במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד, תרבית ופנוטיפ של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מרקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVECs). בנוסף, אנו מתארים מודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים (MVECs) יש תפקידים קריטיים רבים, כולל שליטה בטונוס כלי הדם, ויסות פקקת ואנגיוגנזה. הטרוגניות משמעותית בגנוטיפ ובפנוטיפ של תאי אנדותל (EC) תלויה במיטת כלי הדם שלהם ובמצב המחלה של המאכסן. היכולת לבודד MVEC ממיטות כלי דם ספציפיות לרקמות ומקבוצות חולים בודדות מציעה הזדמנות להשוות ישירות את תפקוד MVEC במצבי מחלה שונים. כאן, באמצעות רקמת שומן תת-עורית (SAT) שנלקחה בזמן החדרת התקנים אלקטרוניים מושתלי לב (CIED), אנו מתארים שיטה לבידוד של אוכלוסייה טהורה של רקמת שומן תת-עורית אנושית תפקודית MVEC (hSATMVEC) ומודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC בודדו בעקבות עיכול אנזימטי של SAT על ידי דגירה עם חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים נגד CD31 ומעבר דרך עמודים מגנטיים. hSATMVEC גודלו ועברו על צלחות מצופות ג'לטין. ניסויים השתמשו בתאים במעברים 2-4. התאים שמרו על מאפיינים קלאסיים של מורפולוגיית EC לפחות עד מעבר 5. הערכה ציטומטרית של זרימה הראתה טוהר של 99.5% של hSATMVEC מבודד, המוגדר כ- CD31+/CD144+/CD45-. hSATMVEC מבודד מקבוצת ביקורת היה זמן הכפלת אוכלוסייה של כ -57 שעות, והתפשטות פעילה אושרה באמצעות ערכת הדמיה של התפשטות תאים. תפקוד hSATMVEC מבודד הוערך באמצעות התגובה שלהם לגירוי אינסולין ופוטנציאל יצירת צינור אנגיוגני. לאחר מכן הקמנו מודל של תרבית משותפת של אדיפוציט תת-עורי hSATMVEC כדי לחקור דיבור צולב תאי והדגמנו השפעה במורד הזרם של hSATMVEC על תפקוד האדיפוציט.
ניתן לבודד hSATMVEC מ- SAT שנלקח בזמן החדרת CIED והם בעלי טוהר מספיק הן לפנוטיפ ניסיוני והן לחקר hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
תאי אנדותל (ECs) הם תאי קשקש המרפדים את פני השטח הפנימיים של דופן כלי הדם כחד-שכבתיים. יש להם תפקידים חיוניים רבים, כולל שליטה על טונוס כלי הדם, ויסות פקקת, ויסות התגובה הדלקתית, ותרומה אנגיוגנזה1. בהתחשב בחשיבותם של תאי אנדותל בפיזיולוגיה קרדיומטבולית, הם משמשים לעתים קרובות באופן ניסיוני כדי לקדם את ההבנה של פתופיזיולוגיה ולבחון טיפולים פרמקולוגיים חדשים למחלות לב מטבוליות.
עם זאת, קיימת הטרוגניות עצומה במורפולוגיה של תאי אנדותל, תפקוד, ביטוי גנים והרכב אנטיגן בהתאם למקור מיטת כלי הדם שלהם2. בעוד שתאי אנדותל מעורקים גדולים מתאימים ביותר למחקרי טרשת עורקים, תאי אנדותל מכלי דם קטנים, המכונים תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים (MVECs), מתאימים יותר למחקרי אנגיוגנזה2. הבנת הבסיס המולקולרי להטרוגניות האנדותל עשויה לספק תובנות חשובות לגבי טיפולים ספציפיים למיטת כלי דם. תפקוד האנדותל המיקרו-וסקולרי שונה באופן משמעותי גם במחלות רבות, כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם וזיהום מערכתי 3,4. לכן, היכולת לבודד תאי אנדותל מקבוצות חולים מוגדרות מאפשרת השוואה ישירה של תפקוד תאי האנדותל שלהם והצלבה תאית5.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה חדשנית לבידוד MVECs אנושיים מרקמת שומן תת-עורית (hSATMVEC) שנלקחה בזמן החדרת מכשיר אלקטרוני מושתל לב (CIED). hSATMVEC שבודדו בעקבות עיכול אנזימטי של רקמת שומן תת-עורית (SAT) גודלו ועברו על לוחות מצופים ג'לטין. לאחר מכן אנו מתארים מגוון של בדיקות פנוטיפ שיושמו בהצלחה על hSATMVECs על מנת לאמת את הפנוטיפ שלהם ולהדגים שימוש בבדיקות שגרתיות של תאי אנדותל. לבסוף, אנו מתארים יישום של hSATMVECs במודל ניסיוני של hSATMVECs-adipocyte cross-talk.
דגימות הרקמה האנושית המשמשות בטכניקה המתוארת נלקחו מחולים שעברו החדרה של CIEDs על פי פרקטיקה קלינית שגרתית בבתי החולים לידס NHS Trust (לידס, בריטניה). פרוטוקול המחקר, יחד עם כל המסמכים האחרים, אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (11/YH/0291) לפני רישום המשתתפים. המחקר נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי.
1. אוכלוסיית החולים
2. בידוד תאי אנדותל ותרבית
הערה: סכימה לבידוד hSATMVEC מוצגת באיור 1.
3. ציטומטריית זרימה
4. זמן הכפלת תאי אנדותל והתפשטות תאים (איור 3)
5. היווצרות צינור תאי אנדותל
6. גירוי אינסולין של hSATMVEC
7. הקמת תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte (איור 4)
הערה: בתוצאות שלהלן, נעשה שימוש מסחרי בקדם-אדיפוציטים תת-עוריים לבנים אנושיים במעבר 2 מתורם קווקזי זכר יחיד בכל בדיקות האדיפוציטים. פרדיפוציטים הורחבו בתחילה מהבקבוקון שסופק על ידי הספק (מעבר 0) לשנים עשר קריובלים המכילים מדיית הקפאה cryo-SFM (מעבר 1).
8. אדיפוציט 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBD)-ספיגת גלוקוז
טוהר ופנוטיפ hSATMVEC
hSATMVEC מבודד ממטופלי ביקורת (כלומר, אנשים ללא היסטוריה של מחלות לב-מטבוליות) היו 99.5% CD31+CD144+CD45- על ציטומטריית זרימה (איור 2). ל-hSATMVEC מבודד הייתה מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת האופיינית ל-ECs (איור 3A). זמן הכפלת האוכלוסייה הממוצע של hSATMVECs היה 56.6 שעות ±-8.1 שעות (ממוצע ± SEM, n = 10) (איור 3B), ושכפול דנ"א פעיל ב-hSATMVECs אושר באמצעות ערכת הדמיה של התפשטות תאים (איור 3C).
hSATMVEC התנהג כמו MVECs מתפקדים ויצר צינורות במטריג'ל (איור 3D). הביטוי היחסי של חלבוני מפתח המעורבים במסלול איתות האינסולין Akt-eNOS מוצג באיור 3E. גם eNOs וגם Akt הדגימו עלייה בזרחון המושרה על ידי אינסולין, המיוצג כיחס בין חלבון זרחן/חלבון כולל מנורמל ל-ß-actin (איור 3E).
hSATMVEC-adipocyte תרבות משותפת
מודל להמחשה של תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte ניתן לראות באיור 4A. ככל שהקדם-אדיפוציטים הלבנים התת-עוריים האנושיים נעשים מובחנים יותר, ניתן להבחין בהתפתחות של ואקולים ליפידים (איור 4B), אשר ניתן לכמת באמצעות צביעת שמן אדום O (איור 4B).
ניגודיות פאזה להמחשה והדמיית פלואורסצנטיות (עירור 440-480 ננומטר/פליטה 504-544 ננומטר) של אדיפוציטים ממוינים לאחר 30 דקות דגירה עם גלוקוז 2-NBD של 20 מיקרומטר מוצגים באיור 4C. ניתן לכמת ספיגת גלוקוז על ידי מדידת שטח ירוק כאחוז משטח התא הכולל.
איור 1: סכמטי המדגים את הקציר והעיבוד של hSATMVECs לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תפוקה אופיינית של ניתוח ציטומטריית זרימה של hSATMVECs בתרבית. (A) תרשים פיזור של אזור פיזור צדדי (SSC-A) ואזור פיזור קדמי (FSC-A) המראה gating (תיבה אדומה) של hSATMVECs בתרבית סביב צפיפות אוכלוסיית תאים ספציפית. (B) תרשים פיזור של רוחב פיזור קדמי (FSC-Width) ו-FSC-A המציג gating (תיבה אדומה) של hSATMVECs בתרבית סביב צפיפות אוכלוסיית תאים ספציפית. (C) היסטוגרמה המראה פלואורסצנטיות של תאים מגודרים ל-CD45-FITC. (D) תרשים פיזור של עוצמת פלואורסצנטיות של CD144-PE (ציר x) ו- CD31-PerCP (ציר y). (E) היסטוגרמה המראה פלואורסצנטיות של תאים מגודרים ל-CD144-PE. (F) היסטוגרמה המראה פלואורסצנטיות של תאים מגודרים ל-CD31-PerCP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פנוטיפ hSATMVEC. (A) תמונה במיקרוסקופ אור של hSATMVEC ליד מפגש המראה דמוי אבן מרוצפת. (B) זמן הכפלה hSATMVEC - מיקרוסקופ אור של HATEC בהפרש של 24 שעות מדגים את מידת התפשטות התאים. (C) התפשטות hSATMVEC. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של hSATMVEC עם יודיד פרופידיום ו-EdU/Alexa-fluor 488 מנבדקי ביקורת. (D) היווצרות צינור hSATMVEC מנבדקי ביקורת (תמונות שצולמו בהגדלה פי 4). (E) גירוי אינסולין של HATECs - מראה ביטוי יחסי של Akt זרחני (סרין 473) לסך הכל Akt (פאנל שמאלי) eNOS פוספורילציה (serine 1177) לסך eNOS (פאנל ימני) בריכוזי אינסולין הולכים וגדלים עם כתמים מערביים להמחשה מתחת מתוקננים ל-B-actin. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. גדלים לדוגמה נמצאים מתחת לכל חלונית. קיצורים: 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של רקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVEC), שגיאת תקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte. (A) תמונה סכמטית של תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte. (B) התמיינות של אדיפוציטים. הפאנל השמאלי מראה קדם-אדיפוציטים ביום 0 והפאנל הימני מראה אדיפוציטים מובחנים ביום 10 לאחר הוספת PDM. האיור התחתון מראה את כמות השומנים המאוחסנים באדיפוציטים ובפראדיפוציטים המוכתמים בשמן אדום O. (C) בדיקת ספיגת גלוקוז. הפאנל השמאלי מראה הדמיית פאזה של אדיפוציטים לאחר תרבית משותפת ודגירה, עם 20 מיקרומטר של גלוקוז 2-NBD למשך 30 דקות. הפאנל הימני מציג הדמיה ירוקה שממנה ניתן לכמת את ספיגת הגלוקוז (כאחוז ירוק מהשטח הכולל). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. קיצורים: יום 10 (D10), רקמת שומן תת-עורית אנושית תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים (hSATMVEC), מדיה להתמיינות קדם-אדיפוציט (PDM) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: קוקטייל צביעה לציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
מחקר זה מתאר טכניקה של בידוד hSATMVEC שנלקחה מ- SAT במהלך השתלה שגרתית של CIEDs. אנו מראים כי hSATMVEC מבודד יש טוהר גבוה, מבטא חלבונים transmembrane ספציפיים EC CD144 ו CD31, ולא מראה ביטוי משמעותי של לויקוציטים CD45. אנו ממשיכים להראות כי, באופן ניתן לשחזור ואמין, hSATMVEC מבודד מתרבים וניתן להשתמש בו באופן ניסיוני כדי לחקור את המנגנון התוך-תאי המעורב באיתות אינסולין ואנגיוגנזה. בנוסף ליכולת לתרבית אותם בבידוד, הם יכולים לשמש גם בתרבות משותפת כדי לחקור hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
תאי אנדותל המשמשים במחקר בסיסי ותרגומי מקורם בדרך כלל בכלי דם גדולים, כגון אבי העורקים ווריד הטבור האנושי, או microvasculature. לשני מקורות אלה יש מגבלות משלהם 7,8; תאי אנדותל מכלי דם גדולים קשים לגישה (במקרה של רקמת אבי העורקים) או נגזרים מרקמת ילודים עם פיזיולוגיה וחשיפה סביבתית שונות9. שימוש בתאי אנדותל שבודדו מרקמה שנלקחה במהלך השתלת CIED מאפשר חקירה וניסוי של פיזיולוגיה תאית בקרב קבוצות חולים ספציפיות בעולם האמיתי. CIEDs מושתלים למגוון אינדיקציות, כולל בחולים עם bradyarrhythmias, אי ספיקת לב ומניעה ראשונית ושניונית של tachyarrhythmias החדר10. חולים אלה סובלים לעתים קרובות מתחלואה נלווית מרובה, כולל סוכרת, השמנת יתר ומחלת עורקים כליליים, המהווים מוקד עולמי עיקרי של מחקר לב וכלי דם 11,12,13. יתר על כן, בעוד שהנתונים להמחשה במאמר זה נוגעים לחולי ביקורת, יישמנו טכניקות אלה כדי לבודד ולחקור SATMVEC ממגוון חולים, כולל אלה עם אי ספיקת לב מתקדמת ו / או סוכרת מסוג 2.
לעתים לא רחוקות, אנו נתקלים בבעיות עם תפוקות hSATMVEC נמוכות בעקבות ניסיונות בידוד תאים. ניתן להפחית סיכון זה באופן משמעותי על ידי שימוש בנפח התחלתי גדול יותר של SAT כדי לבודד hSATMVEC. בנוסף, אנו נתקלים בכך בתדירות גבוהה יותר ב- SAT מאנשים עם מחלות לב מטבוליות, ובמיוחד סוכרת.
מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי hSATMVEC מבודד יכול לעבור רק מספר מוגבל של מעברים. מניסיוננו לאחר מעבר 5, ללא קשר לפנוטיפ של המטופל, התפשטות hSATMVEC מואטת באופן משמעותי. בנוסף, hSATMVEC מבודד באמצעות טכניקה זו אינם מתרבים היטב כאשר מאוכלסים בדלילות רבה מדי; לכן, אנו ממליצים לא לעבור hSATMVEC ביחס גדול מ 1:6. כאמור בעמוד 1. הצלחנו להפשיר ולהחיות מחדש hSATMVEC המאוחסן בחנקן נוזלי למשך עד 4 שנים, ומניסיוננו, הסיכוי להנפשה מחדש גדול יותר כאשר אנו משמרים בהקפאה במספר מעבר נמוך יותר (אנו בדרך כלל משמרים בהקפאה hSATMVEC במעבר 2).
רקמה שנלקחה בהחדרת CIED זמינה באופן חופשי וניתן לקצור אותה ללא כל נזק לחולה. לכן, מקור קל לגישה, יחסית לא פולשני של תאי אנדותל מקבוצות חולים אלה הוא בעל תועלת רבה בביצוע מחקר ממוקד. בעוד שהתמונות המייצגות במאמר זה נגזרות מחולי "ביקורת" (כלומר, חולים ללא אבחנה של אי ספיקת לב או סוכרת, אם כי עם אינדיקציה להשתלת CIED), בודדנו בהצלחה, תרבתנו ותרבתי משותף SATMVECs מחולים עם אי ספיקת לב, סוכרת ושילוב של פתולוגיות אלה. יתר על כן, טכניקות אלה יכולות להיות מיושמות גם על מיטות כלי דם אחרים, כולל שרירי השלד, ואנו כרגע אופטימיזציה מודל של שריר השלד MVEC-myocyte crosstalk.
ניתן לבודד hSATMVECs מרקמה אנושית שנלקחה בזמן החדרת CIED והם בעלי טוהר מספיק כדי לשמש באופן ניסיוני לחקר תפקוד לקוי של כלי דם ודיבור צולב בין תאי אנדותל לאדיפוציט אצל אנשים עם וללא מחלות לב מטבוליות.
SS קיבלה תמיכה לא כספית, דמי דוברים ואותות כבוד מאסטרהזניקה. RC קיבלה שכר דובר מחברת Janssen Oncology. OIB קיבלה דמי דובר מנוברטיס.
אנו אסירי תודה למחלקה לביו-דימות בפקולטה למדעי הביולוגיה (אוניברסיטת לידס, בריטניה) על השימוש במתקן ציטומטריית הזרימה, אשר נתמך על ידי מימון מענק המועצה למחקר ביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC BB/R000352/1). SS נתמך על ידי מלגת הכשרה למחקר קליני של קרן הלב הבריטית (FS/CRTF/20/24071). CL נתמכה על ידי מלגת דוקטורט של קרן הלב הבריטית (FS/19/59/34896). LDR נתמך על ידי פרס מלגת לורנס לסוכרת בבריטניה (16/0005382). RMC נתמך על ידי מלגת מחקר קליני בינוני של קרן הלב הבריטית (FS/12/80/29821). MTK הוא פרופסור קרן הלב הבריטית לחקר הלב וכלי הדם והסוכרת (CH/13/1/30086) ומחזיק במענק תוכנית קרן הלב הבריטית (RG/F/22/110076)
Name | Company | Catalog Number | Comments |
170L CO2 Incubator | GS Biotech | 170G-014 | |
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) | Invitrogen | N13195 | |
4% PARAFIX buffered histological fixative | VWR Chemicals | PRC/R/38/1 | |
Akt (tAkt) Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 9272 | |
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pk | Medisave | 393230 | |
Bovine Serum Albumin solution, 7.5% | Merck | A8412-100ML | |
CD144 (VE-Cadherin) Antibody, anti-human, PE, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-118-495 | |
CD31 Antibody, anti-human, PerCP-Vio 700, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-811 | |
CD31 MicroBead Kit, human, 1 kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
CD45 Antibody, anti-human, FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-769 | |
Cell Extraction Buffer | Invitrogen | FNN0011 | |
Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5805000060 | |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | Cell proliferation imaging kit |
Collagenase/Dispase, 500 mg | Roche/Merck | 11097113001 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Basement Membrane Matrix |
Corning 100 mm TC-treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3526 | |
Costar 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3516 | |
CytoFLEX S – 4 laser flow Cytometer | Beckman | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Merck | D8537-500ML | |
EASYstrainer Cell sieve for 50 mL tubes, 70 µm mesh, Blue, sterile, 50/pk | Greiner Bio-One | 542070 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | |
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes | Merck | EP0030120094 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Merck | E8008-100ML | |
Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polystyrene Permeable Support Companion Plate, with Lid, Sterile, 1/Pack, 50/Case | Appleton Woods | CF537 | |
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 0.4 µm Transparent PET Membrane, Sterile, 1/Pack, 48/Case | Appleton Woods | CF521 | |
Freezing Medium Cryo-SFM | PromoCell | C-29912 | |
Gelatin solution, 2% in water | Merck | G1393-100ML | |
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x), 100mL | Fisher Scientific | 11570486 | |
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12563029 | |
Hanks′ Balanced Salt solution | Merck | H6648-500ML | |
Human Subcutaneous Preadipocyte Cells | Lonza | PT-5020 | |
Incucyte ZOOM | Essen BioScience | Live-cell analysis system | |
Insulin solution human | Merck | I9278-5ML | |
LS Columns, 25/pk | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Tube Rotator |
MS Columns, 25/pk | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
NuPAGE 4–12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | PT-8002 | |
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 9570 | |
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 4060 | |
Pre-Separation Filters 30 µm, 50/pk | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution | Cell Signalling Technology | 4087 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Scalpel Disposable Sterile Style 10 | VWRI | 501 | |
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstetd | 62.554.502 | |
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print | Sarstedt | 62.547.254 | |
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print | Sarstetd | 62.547.254 | |
Total eNOS Mouse 1:1000 | BD Biosciences | 610297 | |
Triton X-100, BioUltra, for molecular biology | Merck | 93443-500ML | |
β-Actin (C4) Mouse 1:5000 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved