חקר שיחות צולבות של תאי אנדותל שומן/אדיפוציטים ברקמת שומן תת-עורית אנושית

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד, תרבית ופנוטיפ של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מרקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVECs). בנוסף, אנו מתארים מודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

Abstract

לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים (MVECs) יש תפקידים קריטיים רבים, כולל שליטה בטונוס כלי הדם, ויסות פקקת ואנגיוגנזה. הטרוגניות משמעותית בגנוטיפ ובפנוטיפ של תאי אנדותל (EC) תלויה במיטת כלי הדם שלהם ובמצב המחלה של המאכסן. היכולת לבודד MVEC ממיטות כלי דם ספציפיות לרקמות ומקבוצות חולים בודדות מציעה הזדמנות להשוות ישירות את תפקוד MVEC במצבי מחלה שונים. כאן, באמצעות רקמת שומן תת-עורית (SAT) שנלקחה בזמן החדרת התקנים אלקטרוניים מושתלי לב (CIED), אנו מתארים שיטה לבידוד של אוכלוסייה טהורה של רקמת שומן תת-עורית אנושית תפקודית MVEC (hSATMVEC) ומודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

hSATMVEC בודדו בעקבות עיכול אנזימטי של SAT על ידי דגירה עם חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים נגד CD31 ומעבר דרך עמודים מגנטיים. hSATMVEC גודלו ועברו על צלחות מצופות ג'לטין. ניסויים השתמשו בתאים במעברים 2-4. התאים שמרו על מאפיינים קלאסיים של מורפולוגיית EC לפחות עד מעבר 5. הערכה ציטומטרית של זרימה הראתה טוהר של 99.5% של hSATMVEC מבודד, המוגדר כ- CD31⁺/CD144⁺/CD45^-. hSATMVEC מבודד מקבוצת ביקורת היה זמן הכפלת אוכלוסייה של כ -57 שעות, והתפשטות פעילה אושרה באמצעות ערכת הדמיה של התפשטות תאים. תפקוד hSATMVEC מבודד הוערך באמצעות התגובה שלהם לגירוי אינסולין ופוטנציאל יצירת צינור אנגיוגני. לאחר מכן הקמנו מודל של תרבית משותפת של אדיפוציט תת-עורי hSATMVEC כדי לחקור דיבור צולב תאי והדגמנו השפעה במורד הזרם של hSATMVEC על תפקוד האדיפוציט.

ניתן לבודד hSATMVEC מ- SAT שנלקח בזמן החדרת CIED והם בעלי טוהר מספיק הן לפנוטיפ ניסיוני והן לחקר hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

Introduction

תאי אנדותל (ECs) הם תאי קשקש המרפדים את פני השטח הפנימיים של דופן כלי הדם כחד-שכבתיים. יש להם תפקידים חיוניים רבים, כולל שליטה על טונוס כלי הדם, ויסות פקקת, ויסות התגובה הדלקתית, ותרומה אנגיוגנזה¹. בהתחשב בחשיבותם של תאי אנדותל בפיזיולוגיה קרדיומטבולית, הם משמשים לעתים קרובות באופן ניסיוני כדי לקדם את ההבנה של פתופיזיולוגיה ולבחון טיפולים פרמקולוגיים חדשים למחלות לב מטבוליות.

עם זאת, קיימת הטרוגניות עצומה במורפולוגיה של תאי אנדותל, תפקוד, ביטוי גנים והרכב אנטיגן בהתאם למקור מיטת כלי הדם שלהם². בעוד שתאי אנדותל מעורקים גדולים מתאימים ביותר למחקרי טרשת עורקים, תאי אנדותל מכלי דם קטנים, המכונים תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים (MVECs), מתאימים יותר למחקרי אנגיוגנזה². הבנת הבסיס המולקולרי להטרוגניות האנדותל עשויה לספק תובנות חשובות לגבי טיפולים ספציפיים למיטת כלי דם. תפקוד האנדותל המיקרו-וסקולרי שונה באופן משמעותי גם במחלות רבות, כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם וזיהום מערכתי ^3,4. לכן, היכולת לבודד תאי אנדותל מקבוצות חולים מוגדרות מאפשרת השוואה ישירה של תפקוד תאי האנדותל שלהם והצלבה תאית⁵.

במאמר זה, אנו מתארים שיטה חדשנית לבידוד MVECs אנושיים מרקמת שומן תת-עורית (hSATMVEC) שנלקחה בזמן החדרת מכשיר אלקטרוני מושתל לב (CIED). hSATMVEC שבודדו בעקבות עיכול אנזימטי של רקמת שומן תת-עורית (SAT) גודלו ועברו על לוחות מצופים ג'לטין. לאחר מכן אנו מתארים מגוון של בדיקות פנוטיפ שיושמו בהצלחה על hSATMVECs על מנת לאמת את הפנוטיפ שלהם ולהדגים שימוש בבדיקות שגרתיות של תאי אנדותל. לבסוף, אנו מתארים יישום של hSATMVECs במודל ניסיוני של hSATMVECs-adipocyte cross-talk.

Protocol

דגימות הרקמה האנושית המשמשות בטכניקה המתוארת נלקחו מחולים שעברו החדרה של CIEDs על פי פרקטיקה קלינית שגרתית בבתי החולים לידס NHS Trust (לידס, בריטניה). פרוטוקול המחקר, יחד עם כל המסמכים האחרים, אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (11/YH/0291) לפני רישום המשתתפים. המחקר נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי.

1. אוכלוסיית החולים

1. השג רקמת שומן תת עורית טרייה (SAT) במהלך השתלת CIED מ- SAT מעל שריר החזה הראשי.
2. בודד דגימות SAT בתנאים סטריליים וטפל בדגימות הרקמות לאחר איסוף במכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים אספטיים מחמירים למניעת זיהום חיידקי.

2. בידוד תאי אנדותל ותרבית

הערה: סכימה לבידוד hSATMVEC מוצגת באיור 1.

1. לבידוד hSATMVEC, יש להשתמש במינימום של 250 מ"ג של רקמת שומן תת-עורית טרייה (SAT) המתקבלת במהלך השתלת CIED מ-SAT מעל שריר החזה הראשי (ראו איור 1).
   הערה: שימוש בכמויות גדולות יותר של SAT טרי מגדיל את התפוקה של hSATMVEC במהלך בידוד ויש לו את הסיכוי הגבוה ביותר לבידוד מוצלח ולתרבית hSATMVEC.
2. יש להכניס מיד את ה-SAT לתמיסת אחסון רקמות של מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) קרה כקרח בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לפני העברתו למעבדה.
   הערה: לקבלת הסיכוי הגבוה ביותר לבידוד מוצלח, יש לבצע בידוד hSATMVEC בהקדם האפשרי. עם זאת, ניתן לאחסן SAT עד 24 שעות על קרח לפני הבידוד במידת הצורך.
3. הכינו תמיסת עבודה של 1 מ"ג/מ"ל קולגןאז/דיספאס באופן הבא.
   1. ראשית, יש ליצור מחדש 500 מ"ג של אבקת קולגןאז/דיספאס ליופיליזציה ב-5 מ"ל מים סטריליים ליצירת תמיסת מלאי של קולגן/דיספאס בריכוז של 100 מ"ג/מ"ל.
   2. עבור כל בידוד hSATMVEC, יש לדלל 100 μL של תמיסת מלאי collagenase/dispase ב-10 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של הנקס′ קרה כדי לקבל תמיסת עבודה של 1 מ"ג/מ"ל.
4. בארון זרימה למינרית, השתמש בשני אזמלים כדי לטחון רקמות לתוך ~ 1 מ"מ³ חתיכות ב 500 μL של 1 מ"ג / מ"ל collagenase / dispase תמיסת על מכסה צלחת פטרי, triturate ולהעביר צינור צנטריפוגה נקי 50 מ"ל.
5. שטפו את מכסה צלחת הפטרי עם 4.5 מ"ל של תמיסת קולגןאז/דיספאס טרייה במינון 1 מ"ג/מ"ל והוסיפו לצינור הצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל. השאירו לעיכול למשך 30 דקות ב-37°C במסובב צינור ב-20 סל"ד. עצור את תהליך העיכול על ידי הוספת 10 מ"ל של MV מלא של מדיה גידול EC.
6. שלשו את התערובת המעוכלת והעבירו אותה דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר. יש לשטוף את המסננת ב-10 מ"ל של חיץ אלבומין מסרום בקר (PBS-BSA) בעל מאגר של 0.5% חוצץ פוספט-אלבומין בסרום בקר. צנטריפוגה את הדגימה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה עם עוד 5 מ"ל של 0.5% PBS-BSA.
7. לאחר מכן, הסר את התאים המתים באמצעות ערכה להסרת תאים מתים. כדי לעשות זאת, לדגור על גלולת התא ב 200 μL של חרוזים להסרת תאים מתים (מערבולת לפני השימוש) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
8. חבר עמוד LS עם מסנן 30 מיקרומטר למגנט המפריד ומקם צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מתחתיו. שטפו את העמוד המגנטי פעם אחת עם 1 מ"ל של חיץ מחייב להסרת תאים מתים לפני הוספת הדגימה/מתלה החרוזים ואפשרו לו לעבור באופן פסיבי תחת כוח הכבידה.
9. לאחר מכן, לשטוף את העמודה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מאגר מחייב ולאפשר לו לעבור באופן פסיבי דרך העמודה. חזור על שטיפה זו ארבע פעמים.
10. לאסוף את eluate כמו חלק תא חי, לסובב את התאים ב 300 x גרם ב RT במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף ולהשעות מחדש את הגלולה המתקבלת ב 400 μL של 0.5% PBS-BSA.
11. הוסף 20 μL של חרוזים מגנטיים מצופים אנטי CD31 לתאים מרחפים לדגור במשך 20 דקות ב 4 ° C . לאחר הדגירה, צנטריפוגו את הדגימה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהשליך את supernatant. להשהות מחדש את גלולת התא ב 500 μL של 0.5% PBS-BSA.
12. חבר עמוד MS עם מסנן 30 מיקרומטר למגנט המפריד ומקם צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מתחתיו. ראש העמודה עם 500 μL של 0.5% PBS-BSA. חזור על שלב זה פעמיים.
13. הוסיפו את תרחיף התא-מיקרו-חרוזים ואפשרו לו לעבור תחת כוח הכבידה. שטפו את העמוד עם 500 μL של 0.5% PBS-BSA שלוש פעמים. הזרימה בצינור הצנטריפוגה מתחת לעמוד מכילה ^{את שבר} CD31.
14. כדי לאסוף את שבר CD31⁺ (כלומר, החלק המכיל hSATMVECs), הסר את עמודת MS מהמגנט המפריד והנח אותה בצינור צנטריפוגה טרי של 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 0.5% PBS-BSA, ובפעולה חלקה אחת, החל את בוכנת העמודה כדי לשחרר את hSATMVECs שנלכדו.
15. צנטריפוגו את הדגימה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT ו להשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת התא ב- 1 מ"ל של מדיה מלאה לגידול EC MV וחלק את תמיסת התא של 1 מ"ל בין באר אחת או שתיים (תלוי בגודל הכדור) של צלחת 24 בארות מצופות ג'לטין 2% (מעבר 0).
    הערה: אל תדאג אם יש מעט תאים דבקים בימים הראשונים שלאחר הבידוד.
16. החליפו מדיה כל 3 ימים. תאי תרבית ב 37 ° C עם 5% CO₂. ברגע שהתאים המבודדים מגיעים ל~80% מפגש (2-4 שבועות), מעבירים אותם לבאר אחת של צלחת בת שש בארות (מעבר 1).
    הערה: מעברים מאוחרים יותר יכולים לצלחת מחדש תאים מבאר תורם אחת לבארות מקבל. ניסויים בוצעו בתאים של מעבר 2-4 דור לאחר שהתאים הוכיחו טוהר של >99% באמצעות ציטומטריית זרימה (ראה סעיף 3). התאים שמרו על מורפולוגיה אנדותל טיפוסית לפחות עד מעבר 5.

3. ציטומטריית זרימה

1. לפני ציטומטריית זרימה, בדוק חזותית hSATMVECs כדי לוודא שהם נראים חופפים ומייצגים מורפולוגית. בצע הערכה ציטומטרית של זרימה של hSATMVECs במעבר 2, באמצעות תאים מבאר אחת של צלחת 6 בארות.
2. שטפו תאים פעמיים עם PBS על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של PBS היטב ושאיפה בכל פעם. לאחר מכן, הוסף 300 μL / באר של טריפסין חם / EDTA פתרון (0.25%). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 2 דקות.
3. לאחר הניתוק, נטרל תמיסת טריפסין/EDTA עם 700 מיקרוליטר של MV שלם של מדיית גידול EC מלאה והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT. להשליך את supernatant מבלי להפריע את הכדור. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא במאגר MACS של 1 מ"ל ולחלק בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל המסומנים כבקרה לא מוכתמת ודגימה מוכתמת (500 מיקרוליטר לבאר).
5. הוסף 500 μL נוספים של מאגר MACS לכל צינור מיקרוצנטריפוגה, לפני צנטריפוגה שוב ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT.
6. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-100 מיקרוליטר של חיץ MACS לבקרה לא מוכתמת ובקוקטייל צביעה של 100 מיקרוליטר (טבלה משלימה 1) עבור הדגימה המוכתמת. לצבוע את התאים עם CD45-FITC (סמן pan-leucocyte), כמו גם CD144-PE ו CD31-PerCP (אשר מבוטא על ידי תאי אנדותל).
7. מערבלים בקצרה את התאים המרחפים במשך 5 שניות, ואז דוגרים ב 4 ° C במשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של חיץ MACS לכל צינור, צנטריפוגה שוב ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב RT, ולזרוק את supernatant.
8. לבסוף, להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 μL של מאגר MACS ולהעביר אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה טרי 1.5 מ"ל. הניחו את הצינור המסומן בקופסת קרח מכוסה מוכנה לניתוח.
   הערה: כל ניתוחי ציטומטריית הזרימה שנכללו בוצעו על מערכת ציטומטר זרימה 4-לייזר של Beckman Coulter Cytoflex (באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר בלבד).
9. הגדר את אורך גל הפליטה המרבי ואת המסנן עבור כל fluorochome כדלקמן: CD45-FITC - פליטה מקסימלית 520 ננומטר, מסנן 525/50; CD144-PE - פליטה מקסימלית 578 ננומטר, מסנן 585/40; CD31-PerCP - פליטה מקסימלית 675 ננומטר, מסנן 655-730.
10. כפי שמודגם באיור 2, רשום נתונים עבור 10,000 תאים לדגימה בשער סינגלט (P2). בדוק כי P1 מקיף צביר תאים גדול וכי רוב התאים האלה נופלים בשער סינגלט P2. ודא שלבקרה הלא מוכתמת יש מינימום תאי CD45-CD144⁺CD31⁺ כ% מהסינגלט.
11. רשום את אחוז סינגלי התאים CD45-CD144+CD31+ בדגימה המוכתמת.

4. זמן הכפלת תאי אנדותל והתפשטות תאים (איור 3)

1. במעברים 2 ו-3, ספרו את מספר ה-hSATMVECs הקיימים עבור כל דגימה באמצעות המוציטומטריה. רשום את התאריך והשעה של כל ספירת תאים.
2. חישוב מספר הכפלות האוכלוסייה בין נקודות אלה על פי המשוואה: זמן הכפלה = (משך x log(2))/(log (ריכוז סופי)-log(ריכוז התחלתי)).
   הערה: מחשבון מקוון זמין בכתובת https://doubling-time.com/compute.php.
3. הערך את התפשטות hSATMVECs באמצעות ערכת הדמיה מסחרית להפצת תאים. זרעו hSATMVECs בצפיפות של 20,000 תאים לבאר בצלחת של 24 בארות והשאירו אותם למשך הלילה במדיה מלאה של גידול EC MV כדי להתאושש.
4. למחרת, הוסף 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) לכל מדולל היטב במדיה מלאה EC גידול MV בריכוז סופי של 10 μM. לדגור ב 37 ° C (5% CO₂) במשך 2 שעות.
5. הסר את המדיה המכילה EdU ושטוף כל באר פעמיים עם PBS. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות ב- RT. שטוף היטב כל אחד פעמיים עם PBS והוסף 500 μL של 0.5% Triton X-100 במאגר מלח חוצץ טריס (TBS). השאירו לדגור ב-RT למשך 20 דקות.
   הערה: פעולה זו מחלחלת לקרום התא, ומאפשרת כניסה של אזיד עם תווית Alexa fluor 488 לתוך התא.
6. הכינו את קוקטייל אזיד עם תווית אלקסה 488 בהתאם להוראות היצרן, בהתאם למספר הבארות (ראו⁶). שטפו היטב פעמיים עם PBS לפני הוספת 100 μL של קוקטייל אזיד עם תווית 488 של Alexa fluor ודגרו במשך 30 דקות ב-RT מוגן מאור.
   הערה: קוקטייל אזיד עם תווית Alexa fluor 488 מגיב עם ה-EdU בתגובת קליק.
7. הסירו את קוקטייל האזיד עם תווית Alexa fluor 488 ושטפו פעמיים עם PBS. הוסף 500 μL של יודיד פרופידיום לכל באר ודגר במשך 20 דקות ב RT.
   הערה: שלב זה מכתים גרעינים (גם מתרבים וגם לא מתרבים) באדום.
   הסר יודיד פרופידיום, שטוף פעמיים עם PBS, ולהשאיר כל באר 500 μL של PBS להדמיה.
8. דמיינו כל באר ב-4 שדות רבי עוצמה בהגדלה של פי 10, עם עירור/פליטה של 495/519 ננומטר עבור אזיד של 488 ננומטר (ראו איור 3C).
   הערה: התמונות באיורים צולמו באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים בהגדלה של פי 10 עם זמן חשיפה של 800 אלפיות השנייה.
9. ספור את מספר התאים המתרבים (ירוק) ובטא כאחוז (%) מכלל התאים בכל שדה בעוצמה גבוהה (ממוצע של 4 אזורים לבאר).

5. היווצרות צינור תאי אנדותל

1. השאר מטריג'ל (מטריצת קרום מרתף; BMM) כדי להפשיר לילה על קרח. למחרת, עם הצלחת על קרח, להוסיף 160 μL של BMM לכל באר של צלחת 24 באר לפי הצורך. הטה את הצלחת כדי לקבל כיסוי מלא של כל באר עם BMM. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 לקיבוע בעת הכנת התאים.
2. זרע hSATMVECs ב 100,000 תאים (ב 1 מ"ל של מדיה) לכל באר. פיפטה בצד הבאר ודואגים פיפטה לאט כדי למנוע ניתוק מטריצה. לדגור את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 4 שעות.
   הערה: בשלב זה, הצלחת מוכנה לצילום. התוצאות והנתונים מתחת לדימות הפאזה במערכת ניתוח תאים חיים בהגדלה של פי 10 שימשו ב-5 אזורי בארות שונים (ראו איור 3D).
3. ספור את מספר הצינורות השלמים בכל שדה בהספק גבוה וחשב ערך ממוצע עבור כל דגימה.

6. גירוי אינסולין של hSATMVEC

1. תרבית hSATMVEC בצלחת 6 בארות ב 37 ° C עם 5% CO₂. לאחר המפגש, יש להסיר את מצע צמיחת תאי האנדותל המלא MV ולשטוף פעמיים עם PBS.
2. הוסף 500 μL של חומר רעב בסרום (מדיה גידול תאי אנדותל MV ללא תוספים) לכל באר ולהשאיר לדגור ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 4 שעות. במהלך תקופה זו, להכין 500 μL aliquots של ריכוז אינסולין עולה (0-150 μM) מוכן במדיה רעב בסרום.
3. לאחר הרעבת הסרום במשך 4 שעות, הסר מדיה מהבארות, הוסף 1 מ"ל של מדיה המכילה אינסולין (עם ריכוזים הולכים וגדלים) לכל באר, ודגר במשך 10 דקות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
4. יש לשטוף פעמיים עם PBS קר לפני הוספת 100 μL של חיץ ליזה חלבוני המכיל פרוטאז ומעכבי פוספטאז לתאי ליז עבור חלבון. כמת את החלבון באמצעות בדיקת BCA.
   הערה: בניסוי המתואר להלן, ליזטים של תאים הודגרו במשך 30 דקות באמבט קרח וצנטריפוגות במהירות של 20,000 x גרם במשך 15 דקות. לפני האלקטרופורזה, דגימות חלבון הורתחו כדי לנטרל את החלבונים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. החלבונים נפתרו על ג'ל ביס-טריס NuPAGE 4-12% והועברו לקרום ניטרוצלולוז. ניתוח האימונובלוט בוצע על פי פרוטוקולים סטנדרטיים תוך שימוש בנוגדנים רלוונטיים לפוספופרוטאין וסך נוגדני החלבון (בהתאם להוראות היצרן). נעשה שימוש בנוגדן משני מתאים מסוג Ig/HRP כדי לזהות את הנוגדן הראשוני (בהתאם להוראות היצרן). רמות החלבון כומתו באמצעות צפיפות, בהתבסס על עוצמת הפסים מכל דגימה. ß-actin שימש כבקרת טעינה במידת הצורך.

7. הקמת תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte (איור 4)

הערה: בתוצאות שלהלן, נעשה שימוש מסחרי בקדם-אדיפוציטים תת-עוריים לבנים אנושיים במעבר 2 מתורם קווקזי זכר יחיד בכל בדיקות האדיפוציטים. פרדיפוציטים הורחבו בתחילה מהבקבוקון שסופק על ידי הספק (מעבר 0) לשנים עשר קריובלים המכילים מדיית הקפאה cryo-SFM (מעבר 1).

1. כל צלחת תרבית משותפת בת 24 בארות דורשת קריוביאל אחד של קדם-אדיפוציטים (מעבר 1). הפשירו במהירות כל בקבוקון וצלחת לתוך בקבוק T75 המכיל 12-15 מ"ל של מדיה PGM-2 חמה (המכילה 10% FBS, 30 מיקרוגרם/מ"ל L-גלוטמין ו-15 ננוגרם/מ"ל GA-1000 SingleQuots). החליפו מדיה כל 3 ימים עד למפגש של 90%.
2. לאחר 90% confluent, לשטוף את preadipocytes תת עורית לבן אנושי עם PBS ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA (0.25%). להשאיר ב RT במשך 2 דקות ולאשר ניתוק עם מיקרוסקופ אור. הוסף 23 מ"ל של מדיה PGM-2 כדי לנטרל את טריפסין/EDTA וליצור תמיסה מרחפת של 24 מ"ל.
3. שים 1 מ"ל של תמיסת קדם-אדיפוציט לבנה תת-עורית אנושית תלויה בכל באר של צלחת נלווית של תרבית משותפת בת 24 בארות וגדל למפגש (בדרך כלל 2-3 ימים).
4. תוך כדי גדילה למפגש, להכין preadipocyte differentiation media (PDM). כדי להכין PDM, הכינו מלאי PDM כפול על ידי הוספת תערובת קניינית של אינסולין, דקסמתזון, אינדומתצין ואיזובוטיל-מתיל-קסנטין למדיית הבסיס של PGM. יש לדלל שני PDM ביחס של 1:1 עם PGM כדי ליצור PDM אחד.
5. לאחר המפגש, להבדיל את הקדם-אדיפוציטים הלבנים התת-עוריים האנושיים על ידי שינוי מדיה ל -1 מ"ל של מדיה PDM 1x לכל באר (יום 0). השאירו את הקדם-אדיפוציטים הלבנים התת-עוריים האנושיים לדגור ב-37°C 5% CO₂ למשך 10 ימים (ללא שינויי מדיה) כדי להבדיל באופן מלא. ניטור התמיינות באמצעות מיקרוסקופ פאזת אור (ראו איור 4B).
   הערה: לא ניתן להעביר אדיפוציטים מובחנים וניתן להשתמש בהם לבדיקות מהיום ה-10 עד היום ה-12. התמיינות אדיפוציט יכולה להימדד על ידי הגברת mRNA של לפטין, אדיפונקטין ו-PPAR-γ.
6. ביום 6 להתמיינות, זרע hSATMVECs בצפיפות של 5 x 10⁴ תאים לכל החדרה ב 500 μL שלם EC growth media MV על תוספות transwell (0.4 μM ממברנה). מניחים את החדרות הטרנסוול לבאר עם 500 μL של מדיית גידול EC מלאה MV () וגדלים למפגש ב 37 ° C ב 5% CO_2.
7. ביום ה-10, כאשר האדיפוציטים מתמיינים לחלוטין, הסירו מחצית ממדיית ה-PDM מכל באר והעבירו את תוספות הטרנסוול המכילות hSATMVEC במדיה שלהם (ECGM-MV) לכל באר (ראו איור 4A).
8. השאירו תאים בתרבית משותפת למשך 24 שעות לפני הסרת תוספות הטרנסוול ובצעו בדיקות המעריכות את תפקוד האדיפוציט.
   הערה: בנקודת זמן זו, אדיפוציטים יכולים גם להיות lysed עבור חלבון או בידוד RNA במידת הצורך.

8. אדיפוציט 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBD)-ספיגת גלוקוז

1. לאחר 24 שעות בתרבית משותפת, הסר תוספות תאים המכילות hSATMVEC. לאחר מכן, הוסף 2-NBD-גלוקוז למדיה בכל באר כדי להשיג ריכוז סופי של 20 μM. להגן מפני אור לדגור במשך 30 דקות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
2. שטפו את התאים פעמיים ב-PBS וקבעו את האדיפוציטים באמצעות 500 μL של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות ב-RT. שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS לפני שתעזבו ב-100 מיקרוליטר של PBS.
   הערה: בשלב זה, האדיפוציטים מוכנים לצילום. באיורים הכלולים, הדמיית פאזה ואור ירוק (עירור 440-480 ננומטר/פליטה 504-544 ננומטר) התקבלו במערכת ניתוח תאים חיים בהגדלה של פי 10 בארבעה שדות רבי עוצמה (ראו איור 4C).
3. כמת את רמת ספיגת הגלוקוז על ידי כימות האחוז הירוק של השטח הכולל באמצעות סף ב- ImageJ (או כל חבילת תוכנה דומה אחרת).

תוצאות

טוהר ופנוטיפ hSATMVEC
hSATMVEC מבודד ממטופלי ביקורת (כלומר, אנשים ללא היסטוריה של מחלות לב-מטבוליות) היו 99.5% CD31+CD144+CD45- על ציטומטריית זרימה (איור 2). ל-hSATMVEC מבודד הייתה מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת האופיינית ל-ECs (איור 3A). זמן הכפלת האוכלוסייה הממוצע של hSATMVECs היה 56.6 שעות ±-8.1 שעות (ממוצע ± SEM, n = 10) (איור 3B), ושכפול דנ"א פעיל ב-hSATMVECs אושר באמצעות ערכת הדמיה של התפשטות תאים (איור 3C).

hSATMVEC התנהג כמו MVECs מתפקדים ויצר צינורות במטריג'ל (איור 3D). הביטוי היחסי של חלבוני מפתח המעורבים במסלול איתות האינסולין Akt-eNOS מוצג באיור 3E. גם eNOs וגם Akt הדגימו עלייה בזרחון המושרה על ידי אינסולין, המיוצג כיחס בין חלבון זרחן/חלבון כולל מנורמל ל-ß-actin (איור 3E).

hSATMVEC-adipocyte תרבות משותפת
מודל להמחשה של תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte ניתן לראות באיור 4A. ככל שהקדם-אדיפוציטים הלבנים התת-עוריים האנושיים נעשים מובחנים יותר, ניתן להבחין בהתפתחות של ואקולים ליפידים (איור 4B), אשר ניתן לכמת באמצעות צביעת שמן אדום O (איור 4B).

ניגודיות פאזה להמחשה והדמיית פלואורסצנטיות (עירור 440-480 ננומטר/פליטה 504-544 ננומטר) של אדיפוציטים ממוינים לאחר 30 דקות דגירה עם גלוקוז 2-NBD של 20 מיקרומטר מוצגים באיור 4C. ניתן לכמת ספיגת גלוקוז על ידי מדידת שטח ירוק כאחוז משטח התא הכולל.

איור 1: סכמטי המדגים את הקציר והעיבוד של hSATMVECs לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תפוקה אופיינית של ניתוח ציטומטריית זרימה של hSATMVECs בתרבית. (A) תרשים פיזור של אזור פיזור צדדי (SSC-A) ואזור פיזור קדמי (FSC-A) המראה gating (תיבה אדומה) של hSATMVECs בתרבית סביב צפיפות אוכלוסיית תאים ספציפית. (B) תרשים פיזור של רוחב פיזור קדמי (FSC-Width) ו-FSC-A המציג gating (תיבה אדומה) של hSATMVECs בתרבית סביב צפיפות אוכלוסיית תאים ספציפית. (C) היסטוגרמה המראה פלואורסצנטיות של תאים מגודרים ל-CD45-FITC. (D) תרשים פיזור של עוצמת פלואורסצנטיות של CD144-PE (ציר x) ו- CD31-PerCP (ציר y). (E) היסטוגרמה המראה פלואורסצנטיות של תאים מגודרים ל-CD144-PE. (F) היסטוגרמה המראה פלואורסצנטיות של תאים מגודרים ל-CD31-PerCP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: פנוטיפ hSATMVEC. (A) תמונה במיקרוסקופ אור של hSATMVEC ליד מפגש המראה דמוי אבן מרוצפת. (B) זמן הכפלה hSATMVEC - מיקרוסקופ אור של HATEC בהפרש של 24 שעות מדגים את מידת התפשטות התאים. (C) התפשטות hSATMVEC. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של hSATMVEC עם יודיד פרופידיום ו-EdU/Alexa-fluor 488 מנבדקי ביקורת. (D) היווצרות צינור hSATMVEC מנבדקי ביקורת (תמונות שצולמו בהגדלה פי 4). (E) גירוי אינסולין של HATECs - מראה ביטוי יחסי של Akt זרחני (סרין 473) לסך הכל Akt (פאנל שמאלי) eNOS פוספורילציה (serine 1177) לסך eNOS (פאנל ימני) בריכוזי אינסולין הולכים וגדלים עם כתמים מערביים להמחשה מתחת מתוקננים ל-B-actin. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. גדלים לדוגמה נמצאים מתחת לכל חלונית. קיצורים: 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של רקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVEC), שגיאת תקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte. (A) תמונה סכמטית של תרבית משותפת hSATMVEC-adipocyte. (B) התמיינות של אדיפוציטים. הפאנל השמאלי מראה קדם-אדיפוציטים ביום 0 והפאנל הימני מראה אדיפוציטים מובחנים ביום 10 לאחר הוספת PDM. האיור התחתון מראה את כמות השומנים המאוחסנים באדיפוציטים ובפראדיפוציטים המוכתמים בשמן אדום O. (C) בדיקת ספיגת גלוקוז. הפאנל השמאלי מראה הדמיית פאזה של אדיפוציטים לאחר תרבית משותפת ודגירה, עם 20 מיקרומטר של גלוקוז 2-NBD למשך 30 דקות. הפאנל הימני מציג הדמיה ירוקה שממנה ניתן לכמת את ספיגת הגלוקוז (כאחוז ירוק מהשטח הכולל). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. קיצורים: יום 10 (D10), רקמת שומן תת-עורית אנושית תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים (hSATMVEC), מדיה להתמיינות קדם-אדיפוציט (PDM) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: קוקטייל צביעה לציטומטריית זרימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

מחקר זה מתאר טכניקה של בידוד hSATMVEC שנלקחה מ- SAT במהלך השתלה שגרתית של CIEDs. אנו מראים כי hSATMVEC מבודד יש טוהר גבוה, מבטא חלבונים transmembrane ספציפיים EC CD144 ו CD31, ולא מראה ביטוי משמעותי של לויקוציטים CD45. אנו ממשיכים להראות כי, באופן ניתן לשחזור ואמין, hSATMVEC מבודד מתרבים וניתן להשתמש בו באופן ניסיוני כדי לחקור את המנגנון התוך-תאי המעורב באיתות אינסולין ואנגיוגנזה. בנוסף ליכולת לתרבית אותם בבידוד, הם יכולים לשמש גם בתרבות משותפת כדי לחקור hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

תאי אנדותל המשמשים במחקר בסיסי ותרגומי מקורם בדרך כלל בכלי דם גדולים, כגון אבי העורקים ווריד הטבור האנושי, או microvasculature. לשני מקורות אלה יש מגבלות משלהם ^7,8; תאי אנדותל מכלי דם גדולים קשים לגישה (במקרה של רקמת אבי העורקים) או נגזרים מרקמת ילודים עם פיזיולוגיה וחשיפה סביבתית שונות⁹. שימוש בתאי אנדותל שבודדו מרקמה שנלקחה במהלך השתלת CIED מאפשר חקירה וניסוי של פיזיולוגיה תאית בקרב קבוצות חולים ספציפיות בעולם האמיתי. CIEDs מושתלים למגוון אינדיקציות, כולל בחולים עם bradyarrhythmias, אי ספיקת לב ומניעה ראשונית ושניונית של tachyarrhythmias החדר¹⁰. חולים אלה סובלים לעתים קרובות מתחלואה נלווית מרובה, כולל סוכרת, השמנת יתר ומחלת עורקים כליליים, המהווים מוקד עולמי עיקרי של מחקר לב וכלי דם 11,12,13. יתר על כן, בעוד שהנתונים להמחשה במאמר זה נוגעים לחולי ביקורת, יישמנו טכניקות אלה כדי לבודד ולחקור SATMVEC ממגוון חולים, כולל אלה עם אי ספיקת לב מתקדמת ו / או סוכרת מסוג 2.

לעתים לא רחוקות, אנו נתקלים בבעיות עם תפוקות hSATMVEC נמוכות בעקבות ניסיונות בידוד תאים. ניתן להפחית סיכון זה באופן משמעותי על ידי שימוש בנפח התחלתי גדול יותר של SAT כדי לבודד hSATMVEC. בנוסף, אנו נתקלים בכך בתדירות גבוהה יותר ב- SAT מאנשים עם מחלות לב מטבוליות, ובמיוחד סוכרת.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי hSATMVEC מבודד יכול לעבור רק מספר מוגבל של מעברים. מניסיוננו לאחר מעבר 5, ללא קשר לפנוטיפ של המטופל, התפשטות hSATMVEC מואטת באופן משמעותי. בנוסף, hSATMVEC מבודד באמצעות טכניקה זו אינם מתרבים היטב כאשר מאוכלסים בדלילות רבה מדי; לכן, אנו ממליצים לא לעבור hSATMVEC ביחס גדול מ 1:6. כאמור בעמוד 1. הצלחנו להפשיר ולהחיות מחדש hSATMVEC המאוחסן בחנקן נוזלי למשך עד 4 שנים, ומניסיוננו, הסיכוי להנפשה מחדש גדול יותר כאשר אנו משמרים בהקפאה במספר מעבר נמוך יותר (אנו בדרך כלל משמרים בהקפאה hSATMVEC במעבר 2).

רקמה שנלקחה בהחדרת CIED זמינה באופן חופשי וניתן לקצור אותה ללא כל נזק לחולה. לכן, מקור קל לגישה, יחסית לא פולשני של תאי אנדותל מקבוצות חולים אלה הוא בעל תועלת רבה בביצוע מחקר ממוקד. בעוד שהתמונות המייצגות במאמר זה נגזרות מחולי "ביקורת" (כלומר, חולים ללא אבחנה של אי ספיקת לב או סוכרת, אם כי עם אינדיקציה להשתלת CIED), בודדנו בהצלחה, תרבתנו ותרבתי משותף SATMVECs מחולים עם אי ספיקת לב, סוכרת ושילוב של פתולוגיות אלה. יתר על כן, טכניקות אלה יכולות להיות מיושמות גם על מיטות כלי דם אחרים, כולל שרירי השלד, ואנו כרגע אופטימיזציה מודל של שריר השלד MVEC-myocyte crosstalk.

ניתן לבודד hSATMVECs מרקמה אנושית שנלקחה בזמן החדרת CIED והם בעלי טוהר מספיק כדי לשמש באופן ניסיוני לחקר תפקוד לקוי של כלי דם ודיבור צולב בין תאי אנדותל לאדיפוציט אצל אנשים עם וללא מחלות לב מטבוליות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
170L CO2 Incubator	GS Biotech	170G-014
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose)	Invitrogen	N13195
4% PARAFIX buffered histological fixative	VWR Chemicals	PRC/R/38/1
Akt (tAkt) Rabbit  1:1000	Cell Signalling Technology	9272
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pk	Medisave	393230
Bovine Serum Albumin solution, 7.5%	Merck	A8412-100ML
CD144 (VE-Cadherin) Antibody, anti-human, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-118-495
CD31 Antibody, anti-human, PerCP-Vio 700, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-811
CD31 MicroBead Kit, human, 1 kit	Miltenyi Biotec	130-091-935
CD45 Antibody, anti-human, FITC, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-769
Cell Extraction Buffer	Invitrogen	FNN0011
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000060
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye	Invitrogen	C10337	Cell proliferation imaging kit
Collagenase/Dispase, 500 mg	Roche/Merck	11097113001
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Basement Membrane Matrix
Corning 100 mm TC-treated Culture Dish	Corning	430167
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3526
Costar 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3516
CytoFLEX S – 4 laser flow Cytometer	Beckman
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline	Merck	D8537-500ML
EASYstrainer Cell sieve for 50 mL tubes, 70 µm mesh, Blue, sterile, 50/pk	Greiner Bio-One	542070
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes	Merck	EP0030120094
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	Merck	E8008-100ML
Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polystyrene Permeable Support Companion Plate, with Lid, Sterile, 1/Pack, 50/Case	Appleton Woods	CF537
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 0.4 µm Transparent PET Membrane, Sterile, 1/Pack, 48/Case	Appleton Woods	CF521
Freezing Medium Cryo-SFM	PromoCell	C-29912
Gelatin solution, 2% in water	Merck	G1393-100ML
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x), 100mL	Fisher Scientific	11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Fisher Scientific	12563029
Hanks′ Balanced Salt solution	Merck	H6648-500ML
Human Subcutaneous Preadipocyte Cells	Lonza	PT-5020
Incucyte ZOOM	Essen BioScience		Live-cell analysis system
Insulin solution human	Merck	I9278-5ML
LS Columns, 25/pk	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi Biotec	130-100-008
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Tube Rotator
MS Columns, 25/pk	Miltenyi Biotec	130-042-201
NuPAGE 4–12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	PT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000	Cell Signalling Technology	9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  1:1000	Cell Signalling Technology	4060
Pre-Separation Filters 30 µm, 50/pk	Miltenyi Biotec	130-041-407
Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution	Cell Signalling Technology	4087
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Scalpel Disposable Sterile Style 10	VWRI	501
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstetd	62.554.502
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print	Sarstedt	62.547.254
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print	Sarstetd	62.547.254
Total eNOS Mouse 1:1000	BD Biosciences	610297
Triton X-100, BioUltra, for molecular biology	Merck	93443-500ML
β-Actin (C4) Mouse 1:5000	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778