Erişkin Xenopus'ta Altı Önemli Organı Hızlı Örnekleme Teknikleri

Özet

Bu makale, yetişkin Xenopus'ta hızlı ve kolay bir şekilde erişilebilen altı önemli ve çeşitli organı örneklemek için bir kılavuz sunmaktadır: kalp ventrikülü, karaciğer lobu, pankreas, yağ cisimleri, eşleştirilmiş böbrekler ve cilt.

Özet

Xenopus , yüz yılı aşkın bir süredir omurgalı gelişimini ve hastalıklarını anlamak için güçlü bir model organizma olmuştur. Embriyonun deneysel analizi ve diseksiyon teknikleri iyi belgelenmiş olsa da, yetişkin Xenopus yapılarının ve organlarının tanımları, yetişkinlerle çalışma teknikleriyle birlikte, kantitatif proteomik ve tek hücreli transkriptomik gibi modern yaklaşımların gereksinimlerini dikkate alacak şekilde güncellenmemiştir. Hücre tipi ve gen merkezli bakış açıları, embriyonik aşamalarda yetişkin dokulardakilerle zıt gözlemler gerektirir. Larva organları, larvadan yetişkine geçiş boyunca, özellikle büyük metamorfoz yeniden şekillenmesi sırasında, genel yapılarında, morfolojilerinde ve anatomik konumlarında önemli değişikliklere uğrar. Organ tanımlama ve diseksiyon için sağlam standartlar oluşturmak, farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilen çalışmalardan elde edilen veri kümelerinin tutarlı olmasını sağlamak için çok önemlidir. Bu protokol, yetişkin Xenopus'taki altı organı tanımlayarak, yetişkin Xenopus'un kalp ventrikülü, karaciğer, yağ gövdesi, pankreas, eşleştirilmiş böbrek ve cildin diseksiyonu ve örneklenmesi için yöntemleri göstermektedir. Koruma yöntemlerine bağlı olarak, diseke edilen organlar kantitatif proteomik, tek hücreli/çekirdekli transkriptomik, in situ hibridizasyon, immünohistokimya, histoloji vb. için kullanılabilir. Bu protokol, doku örneklemesini standardize etmeyi ve erişkin organ sistemlerinin çok laboratuvarlı araştırmalarını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Yetişkin Xenopus'un "dijital diseksiyonu" mevcut olsa da,¹, yetişkin Xenopus'un tekrarlanabilir organ ve doku örneklemesi, diğer yetişkin modeller (örneğin fareler ^2,3,4) için mevcut olan ayrıntılı talimatlar olmadan zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, larvaları için şu anda mevcut olana benzer şekilde yetişkin Xenopus'un doğru ve tekrarlanabilir organ örneklemesi için net bir rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır⁵. Maksimum tazeliği korumak ve protokolü tüm kullanıcılar için erişilebilir kılmak için tamamlama kolaylığına vurgu yapılır.

Rana ^sp.6 için kapsamlı bir diseksiyon kılavuzunun yanı sıra diğer anuranlar⁷ için çok sayıda sınıf diseksiyon kılavuzu olmasına rağmen, şu anda Xenopus diseksiyon ve örnekleme kılavuzu mevcut değildir. Örnekleme uygulamalarına veya amfibi anatomisine aşina olmayanlar için, Xenopus ve diğer anuranlar arasındaki küçük farklılıklar, bu kaynakları tekrarlanabilir doku örneklemesi için yetersiz hale getirir.

Bu kılavuzda pek çok değerli doku dahil edilmemiştir ve hatta atılmıştır; Bu doku tazeliğini sağlamak içindir. Altı örnek, kullanıcının deneyimi veya beceri düzeyi ne olursa olsun, bu dokuların kalp atmaya başladıktan sonra bir saatten kısa sürede toplanabilmesini sağlayacak kadar sınırlıdır. Diğer birçok dokuyu toplamak için daha gelişmiş ve ayrıntılı kılavuzlar, ayrı tamamlayıcı makaleler olarak hazırlanmaktadır.

Daha az deneyimli kullanıcılar için, bu protokolün, değiştirilmesi zor olan herhangi bir hayvanı (yani, transgenikler, ileri yaştaki hayvanlar, vb.) örneklemeden önce, deney dışındaki nedenlerle ötenazi yapılan hayvanlar üzerinde denenmesi her zaman önerilir. İdeal olarak, örneklenen tüm hayvanlar sağlıklı olacak ve eğer dişiyse, son iki hafta içinde yumurtlanmamış olacaktır.

Protokol

Tüm deneyler Harvard Tıp Fakültesi IACUC (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi) (IS 00001365_3) kural ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Temsili sonuçlar hem perfüze edilmiş hem de perfüze edilmemiş olgun albino erkek Xenopus laevis için gösterilmiştir.

1. Deneysel hazırlık

NOT: Numune almadan önce perfüzyon protokolü⁸ takip ediliyorsa, adım 2.2'ye geçin.

1. Araştırma kurumunun bu protokolde açıklanan ötenazi tekniğini onayladığından emin olun.
2. 5 g/L MS-222 (trikain metansülfonat) ve 5 g/L sodyum bikarbonattan oluşan bir çözelti hazırlayın (bkz. Hacim, ötenazi yapılan hayvanları tamamen kaplamak için gereken hacimden daha büyük olmalıdır. ≥7 olduğundan emin olmak için pH'ı kontrol edin.
3. Xenopus'u ötenazi çözeltisine yerleştirerek birincil ötenazi gerçekleştirin; Hayvan toplam 1 saat su altında kalacaktır.
4. Diseksiyon istasyonunu, örneklemeden hemen sonra tüm dokular soğutulmuş PBS veya 0.7x PBS^9'da (deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak) durulanabilecek, kontrol edilebilecek ve 5x (veya daha büyük) büyütme ışığı altında kesilebilecek şekilde ayarlayın. Bu istasyon aynı zamanda kullanıcının tüm forsepsleri ve makasları değiştirmesini veya kullanımlar arasında silerek temizlemesini sağlamalıdır.
5. Kurbağa 1 saat boyunca çözelti içinde kaldıktan sonra, birincil ötenazi tamamlanmıştır. Kurbağayı çıkarın ve bir ayak çimdikleme yaparak ağrı tepkisi kaybını kontrol edin.
6. Tür, tür, cinsiyet, yaş ve sağlık durumu gibi hayvan için uygun ayrıntıların yanı sıra perfüze edilip edilmediğini kaydedin. Xenopus'u tartın ve burun-havalandırma uzunluğu gibi ek ölçümler yapın.
7. Kurbağayı sırt üstü yatırın ve vücudun proksimalindeki uzuvları aşağı doğru sabitleyin (Şekil 1).
8. Diseksiyon makası kullanarak cildi kesin, orta çizgiye kadar kesin ve ardından yanal olarak iki flep yapın.
9. Şekil 2'ye atıfta bulunarak, linea alba'yı tanımlayın ve onu kavramak ve sölomik boşluktan uzaklaştırmak için forseps kullanın. Makas kullanarak kas sistemini dikkatlice kesin. Boşluk duvarından iki kanat açın. Tüm kanatları kesin veya sabitleyin.
10. Hala atmakta olan kalbi belirleyin. Kalbe daha iyi erişim sağlamak için korakoid kemikleri küçültmek için diseksiyon makası kullanın (Şekil 2).
    NOT: Numune almadan önce kalp atmayı durdurduysa, numune tazeliğinin bozulduğuna dikkat edilmelidir.

2. Örnekleme

NOT: Hayvan perfüze edilmişse, adım 2.2'ye geçin.

1. İnce perikardı tanımlayın ve doku forseps ile gergin bir şekilde çekin (Şekil 3).
2. İridektomi makasının ucunu kullanarak, alttaki dokuları kesmemeye dikkat ederek perikardı nazikçe delin. Perikard'ı kalbin 3 odasından soyun.
3. Ventrikülü apeksten kavramak için forseps kullanın, kulak kepçelerine ve arteriyel gövdeye nerede bağlandığını belirleyin (Şekil 4) ve bu ataşmanların altından kesin (Şekil 5). Gerekirse, ventrikülü, kulak kepçelerinden veya arteriyel gövdeden hiçbir doku görünmeyecek ve ventrikül içinde açık renkli kapak dokusu görünmeye devam edecek şekilde kesin.
   NOT: Perfüze edilmemiş hayvanlarda, ventrikülün çıkarılması ikincil ötenazi olarak nitelendirilebilir.
4. Karaciğerin 3 lobu görünür olacaktır (Şekil 6 ve Şekil 7). Sol lobun dudağını (izleyicinin sağında) kavrayın ve karaciğer ve kistik kanallar görünecek şekilde yavaşça kaldırın (Şekil 8). Bu ataşmanların altındaki lobun alt 1 / 3'ünü örnek alın (Şekil 9).
5. Dişi bir kurbağanın dokularına daha iyi erişim sağlamak için yumurtalığı çıkarmak faydalı olacaktır. Germinal epitel adı verilen bir viseral periton tabakasıyla sarılmış yumurtalığı tanımlayın. Bağlantı alanını görünür hale getirmek için lobları kendi yanlarına gelene kadar yavaşça kaydırın (Şekil 10). Bu ataşmanlar doğrudan eşleştirilmiş böbreğe ventraldir.
6. Makas kullanarak, yumurtalıkları böbreklere zarar vermeden mümkün olduğunca yakın bir şekilde çıkarın (Şekil 11).
7. Karaciğerin medial lobunu (ön lob olarak da adlandırılır) inceleyin ve mezenter ve hepatopankreatik kanal (aynı zamanda ortak safra kanalı olarak da adlandırılır) yoluyla mide ve duodenuma nasıl bağlandığını not edin (Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8).
8. İridektomi makası kullanarak mezenteri, hepatoduodenal ligamenti ve duodenum ile birleştiği hepatopankreatik kanalı kesin. Pankreas ve hepatopankreatik kanalın karaciğerin medial lobuna bağlantısını keser, böylece koyu renkli karaciğer dokusu bağlanmaz (Şekil 12).
9. Dişli forseps ile mideyi ve doku forseps ile pankreasın üst ucunu kavrayın. 5x büyütme altında, pankreası mideden nazikçe uzaklaştırın (Şekil 13).
   NOT: Temiz bir şekilde çıkmazsa, kalan pankreas dokusu görünür olacak ve parçalar halinde toplanabilir. Alternatif olarak, pankreas iridektomi makası ve doku forsepsleri kullanılarak metodik olarak ayrılabilir.
10. Şekil 14A'ya atıfta bulunarak, idrar kesesini tanımlayın ve kloaka mümkün olduğunca yakın keserek çıkarın. Bu dokuyu atın.
11. Şekil 14B'ye bakınca, kalın bağırsağı tanımlayın ve kalın bağırsağı kloaka mümkün olduğunca yakın kesmek için gergin bir şekilde çekin. Tüm sindirim kanalını çıkarın ve atın, dalağa bağlandığı yerdeki peritonu kesin. Şişman bedenler artık tamamen erişilebilir olacak.
12. Şişman cisimleri kendi taraflarında olacak şekilde ayırın. Şişman cismin karın zarına bağlandığı böbrek üzerindeki alan görünür olacaktır. Sol yağ gövdesinin tabanını (izleyicinin sağında) kavrayın ve böbreğin zarar görmemesi için küçük bir kenar boşluğu bırakarak peritondan kesmek için makas kullanın (Şekil 15).
13. Kalan yağ gövdesini çıkarın ve atın. Eşleştirilmiş böbrekler artık tamamen görünür olacaktır.
14. Dişi kurbağalarda veya belirgin körelmiş yumurta kanallarına sahip erkeklerde, bir yumurta kanalını kavrayın ve onu böbrek ve kloakadan uzaklaştırın (Şekil 16). Yumurta kanalını kloaka ile birleştiği yerden kesin ve böbrekten uzaklaştırmaya devam edin, belirgin hale geldikçe net peritoneal ekleri kesin. Bu dokuyu atın.
15. Bu işlemi kalan yumurta kanalı ile tekrarlayın.
16. Böbrekler hala berrak periton (retroperitoneal) ile ^kaplıdır10. Böbrekleri kavramak için forseps kullanın ve peritonu alt uçlarından kesin.
17. Böbreklere zarar vermeden peritonu mümkün olduğunca yakın kesmek için makas kullanarak böbrekleri sölomik boşluktan kaldırın (Şekil 17).
18. 5x büyütme altında, fazla peritonu ve kalan diğer dokuları (yağ gövdeleri, dalak) kesin. Kurbağa dişiyse, kalan yumurtalık dokusunun çıkarıldığından emin olun (Şekil 18). Kurbağa erkekse, testisi dikkatlice çıkarın ve büyütme olmadan görülemeyen körelmiş bir yumurta kanalı olup olmadığını kontrol edin (Şekil 19).
19. Hayvanın pimlerini çıkarın, ventrumunun üzerine çevirin ve hayvanın uzuvlarını yeniden sabitleyin.
20. Örnekleme için arka bacaklardan birini seçin ve o uzvun ayağını sabitleyin.
21. Gastroknemius/tibiofibula üzerinden badem şeklinde bir deri flebi çıkarın (Şekil 20).

Sonuçlar

Şekil 1'den Şekil 20'ye kadar kullanılarak ve bu protokolün tüm adımlarını izleyerek, kalp ventrikülü, karaciğerin sol lobu, pankreas, sol yağ cisimleri, eşleştirilmiş böbrekler ve bir deri flebi ötenaziden sonraki bir saat içinde temiz bir şekilde eksize edildi. Bu süre içinde numuneler, Şekil 21'de gösterildiği gibi görünecek şekilde durulanır ve kesilir.

Tartışmalar

Bu protokol tazeliği en üst düzeye çıkarmayı amaçladığından, bazı örneklerde istenmeyen dokular bulunabilir. Örneğin, hepatopankreatik kanal ve bazı mezenterler pankreas ile örneklenir ve bazı periton dokusu, adrenal bezler ve üreterler her zaman eşleştirilmiş böbrekler ile örneklenir.  Tazelik bir endişe kaynağı değilse, modifiye teknikler kullanılarak daha hassas örnekleme elde edilebilir.

Organların görünümü ve yeri, cinsiyetler ve Xenopus türler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying Glass with LED Light and Stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable Transfer Pipets	VWR	414004-036
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection Tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Iridectomy Scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Sodium Bicarbonate, Powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen Forceps, Serrated	VWR	82027-442
T-Pins for Dissecting	Fisher Scinetific	S99385