成年非洲爪蟾六个关键器官快速取样技术

摘要

本文介绍了在成年 非洲爪蟾 中可以快速轻松地访问的六个重要且多样化的器官样本指南：心室、肝叶、胰腺、脂肪体、成对的肾脏和皮肤。

摘要

一百多年来，非洲爪蟾一直是理解脊椎动物发育和疾病的强大模式生物。虽然胚胎的实验分析和解剖技术已经有充分的记录，但对成年非洲爪蟾结构和器官的描述，以及与成人一起工作的技术，尚未得到更新，以考虑到定量蛋白质组学和单细胞转录组学等现代方法的要求。从细胞类型和基因为中心的视角，需要在胚胎阶段与在成体组织中进行对比观察。在幼虫向成虫的过渡过程中，幼虫器官的整体结构、形态和解剖位置都发生了重大变化，最明显的是在大规模重塑过程中。建立健全的器官鉴定和解剖标准对于确保在不同实验室进行的研究得出的数据集能够保持一致至关重要。本方案确定了成年非洲爪蟾的六个器官，展示了对成年非洲爪蟾的心室、肝脏、脂肪体、胰腺、配对肾脏和皮肤的解剖和取样方法。根据保存方法的不同，解剖器官可用于定量蛋白质组学、单细胞/细胞核转录组学、原位杂交、免疫组化、组织学等。该协议旨在标准化组织取样并促进成人器官系统的多实验室研究。

引言

尽管成年非洲爪蟾的“数字解剖”已经可用¹，但如果没有其他成年模型（例如小鼠^2,3,4）的详细指导，成年非洲爪蟾的可复制器官和组织采样仍然具有挑战性。本文旨在为成年非洲爪蟾的准确和可复制的器官取样提供明确的指导，类似于目前可用于其幼虫的器官取样⁵.强调易于完成，以保持最大的新鲜度，并使所有用户都可以访问该协议。

虽然有针对 Rana ^sp.6 的详尽解剖指南，以及针对其他^{anurans 7} 的大量课堂解剖指南，但目前没有可用的非洲爪蟾解剖和取样指南。对于那些不熟悉采样实践或两栖动物解剖学的人来说，非洲爪蟾和其他无蟾之间的微小差异使得这些资源对于可复制的组织取样来说并不理想。

许多有价值的组织不包括在本指南中，甚至被丢弃;这是为了保证组织的新鲜度。六个样本足够有限，以确保无论使用者的经验或技能水平如何，都可以在心脏开始跳动后一小时内收集到这些组织....

研究方案

所有实验均按照哈佛医学院IACUC（机构动物护理和使用委员会）（IS 00001365_3）的规则和规定进行。灌注和未灌注的成熟白化雄性 非洲爪蟾（Xenopus laevis）的代表性结果均显示。

1. 实验准备

注意：如果在采样前遵循灌注方案⁸ ，请跳至步骤 2.2。

1. 确保研究机构已批准本协议中描述的安乐死技术。
2. 制备 5 g/L MS-222（甲基磺酸三卡因）和 5 g/L 碳酸氢钠的溶液（参见 材料表）。该体积必须大于完全覆盖被安乐死的动物所需的体积。检查 pH 值以确保其为 ≥7。
3. 通过将 非洲爪蟾 放入安乐死溶液中进行初级安乐死;动物将保持在水中总共 1 小时。
4. 设置解剖站，以便在取样后立即在冷冻 PBS 或 0.7x PBS⁹ （取决于实验需要）中冲洗所有组织，检查并在 5x（或更大）放大灯下修剪。该站还必须使用户能够更换所有镊子和剪刀，或者在两次使用之间将它们擦拭干净。
5. 一旦青蛙在溶液中放置 1 小时，初级安乐死就完成了。取出青蛙并通过执行脚捏来检查疼痛反应的丧失。
6. 记录动物的适当详细信息....

讨论

由于该协议旨在最大限度地提高新鲜度，因此某些样品可能包含不需要的组织。例如，肝胰管和一些肠系膜与胰腺一起取样，一些腹膜组织、肾上腺和输尿管将始终与配对的肾脏一起取样。 如果新鲜度不是问题，那么可以使用改进的技术实现更精确的采样。

器官的外观和位置在非洲 爪蟾的性别和物种之间具有可比性。然而，根据动物是否灌注过，组织的颜色会有很大.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying Glass with LED Light and Stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable Transfer Pipets	VWR	414004-036
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection Tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Iridectomy Scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Sodium Bicarbonate, Powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen Forceps, Serrated	VWR	82027-442
T-Pins for Dissecting	Fisher Scinetific	S99385