиленоксиде.
      3. Извлеките и выбросьте среду HEK из колбы с помощью серологической пипетки.
      4. Добавьте 5 мл свободного Mg2+ и Ca2+ DPBS (37 °C) с помощью серологической пипетки. Наклоняйте колбу вперед и назад, чтобы промыть дно с помощью DPBS. Извлеките и утилизируйте DPBS с помощью серологической пипетки.
      5. Трипсинизируйте клетки, добавив 3 мл подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА с помощью серологической пипетки. Наклоните колбу, чтобы реагент полностью покрыл дно колбы. Накройте колбу крышкой и дайте реагенту постоять 3-5 минут, чтобы клетки могли отсоединиться от колбы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент оптимизирован для колбы 75 см2 ; При использовании аппарата для культивирования другого размера может потребоваться корректировка объема реагентов.
      6. Наберите 5 мл свежей среды, содержащей антибиотики. Вытолкните и вытяните объем колбы, чтобы промыть стенки колбы и физически отделить ячейки.
      7. Соберите общий объем колбы (8 мл) и центрифуги (25 °C) в пробирку объемом 15 мл при давлении 200 x g в течение 5 минут.
      8. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, стараясь не потревожить гранулу.
      9. Чтобы промыть клетки, не нарушая гранулу, добавьте 500 μL DPBS без Mg2+ и Ca2+ DPBS на боковую сторону пробирки объемом 15 мл. После осторожного добавления DPBS удалите и выбросьте как можно больше буфера, не повреждая гранулы. Повторите еще раз.
      10. Подсчитайте ячейки и настройте плотность клеток до 250 000 клеток/мл.
      11. Составьте мастер-смесь исходя из того, какие объемы реагентов необходимы на лунку черного прозрачного дна 96-луночного планшета. Это называется «тканевой пластиной». Смотрите тома ниже:
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пример 1 лунки (общий объем 200 мкл): 40 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас 2 x10 10 вирусных генов/мл), 2 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ; конечная концентрация 1 мкМ), 158 мкл 250 000 клеток/мл плотности клеток. Пример из 10 лунок (общий объем 2 мл): 400 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас 2 x10 10 вирусных генов/мл), 20 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ), 1580 мкл среды с плотностью клеток 250 000 клеток/мл.
      12. Добавьте 200 μL мастер-смеси на лунку. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в инкубаторе в течение 24 ч перед запуском на планшете спектрофотометра.
  2. Работа на считывателе пластин
    1. На столе осторожно удалите все среды из каждой лунки и замените 180 мкл DPBS с Mg2+ и Ca2+ при 37 °C.
    2. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы подтвердить их здоровье.
    3. Оберните тарелку алюминиевой фольгой и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 мин-1 ч.
    4. Во время инкубации подготовьте препараты для считывания при разведении 1:10 (также называемом 10-кратным) для получения желаемой окончательной дозы. Таким образом, готовят 100 мкМ форсколин и 100 нМ изопротеренол.
    5. Добавьте по 60 мкл каждого препарата столбчатым путем в прозрачный 96-луночный планшет (называемый «планшет для лекарств»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При надлежащем разведении препарата и для оптимизации показаний препараты добавляются в прозрачную 96-луночную пластину, называемую «лекарственной пластиной», которая во время считывания переносится на «тканевую пластину» с помощью 96-мультипипеттора, что позволяет добавлять лекарство во все лунки одновременно и быстро считывать флуоресцентный спектрофотометр.
  3. Настройка считывателя флуоресцентных пластин
    1. Отрегулируйте настройки считывателя флуоресцентных пластин.
      1. Режим чтения: флуоресцентный. Тип чтения: кинетический. Показания длин волн: 494 нм и 522 нм.
      2. Время чтения: Введите 3 минуты для исходного флуоресцентного чтения и 7 минут для добавления после приема препарата». Интервал" вводится как 00:00:30 в течение 30 секунд между каждым чтением.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время чтения может быть оптимизировано и увеличено в зависимости от требуемого времени.
  4. Сбор данных
    1. Извлеките тканевую пластину из инкубатора, снимите алюминиевую фольгу и крышку тарелки и поместите тканевую пластину в считыватель тарелок. Закройте ящик для считывателей, чтобы тканевая пластина отдохнула и сбалансировалась до температуры считывателя (37 °C).
    2. Поместите прозрачную 96-луночную пластину (лекарственную пластину) с разведениями препарата под 96-мульти пипетку и потренируйтесь набирать 20 мкл из лунок. Следите за тем, чтобы в кончиках пипеток втягивался равномерный объем препарата.
    3. Запустите «базовый» прогон измерений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 40 RFU или выше считается жизнеспособными данными. Если данные ниже этого значения, эксперимент следует остановить и отменить.
    4. Тканевая пластина будет отделена от считывателя в конце исходного прогона. Быстро и осторожно добавьте 20 μL с прозрачной пластины для лекарства на пластину с черной тканью. Затем быстро приступайте к «лечебному» прогону. Тканевая пластина не должна находиться за пределами считывающего устройства в течение более 30 с после введения лекарственных препаратов.
      Примечание: Если препарат добавляется слишком быстро, клетки отделяются от тканевой пластины, создавая непригодный для использования эксперимент. Кроме того, клетки заражаются светочувствительным зеленым флуоресцентным белком; Таким образом, быстрое и своевременное добавление лекарств и начало второго чтения является обязательным, чтобы не пропустить раннюю часть ответа.
    5. После завершения второго считывания убедитесь, что тканевая пластина извлечена из считывателя и сбор данных завершен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем утилизировать тканевую пластину, рекомендуется убедиться, что клетки все еще прикреплены к пластине. Понаблюдайте за клетками под микроскопом. Если ячейки отделяются, результаты являются недействительными и должны быть отброшены. Эксперимент нужно будет повторить.
    6. Экспортируйте полученные данные в виде файла Excel.
    7. Откройте экспортированные данные для чтения в формате Excel из считывателя табличек и скопируйте и вставьте соответствующую информацию в шаблон преобразования Excel. Данные будут преобразовываться из настроенного считывателя пластин в одну лунку, показания столбцов справа от скопированных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Столбцы флуоресценции для скважины с течением времени перечислены в RFU (называемое преобразование столбца) и как десятичное изменение относительно показаний RFU при первоначальном чтении (t0 под названием Delta F). В шаблоне Excel таблица Delta F устанавливается на последнее базовое значение перед добавлением препарата. Это6-я точка сбора данных.
    8. После преобразования данных скопируйте данные из Delta F и вставьте их в программное обеспечение для анализа данных в виде затухания или относительного затухания флуоресценции с течением времени.
    9. Измените X-title на "time (s)", а Y-title на "ΔF/F0" для относительных десятичных значений.

2. Анализ одиночных клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа

  1. Посев (HASM) клеток вектором cADDis BacMam в чашку диаметром 35 мм (день 1)
    1. Расщепляйте и заражайте клетки в вирусном колпаке.
      1. Теплая среда HASM (Таблица 1), 0,25% трипсин-ЭДТА в водяной бане при температуре 37 °С.
      2. Продезинфицируйте капюшон и материалы и протрите капюшон салфетками, смоченными в EtOH.
      3. Извлеките и выбросьте носители HASM из колбы с помощью серологической пипетки.
      4. Добавьте 5 мл свободного DPBS Mg2+ и Ca2+ (37 °C) с помощью новой серологической пипетки и наклоните колбу, чтобы промыть дно DPBS.
      5. Трипсинизируйте клетки, добавив 3 мл подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА с помощью серологической пипетки. Наклоните колбу, чтобы реагент полностью покрыл дно колбы. Дайте реагенту постоять 3-5 минут, чтобы клетки отделились от колбы.
      6. Наберите 5 мл свежей среды, содержащей антибиотики, и выдавите пипетку, чтобы удалить клетки со дна колбы.
      7. Соберите общий объем колбы (8 мл) центрифуги в центрифужную пробирку при давлении 200 х г в течение 5 минут.
      8. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, стараясь не потревожить гранулу.
      9. Не повреждая гранулу, добавьте 500 мкл DPBS без Mg2+ и Ca2+ DPBS на боковую сторону центрифужной трубки. Удалите и слейте как можно больше жидкости и повторите еще раз.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент оптимизирован для колбы 75 см2 ; При использовании аппарата для культивирования другого размера может потребоваться корректировка объема реагентов.
      10. Подсчитайте ячейки и настройте плотность клеток до 40 000 клеток/мл.
      11. Составьте мастер-смесь на основе необходимого объема реагента на лунку 35-миллиметровой чашки. Смотрите тома ниже:
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пример 1 лунки (общий объем 500 мкл): 20 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас 2 x10 10 вирусных генов/мл), 5 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ, конечная концентрация 1 мкМ), 500 мкл 40 000 клеток/мл плотности клеток. Пример для 4 лунок (общий объем 2 мл): 80 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас вирусных генов/мл), 20 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ, конечная концентрация 1 мкМ), 2000 мкл среды 40 000 клеток/мл плотности клеток.
      12. Добавьте 500 мкл мастер-смеси на лунку. Перед продолжением эксперимента инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 часов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Номер ячейки может варьироваться в зависимости от линии ячейки. Чтобы избежать наложения ячеек для анализа, используйте низкое количество ячеек.
  2. Приготовление фармакологических средств (День 2)
    1. Тщательно удалите среду из каждой лунки и замените 450 мкл DPBS с Mg2+ и Ca2+ при 37 °C.
    2. Оберните пластину алюминиевой фольгой и выдержите диск диаметром 35 мм при температуре 37 °C в течение 30 мин-1 ч.
    3. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы подтвердить их здоровье.
    4. Тем временем подготовьте препараты к считыванию на 1 логическую единицу выше желаемой конечной концентрации (в 10 раз больше). Таким образом, готовят 100 мкМ форсколин и 100 нМ изопротеренол.
    5. Для получения титров логарифмической дозы готовят препарат при 10 мМ и используют серийные разведения для достижения 100 мкМ форсколина и 100 нМ изопротеренола.
  3. Сбор данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие настройки относятся к флуоресцентному инвертированному микроскопу. Программное обеспечение, прилагаемое к каждому микроскопу, может отличаться; Общие настройки, используемые в текущем протоколе, описаны здесь.
    1. Включите центральный узел, затем инвертированный флуоресцентный микроскоп.
    2. Откройте программное обеспечение, которое будет использоваться для захвата, и выберите опцию покадровой съемки .
    3. Поместите держатель для образцов чашки диаметром 35 мм в предметный столик микроскопа.
    4. Установите объектив на х20.
    5. Используйте автофокус и получите максимально четкую картинку. Если трудно найти отдельные ячейки, начните с цели 4x, затем переходите к 20x. Сфокусируйте образец вручную, если в микроскопе отсутствует функция автофокусировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение в 40x может быть использовано, если требуется более значительная морфологическая детализация клетки.
    6. Отрегулируйте следующие параметры для получения оптимальных данных: Автояркость (экспозиция), Длина волны возбуждения, Баланс черного (для уменьшения фонового шума), Автофокус.
    7. После нахождения области обзора с несколькими цитоплазматическими флуоресцирующими клетками получайте данные с помощью покадровой съемки в течение 20 минут каждые 30 секунд.
    8. Нажмите на кнопку «Перейти », чтобы начать чтение.
    9. Бегите 3 минуты, чтобы собрать базовый уровень. Как только будет сделан 3-минутный захват, аккуратно добавьте 50 мкл препарата в соответствующую лунку. Когда препараты будут добавлены, конечная концентрация на чашке составит 10 мкМ форсколина и 10 нМ изопротеренола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат необходимо добавлять осторожно; Не прикасайтесь к пластине наконечником пипетки, так как это может сместить поле зрения и сделать образец невозможным для анализа.
    10. Оставьте эксперимент на 17 минут с захватом данных каждые 30 секунд.
    11. После завершения теста убедитесь, что данные готовы к анализу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя текущий протокол не включает в себя контроль дрейфа фокуса, может быть полезно включить его в эксперимент. Например, использование ядерных красителей может помочь в управлении фокальным дрейфом во время микроскопического анализа, особенно при получении изображений живых клеток в течение длительного времени. Биосенсоры cADDis обычно широко распределены внутри клетки, что делает широкую фокальную плоскость наиболее эффективным захватом и снижает потребность в контроле дрейфа фокального9.
  4. Анализ данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, поставляемое с каждым микроскопом, может отличаться, поэтому общие настройки, которые следует использовать для анализа полученных изображений, описаны здесь.
    1. Откройте файлы изображений, снятые во время эксперимента.
    2. Используйте инструмент Полигон или круг для выбора области интереса каждой ячейки для выполнения анализа. Анализ должен дать яркость каждой ячейки в каждый момент времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего выбирать отдельные клетки, а не клетки, соприкасающиеся со стенкой чашки или другими клетками. Это обеспечивает наилучший сбор данных. Выберите минимум 5 клеток для анализа в каждом условии и повторите эксперимент не менее трех раз.
    3. После анализа данных откройте данные на листе Excel и рассчитайте среднюю яркость для каждого условия на каждой фотографии, начиная с изображения непосредственно перед добавлением фармакологических агентов или транспортного средства. В данном примере на отметке 3 минуты или на6-м снимке, сделанном на микроскоп, так как каждый снимок делается каждые 30 секунд.
    4. Вычислите ΔF/F0 для каждого среднего значения в каждом условии.
    5. Загрузите в программу статистического анализа и постройте график зависимости ΔF/F0 от времени в с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен схематический обзор основных этапов протоколов.

Результаты

В настоящем исследовании цитозольный биосенсор был валидирован как в тестах планшетов, так и в анализах микроскопа. После того, как клетки экспрессировали биосенсор, их стимулировали либо 10 мкМ форсколином (прямым активатором аденилатциклазы), 10 нМ изопротеренолом (агонистом при ß1

Обсуждение

Точное и чувствительное измерение цАМФ имеет решающее значение для понимания его роли в различных клеточных процессах и для изучения активности цАМФ-зависимых сигнальных путей. Существует несколько методов, обычно используемых для измерения уровня цАМФ, включая ИФА, радиоиммунный ан...

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным институтом сердца, легких и крови (NHLBI) (HL169522).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate Corning3904Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscopeKeyence
Calcium chloride (IM)Quality Biological IncE506For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+ Gibco14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+Corning14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D systemsS11195For HEK and HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham's F-12K Gibco21127022For HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080For HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Drug
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotic for HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagent
Sodium hydroxide solutionSigmaS2770For HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagent
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagent

Ссылки

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

CAMP BiosensorCADDisEpac2CAMP DynamicsHEK 293HASM96CAMP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены