טכניקות לדגימה מהירה של שישה איברים חיוניים בקסנופוס בוגר

Summary

מאמר זה מציג מדריך לדגימת שישה איברים משמעותיים ומגוונים בקסנופוס בוגר שניתן לגשת אליהם במהירות ובקלות: חדר הלב, אונת הכבד, הלבלב, גופי השומן, הכליות הזוגיות והעור.

Abstract

Xenopus היה אורגניזם מודל רב עוצמה להבנת התפתחות חולייתנים ומחלות במשך יותר ממאה שנים. בעוד שטכניקות ניתוח ודיסקציה ניסיוניות של העובר תועדו היטב, תיאורים של מבנים ואיברים בוגרים של קסנופוס , יחד עם טכניקות לעבודה עם מבוגרים, לא עודכנו כדי לקחת בחשבון את הדרישות של גישות מודרניות כגון פרוטאומיקה כמותית ושעתוק חד-תאי. הפרספקטיבות של סוג התא ושל הגנים דורשות תצפיות מנוגדות בשלבים עובריים לאלה שברקמות בוגרות. איברי הזחל עוברים שינויים משמעותיים במבנה הכללי, במורפולוגיה שלהם ובמיקום האנטומי שלהם לאורך כל המעבר של הזחל לבוגר, בעיקר במהלך עיצוב מחדש של מטמורפוזה מסיבית. קביעת סטנדרטים חזקים לזיהוי ונתיחת איברים היא חיונית כדי להבטיח שמערכי נתונים הנובעים ממחקרים שבוצעו במעבדות שונות יוכלו להיות עקביים. הפרוטוקול הנוכחי מזהה שישה מהאיברים בקסנופוס הבוגר, ומדגים שיטות לדיסקציה ודגימה של חדר הלב, הכבד, גוף השומן, הלבלב, הכליה הזוגית והעור של הקסנופוס הבוגר. בהתאם לשיטות השימור, האיברים המנותחים יכולים לשמש לפרוטאומיקה כמותית, שעתוק תא בודד/גרעינים, הכלאה באתר , אימונוהיסטוכימיה, היסטולוגיה ועוד. פרוטוקול זה נועד לתקנן את דגימת הרקמות ולהקל על חקירות רב-מעבדתיות של מערכות האיברים הבוגרים.

Introduction

למרות ש"הדיסקציה הדיגיטלית" של קסנופוס בוגר זמינה¹, דגימת איברים ורקמות הניתנים לשכפול של קסנופוס בוגר נותרה מאתגרת ללא ההוראה המפורטת הזמינה עבור מודלים בוגרים אחרים (למשל עכברים ^2,3,4). מאמר זה נועד לספק הנחיות ברורות לדגימת איברים מדויקת וניתנת לשכפול של קסנופוס בוגר בדומה למה שזמין כיום עבור הזחלים שלהם⁵. דגש מושם על קלות ההשלמה כדי לשמור על טריות מקסימלית ולהנגיש את הפרוטוקול לכל המשתמשים.

למרות שיש מדריך דיסקציה יסודי עבור Rana ^sp.6, כמו גם מדריכים רבים לנתיחה בכיתה עבור anurans^{אחרים 7}, אין מדריך דיסקציה ודגימה של Xenopus זמין כרגע. עבור אלה שאינם מכירים שיטות דגימה או אנטומיה של דו-חיים, ההבדלים הקטנים בין Xenopus לבין אנוארים אחרים הופכים משאבים אלה לתת-אופטימליים עבור דגימת רקמות הניתנת לשכפול.

רקמות יקרות ערך רבות אינן כלולות ואף מושלכות במדריך הנוכחי; זאת על מנת להבטיח רעננות רקמות. שש דגימות מוגבלות מספיק כדי להבטיח שניתן יהיה לאסוף רקמות אלה תוך פחות משעה לאחר שהלב מתחיל לפעום, ללא קשר לניסיון או לרמת המיומנות של המשתמש. מדריכים מתקדמים ומפורטים יותר לאיסוף רקמות רבות אחרות נמצאים בהכנה כניירות נלווים נפרדים.

למשתמשים פחות מנוסים, מומלץ תמיד לנסות תחילה פרוטוקול זה על בעלי חיים המורדמים מסיבות שאינן ניסויים לפני דגימת בעלי חיים מאתגרים להחלפה (למשל, טרנסגניים, בעלי חיים בגיל מתקדם וכו'). באופן אידיאלי, כל בעלי החיים שנדגמו יהיו בריאים, ואם נקבה, לא היו מבייצים בשבועיים האחרונים.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של בית הספר לרפואה של הרווארד IACUC (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) (IS 00001365_3). התוצאות המייצגות מוצגות הן עבור זכר לבקנים בוגר והן עבור זכר לבקנים בוגר שאינו מחורר.

1. הכנה ניסיונית

הערה: אם מתבצע פרוטוקול זילוח⁸ לפני הדגימה, דלג לשלב 2.2.

1. ודא שמוסד המחקר אישר את טכניקת המתת החסד המתוארת בפרוטוקול זה.
2. הכינו תמיסה של 5 גרם/ליטר MS-222 (טריקאין מתאן-סולפונט) ו-5 גרם/ליטר סודיום ביקרבונט (ראו טבלת חומרים). הנפח חייב להיות גדול מהנפח הדרוש כדי לכסות את בעלי החיים המומתים לחלוטין. בדוק את ה- pH כדי לוודא שהוא ≥7.
3. לבצע המתת חסד ראשונית על ידי הצבת Xenopus בתמיסת המתת חסד; בעל החיים יישאר שקוע במשך שעה אחת בסך הכל.
4. הגדר את תחנת הדיסקציה כך שמיד לאחר הדגימה, ניתן יהיה לשטוף את כל הרקמות ב- PBS מקורר או 0.7x PBS⁹ (בהתאם לצרכי הניסוי), לבדוק ולקצץ תחת אור הגדלה פי 5 (או יותר). עמדה זו חייבת גם לאפשר למשתמש להחליף את כל המלקחיים והמספריים או לנגב אותם בין שימושים.
5. לאחר שהצפרדע הייתה בתמיסה במשך שעה אחת, המתת חסד ראשונית הושלמה. הסר את הצפרדע ובדוק את אובדן תגובת הכאב על ידי ביצוע צביטה ברגל.
6. רשום את הפרטים המתאימים לבעל החיים, כגון מין, זן, מין, גיל ומצב בריאותי, כמו גם אם הוא היה מחורר. שקול את ה- Xenopus ובצע מדידות נוספות, כגון אורך פתח החוטם.
7. הניחו את הצפרדע על גבה והצמידו את הגפיים באופן פרוקסימלי לגוף (איור 1).
8. בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך דרך העור, במעלה קו האמצע, ולאחר מכן לרוחב, עושה שני דשים.
9. בהתייחס לאיור 2, זהו את linea alba והשתמשו במלקחיים כדי לתפוס אותו ולמשוך אותו הרחק מהחלל הקואלומי. חותכים דרך השרירים בזהירות באמצעות מספריים. צור שני דשים מקיר החלל. גזור או נעץ את כל הדשים מהדרך.
10. זהה את הלב שעדיין פועם. השתמשו במספריים מנתחים כדי להקטין את עצמות הקוראקואיד (איור 2) כדי לקבל גישה טובה יותר ללב.
    הערה: אם הלב הפסיק לפעום לפני הדגימה, יש לציין כי טריות הדגימה נפגעה.

2. דגימה

הערה: אם בעל החיים היה מחורר, דלג לשלב 2.2.

1. זהו את קרום הלב הדק ומשכו אותו מתוח בעזרת מלקחיים רקמתיים (איור 3).
2. באמצעות קצה מספריים iridectomy, בעדינות לנקב את קרום הלב, נזהר לא לחתוך את הרקמות הבסיסיות. מקלפים את קרום הלב הרחק משלושת חדרי הלב.
3. השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את החדר לפי הקודקוד, לזהות היכן הוא מתחבר לגזע האאוריקלי ולגזע העורקי (איור 4), וחתכו אותו מתחת לחיבורים האלה (איור 5). במידת הצורך, חתכו את החדר כך שלא יראו רקמות מהאוריקלים או מגזע העורק, ורקמת שסתום בהירה עדיין תיראה בתוך החדר.
   הערה: בבעלי חיים שאינם מחוררים, הסרת החדר עשויה להיחשב כהמתת חסד משנית.
4. 3 האונות של הכבד ייראו (איור 6 ואיור 7). אחזו בשפה של האונה השמאלית (מימין לצופה) והרימו אותה בעדינות כך שצינורות הכבד והציסטיק יהיו גלויים לעין (איור 8). דגמו את 1/3 האונה התחתונה מתחת לקבצים המצורפים האלה (איור 9).
5. כדי לקבל גישה טובה יותר לרקמות של צפרדע נקבה, כדאי להסיר את השחלה. זהה את השחלה אשר עטופה בשכבה של הצפק הקרבי הנקרא אפיתל הנבט. הזיזו בעדינות את האונות עד שהן נמצאות בצדדים שלהן כדי להפוך את אזור החיבור לגלוי (איור 10). חיבורים אלה הם גחונים ישירות לכליה הזוגית.
6. בעזרת מספריים, הסירו את השחלות קרוב ככל האפשר לכליות מבלי לפגוע בהן (איור 11).
7. בדקו את האונה האמצעית (שנקראת גם האונה הקדמית) של הכבד ושימו לב כיצד היא מתחברת לקיבה ולתריסריון דרך המזנטריה וצינור הפטופנקריאטי (שנקרא גם צינור המרה המשותף) (איור 6, איור 7 ואיור 8).
8. לנתק את הרצועה mesentery, hepatoduodenal באמצעות מספריים iridectomy, כמו גם את צינור hepatopancreatic שבו הוא פוגש את התריסריון. נתקו את החיבור של הלבלב וצינור הכבד לאונה האמצעית של הכבד כך שלא תצורף רקמת כבד כהה (איור 12).
9. אחוז את הבטן עם מלקחיים שיניים ואת הקצה העליון של הלבלב עם מלקחיים רקמות. תחת הגדלה של פי 5, הרחיקו בעדינות את הלבלב מהקיבה (איור 13).
   הערה: אם הוא לא יוצא בצורה נקייה, רקמת הלבלב הנותרת תהיה גלויה וניתן לקטוף אותה בשברים. לחלופין, ניתן לנתק את הלבלב באופן שיטתי באמצעות מספריים אירידקטומיים ומלקחיים רקמות.
10. בהתייחס לאיור 14A, זהו את שלפוחית השתן והוציאו אותה, תוך חיתוך קרוב ככל האפשר לקלואקה. השליכו את הרקמה הזו.
11. בהתייחס לאיור 14B, זהו את המעי הגס ומשכו אותו מתוח כדי לנתק את המעי הגס קרוב ככל האפשר לקלואקה. הסר והשליך את כל תעלת alimentary, ניתוק הצפק שבו הוא מתחבר לטחול. הגופות השמנות יהיו כעת נגישות במלואן.
12. להקניט את הגופים השמנים כך שהם יהיו בצד שלהם. האזור מעל הכליה, שבו גוף השומן מתחבר לצפק, יהיה גלוי. אחזו בבסיס גוף השומן השמאלי (מימין לצופה) והשתמשו במספריים כדי לחתוך אותו מהצפק, תוך השארת שוליים קטנים כדי שהכליה לא תיפגע (איור 15).
13. הסר והשלך את הגוף השמן שנותר. הכליות הזוגיות יהיו כעת גלויות במלואן.
14. אצל נקבות צפרדעים או זכרים עם שרידי אובידוקט מובהקים, אחזו באובידוקט ומשכו אותו הרחק מהכליה ומהקלואקה (איור 16). חותכים את האובידוקט במקום שבו הוא פוגש את הקלואקה וממשיכים למשוך אותו הרחק מהכליה, חותכים את כל החיבורים הצפקיים הברורים כשהם מתגלים. השליכו את הרקמה הזו.
15. חזור על תהליך זה עם האובידוקט הנותר.
16. הכליות עדיין מכוסות בצפק שקוף (retroperitoneal)¹⁰. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הכליות ולנתק את הצפק בקצה התחתון שלהם.
17. הרימו את הכליות מהחלל הקואלומי באמצעות מספריים כדי לנתק את הצפק קרוב ככל האפשר לכליות מבלי לפגוע בהן (איור 17).
18. תחת הגדלה של פי 5, יש לחתוך את עודפי הצפק וכל רקמה אחרת שנותרה (גופי שומן, טחול). אם הצפרדע נקבה, יש לוודא שכל רקמת השחלה שנותרה מוסרת (איור 18). אם הצפרדע זכרית, הסירו בזהירות את האשכים ובדקו אם יש שריד של ביצית, שייתכן שלא ייראה לעין ללא הגדלה (איור 19).
19. הסר את הסיכות מהחיה, הפוך אותה על הגחון שלה, ונעץ מחדש את גפיו של החיה.
20. בחר אחת מהגפיים האחוריות כדי לדגום ממנה ולהצמיד את כף הרגל של איבר זה.
21. הסירו דש עור בצורת שקד מעל הגסטרוקנמיוס/טיביופיבולה (איור 20).

תוצאות

על-ידי שימוש באיור 1 עד איור 20 וביצוע כל השלבים של פרוטוקול זה, חדר הלב, האונה השמאלית של הכבד, הלבלב, גופי השומן השמאליים, הכליות הזוגיות ודש העור נכרתו באופן נקי תוך שעה מהמתת חסד. בתוך הזמן הזה, הדגימות נשטפות ונחתכות כך שהן יופיעו, כפי שמוצג באיו...

Discussion

מכיוון שפרוטוקול זה נועד למקסם את הטריות, דגימות מסוימות עשויות לכלול רקמות לא רצויות. לדוגמה, צינור hepatopancreatic וכמה mesentery נדגמים עם הלבלב, וכמה רקמת הצפק, בלוטות יותרת הכליה, שופכנים תמיד יידגמו עם הכליות זוג.  אם טריות אינה מהווה דאגה, ניתן להשיג דגימה מדויקת יותר באמצעות טכניקות מותאמות.

...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying Glass with LED Light and Stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable Transfer Pipets	VWR	414004-036
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection Tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Iridectomy Scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Sodium Bicarbonate, Powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen Forceps, Serrated	VWR	82027-442
T-Pins for Dissecting	Fisher Scinetific	S99385