İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Özet

Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.

Özet

Mikrovasküler endotel hücreleri (MVEC'ler), vasküler tonusun kontrolü, trombozun düzenlenmesi ve anjiyogenez dahil olmak üzere birçok kritik role sahiptir. Endotel hücre (EC) genotipi ve fenotipindeki önemli heterojenlik, vasküler yataklarına ve konak hastalık durumuna bağlıdır. MVEC'leri dokuya özgü vasküler yataklardan ve bireysel hasta gruplarından izole etme yeteneği, farklı hastalık durumlarında MVEC fonksiyonunu doğrudan karşılaştırma fırsatı sunar. Burada, kardiyak implante edilebilir elektronik cihazların (CIED) yerleştirilmesi sırasında alınan deri altı yağ dokusu (SAT) kullanılarak, fonksiyonel insan deri altı yağ dokusu MVEC'nin (hSATMVEC) saf bir popülasyonunun izolasyonu için bir yöntem ve deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modeli açıklanmaktadır.

hSATMVEC, SAT'ın anti-CD31 antikor kaplı manyetik boncuklarla inkübe edilerek enzimatik sindirilmesini ve manyetik kolonlardan geçirilmesini takiben izole edildi. hSATMVEC, jelatin kaplı plakalar üzerinde büyütüldü ve geçirildi. Deneylerde 2-4 pasajlarında hücreler kullanıldı. Hücreler, en az 5. pasaja kadar EC morfolojisinin klasik özelliklerini korudular. Flow sitometrik değerlendirmede CD31⁺/CD144⁺/CD45^- olarak tanımlanan izole hSATMVEC'in saflığı %99.5 olarak görüldü. Kontrollerden izole edilen hSATMVEC, yaklaşık 57 saatlik bir popülasyon ikiye katlama süresine sahipti ve aktif proliferasyon, bir hücre proliferasyonu görüntüleme kiti kullanılarak doğrulandı. İzole hSATMVEC fonksiyonu, insülin stimülasyonuna yanıtları ve anjiyojenik tüp oluşturma potansiyeli kullanılarak değerlendirildi. Daha sonra hücresel çapraz konuşmayı incelemek için bir hSATMVEC-deri altı adiposit ko-kültür modeli kurduk ve hSATMVEC'in adiposit fonksiyonu üzerinde aşağı yönlü bir etkisi olduğunu gösterdik.

hSATMVEC, CIED yerleştirme sırasında alınan SAT'den izole edilebilir ve hem deneysel olarak fenotip hem de hSATMVEC-adiposit çapraz konuşmasını incelemek için yeterli saflıktadır.

Giriş

Endotel hücreleri (EC'ler), kan damarı duvarının iç yüzeyini tek tabaka halinde kaplayan skuamöz hücrelerdir. Vasküler tonusun kontrolü, trombozun düzenlenmesi, inflamatuar yanıtın modüle edilmesi ve anjiyogeneze katkıda bulunulması gibi birçok önemli rolleri vardır¹. Endotel hücrelerinin kardiyometabolik fizyolojideki önemi göz önüne alındığında, patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasında ve kardiyometabolik hastalıklar için yeni farmakolojik tedavilerin incelenmesinde sıklıkla deneysel olarak kullanılmaktadırlar.

Bununla birlikte, vasküler yataklarının^kökenine bağlı olarak endotel hücre morfolojisi, işlevi, gen ekspresyonu ve antijen bileşiminde muazzam bir heterojenlik vardır 2. Büyük arterlerden alınan endotel hücreleri ateroskleroz çalışmaları için en uygun iken, mikrovasküler endotel hücreleri (MVEC'ler) olarak bilinen küçük damarlardan alınan endotel hücreleri anjiyogenez çalışmaları için daha uygundur². Endotelyal heterojenitenin moleküler temelini anlamak, vasküler yatağa özgü tedaviler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Mikrovasküler endotel fonksiyonu ayrıca diyabet, kardiyovasküler hastalık ve sistemik enfeksiyon dahil olmak üzere çok sayıda hastalıkta önemli ölçüde farklılık gösterir ^3,4. Bu nedenle, endotel hücrelerini tanımlanmış hasta gruplarından izole etme yeteneği, endotel hücre fonksiyonlarının ve hücresel çapraz konuşmanın doğrudan karşılaştırılmasına izin verir⁵.

Bu yazıda, kardiyak implante edilebilir elektronik cihaz (CIED) yerleştirilmesi sırasında alınan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC) insan MVEC'lerini izole etmek için yeni bir yöntem tanımlanmıştır. Deri altı yağ dokusunun (SAT) enzimatik sindirimini takiben izole edilen hSATMVEC, büyütüldü ve jelatin kaplı plakalar üzerinde geçirildi. Daha sonra, fenotiplerini doğrulamak ve rutin endotel hücre testlerinde kullanımlarını göstermek için hSATMVEC'lere başarıyla uygulanan bir dizi fenotipleme testini açıklıyoruz. Son olarak, deneysel bir hSATMVEC'ler-adiposit çapraz konuşma modelinde hSATMVEC'lerin bir uygulamasını açıklıyoruz.

Protokol

Tarif edilen teknikte kullanılan insan dokusu örnekleri, Leeds Eğitim Hastaneleri NHS Trust'ta (Leeds, Birleşik Krallık) rutin klinik uygulamaya göre CIED'lerin kılavuzda belirtilen yerleştirilmesi uygulanan hastalardan alınmıştır. Çalışma protokolü, diğer tüm belgelerle birlikte, katılımcı kaydından önce yerel etik kurul (11/YH/0291) tarafından onaylanmıştır. Çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür.

1. Hasta popülasyonu

1. Pektoralis majör kasının üzerindeki SAT'tan CIED implantasyonu sırasında taze deri altı yağ dokusu (SAT) elde edin.
2. SAT numunelerini steril koşullar altında izole edin ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için katı aseptik koşullar altında laminer akış başlığında toplandıktan sonra doku numunelerini işleyin.

2. Endotel hücre izolasyonu ve kültürü

NOT: hSATMVEC izolasyonu için bir şema Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. hSATMVEC izolasyonu için, pektoralis majör kasının üzerindeki SAT'den CIED implantasyonu sırasında elde edilen en az 250 mg taze deri altı yağ dokusu (SAT) kullanın (bkz. Şekil 1).
   NOT: Daha büyük miktarlarda taze SAT kullanmak, izolasyon sırasında hSATMVEC verimini artırır ve başarılı izolasyon ve hSATMVEC kültürü için en yüksek şansa sahiptir.
2. SAT'ı laboratuvara aktarmadan önce hemen 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde buz gibi soğuk manyetik ile aktive edilen hücre ayırma (MACS) doku saklama solüsyonuna yerleştirin.
   NOT: Başarılı izolasyon şansının en yüksek olması için hSATMVEC izolasyonu mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Bununla birlikte, SAT, gerekirse izolasyondan önce buz üzerinde 24 saate kadar saklanabilir.
3. Aşağıdaki gibi 1 mg / mL kollajenaz / dispas çalışma solüsyonu hazırlayın.
   1. İlk olarak, 100 mg / mL konsantrasyonda bir kollajenaz / dispas stok çözeltisi oluşturmak için 5 mL steril su içinde 500 mg kollajenaz / dispas liyofilize tozu yeniden sulandırın.
   2. Her hSATMVEC izolasyonu için, 1 mg / mL'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için 10 μL kollajenaz / dispas stok çözeltisini 10 mL soğuk Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi içinde seyreltin.
4. Laminer akış kabininde, dokuları bir Petri kabının kapağında 500 μL 1 mg / mL kollajenaz / dispas çözeltisi içinde ~ 1 mm³ parçaya doğramak için iki neşter kullanın, tritüre edin ve temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
5. Petri kabı kapağını 4.5 mL taze 1 mg / mL kollajenaz / dispas çözeltisi ile yıkayın ve 50 mL santrifüj tüpüne ekleyin. 20 rpm'de bir tüp döndürücüde 37 °C'de 30 dakika sindirilmeye bırakın. 10 mL tam EC büyüme ortamı MV ekleyerek sindirim sürecini durdurun.
6. Sindirilmiş karışımı ezin ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Elek 10 mL% 0.5 fosfat tamponlu salin - sığır serum albümini (PBS-BSA) tamponu ile durulayın. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı başka bir 5 mL %0,5 PBS-BSA ile tekrarlayın.
7. Ardından, bir ölü hücre temizleme kiti kullanarak ölü hücreleri çıkarın. Bunu yapmak için, hücre peletini 200 μL ölü hücre çıkarma boncuklarında (kullanımdan önce girdap) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin.
8. Ayırıcı mıknatısa 30 μm filtreli bir LS sütunu takın ve altına 15 mL'lik bir santrifüj tüpü yerleştirin. Numune/boncuk süspansiyonunu eklemeden önce manyetik sütunu 1 mL ölü hücre giderme bağlayıcı tamponu ile bir kez yıkayın ve yerçekimi altında pasif olarak geçmesine izin verin.
9. Daha sonra, 0,5 mL bağlayıcı tampon ekleyerek sütunu yıkayın ve sütundan pasif olarak geçmesine izin verin. Bu yıkamayı dört kez tekrarlayın.
10. Elüatı canlı hücre fraksiyonu olarak toplayın, hücreleri RT'de 300 x g'da 10 dakika döndürün ve ardından elde edilen peleti 400 μL% 0.5 PBS-BSA'da yıkayın ve yeniden süspanse edin.
11. Süspanse edilmiş hücrelere 20 μL anti-CD31 kaplı manyetik boncuk ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sonrası, numuneyi RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 500 μL% 0.5 PBS-BSA'da yeniden süspanse edin.
12. Ayırıcı mıknatısa 30 μm filtreli bir MS sütunu takın ve altına 15 mL'lik bir santrifüj tüpü yerleştirin. Sütunu 500 μL %0,5 PBS-BSA ile astarlayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
13. Hücre mikroboncuk süspansiyonunu ekleyin ve yerçekimi altında geçmesine izin verin. Kolonu 500 μL %0,5 PBS-BSA ile üç kez yıkayın. Kolonun altındaki santrifüj tüpündeki akış, CD31^- fraksiyonunu içerir.
14. CD31⁺ fraksiyonunu (yani hSATMVEC'leri içeren fraksiyonu) toplamak için, MS kolonunu ayırıcı mıknatıstan çıkarın ve 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirin. 1 mL %0,5 PBS-BSA ekleyin ve tek bir yumuşak hareketle, yakalanan hSATMVEC'leri serbest bırakmak için sütun pistonunu uygulayın.
15. Numuneyi RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 1 mL tam EC büyüme ortamı MV içinde yeniden süspanse edin ve 1 mL hücre solüsyonunu% 2 jelatin kaplı 24 oyuklu bir plakanın (Pasaj 0) bir veya iki oyuğuna (pelet boyutuna bağlı olarak) bölün.
    NOT: İzolasyondan sonraki ilk birkaç gün içinde az sayıda yapışık hücre varsa endişelenmeyin.
16. Medyayı her 3 günde bir değiştirin. 37 ° C'de% 5 CO₂ ile kültür hücreleri. İzole edilmiş hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştığında (2-4 hafta), bunları altı oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna geçirin (geçiş 1).
    NOT: Sonraki pasajlar, hücreleri bir birleşik donör kuyusundan alıcı kuyucuklarına yeniden plakalayabilir. Deneyler, hücreler akış sitometrisi kullanılarak %>99 saflık gösterdikten sonra 2-4 nesil geçiş hücrelerinde gerçekleştirilmiştir (bkz. bölüm 3). Hücreler, en az 5. pasaja kadar tipik endotel morfolojisini korudu.

3. Akış sitometrisi

1. Akış sitometrisinden önce, birleşik ve morfolojik olarak temsili göründüklerinden emin olmak için hSATMVEC'leri görsel olarak kontrol edin. 6 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğundan alınan hücreleri kullanarak, 2. pasajda hSATMVEC'lerin akış sitometrik değerlendirmesini gerçekleştirin.
2. 500 μL PBS kuyusu ekleyerek ve her seferinde aspire ederek hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra 300 μL / kuyu ılık tripsin / EDTA (% 0.25) çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 2 dakika inkübe edin.
3. Ayrıldıktan sonra, tripsin / EDTA çözeltisini 700 μL tam EC büyüme ortamı MV ile nötralize edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
4. Hücre süspansiyonunu RT'de 8 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın. Daha sonra, hücre peletini 1 mL MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve lekesiz kontrol ve lekeli numune (kuyu başına 500 μL) etiketli iki 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü arasında bölün.
5. RT'de 8 dakika boyunca 400 x g'da tekrar santrifüjlemeden önce her bir mikrosantrifüj tüpüne ek 500 μL MACS tamponu ekleyin.
6. Süpernatanı atın ve hücre peletini lekesiz kontrol için 100 μL MACS tamponunda ve lekeli numune için 100 μL boyama kokteylinde (Ek Tablo 1) yeniden süspanse edin. Hücreleri CD45-FITC (pan-lökosit belirteci) ve ayrıca CD144-PE ve CD31-PerCP (endotel hücreleri tarafından eksprese edilir) ile boyayın.
7. Askıda kalan hücreleri 5 saniye kısaca vorteksleyin, ardından 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, her tüpe 1 mL MACS tamponu ekleyin, RT'de 8 dakika boyunca 400 x g'da tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
8. Son olarak, hücre peletini 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve 1.5 mL'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Etiketli tüpü analiz için hazır kapalı bir buz kutusuna yerleştirin.
   NOT: Dahil edilen tüm akış sitometrisi analizleri, bir Beckman Coulter Cytoflex 4 lazerli akış sitometresi sisteminde (yalnızca 488 nm uyarma lazeri kullanılarak) gerçekleştirildi.
9. Her bir florofor için maksimum emisyon dalga boyunu ve filtreyi aşağıdaki gibi ayarlayın: CD45-FITC - emisyon maksimum 520 nm, filtre 525/50; CD144-PE - emisyon maksimum 578 nm, filtre 585/40; CD31-PerCP - emisyon maksimum 675 nm, filtre 655-730.
10. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tek bir kapıda (P2) örnek başına 10.000 hücre için veri kaydedin. P1'in büyük bir hücre kümesini çevrelediğini ve bu hücrelerin çoğunun P2 singlet kapısına düştüğünü kontrol edin. Boyanmamış kontrolün, singletlerin yüzdesi olarak minimum CD45-CD144 ⁺ CD31 ⁺ hücrelerine sahip olduğundan emin olun.
11. Lekeli numunedeki CD45-CD144 + CD31 + hücre tekillerinin yüzdesini kaydedin.

4. Endotel hücre ikiye katlanma süresi ve hücre proliferasyonu (Şekil 3)

1. 2. ve 3. pasajlarda, hemositometri kullanarak her numune için uygun hSATMVEC'lerin sayısını sayın. Her hücre sayımının tarihini ve saatini kaydedin.
2. Bu noktalar arasındaki popülasyon ikiye katlanma sayısını denkleme göre hesaplayın: ikiye katlama süresi = (süre x log(2))/(log (son konsantrasyon)-log(başlangıç konsantrasyonu)).
   NOT: https://doubling-time.com/compute.php'da çevrimiçi bir hesap makinesi mevcuttur.
3. Ticari olarak temin edilebilen bir hücre proliferasyonu görüntüleme kiti kullanarak hSATMVEC'lerin proliferasyonunu değerlendirin. hSATMVEC'leri 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 20.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın ve iyileşmeleri için gece boyunca tam EC büyüme ortamı MV'sinde bırakın.
4. Ertesi gün, 10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda tam EC büyüme ortamı MV içinde seyreltilmiş her bir kuyucuğa 5-Etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ekleyin. 37 ° C'de (% 5 CO₂) 2 saat inkübe edin.
5. EdU içeren ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri RT'de 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Her kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın ve tris tamponlu salin (TBS) tamponuna 500 μL% 0.5 Triton X-100 ekleyin. RT'de 20 dakika inkübe etmeye bırakın.
   NOT: Bu, hücre zarına nüfuz ederek Alexa fluor 488 etiketli azidin hücreye girmesine izin verir.
6. Alexa fluor 488 etiketli azid kokteylini, kuyu sayısına bağlı olarak üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz.⁶). 100 μL Alexa fluor 488 etiketli azid kokteyli eklemeden önce her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın ve RT'de ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin.
   NOT: Alexa fluor 488 etiketli azid kokteyli, bir tıklama reaksiyonunda EdU ile reaksiyona girer.
7. Alexa fluor 488 etiketli azid kokteylini çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Kuyucuk başına 500 μL propidyum iyodür ekleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu adım, çekirdekleri (hem çoğalan hem de çoğalmayan) kırmızıya boyar.
   Probidyum iyodürü çıkarın, PBS ile iki kez yıkayın ve görüntüleme için her kuyucuğu 500 μL PBS'de bırakın.
8. 488 nm azid için 495/519 nm uyarma/emisyon ile 10x büyütmede 4 yüksek güçlü alanda her bir kuyucuğu görüntüleyin (bkz. Şekil 3C).
   NOT: Şekillerdeki görüntüler, 800 ms pozlama süresi ile 10x büyütmede canlı hücre analiz sistemi kullanılarak çekilmiştir.
9. Çoğalan hücrelerin sayısını (yeşil) sayın ve her yüksek güçlü alandaki toplam hücrelerin yüzdesi (%) olarak ifade edin (kuyu başına ortalama 4 bölge).

5. Endotel hücre tüpü oluşumu

1. Matrigel'i bırakın (bazal membran matrisi; BMM) gece boyunca buz üzerinde buzunu çözmek için. Ertesi gün, plaka buz üzerindeyken, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna gerektiği gibi 160 μL BMM ekleyin. BMM ile her kuyuyu tam olarak kaplamak için plakayı eğin. Hücreleri hazırlarken ayarlamak için% 5 CO₂ ile plakayı 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
2. Tohum hSATMVEC'leri kuyu başına 100.000 hücrede (1 mL ortamda). Kuyunun yan tarafına pipetleyin ve matrisin ayrılmasını önlemek için yavaşça pipetlemeye dikkat edin. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 4 saat inkübe edin.
   NOT: Bu noktada, plaka görüntülenmeye hazırdır. Canlı hücre analiz sisteminde 10x büyütmede faz görüntülemenin altındaki sonuçlar ve şekiller 5 farklı kuyu alanında kullanılmıştır (bkz. Şekil 3D).
3. Her bir yüksek güç alanındaki tüm tüplerin sayısını sayın ve her numune için ortalama bir değer hesaplayın.

6. hSATMVEC'in insülin stimülasyonu

1. % 5 CO₂ ile 37 ° C'de 6 oyuklu bir plakada hSATMVEC kültürü. Bir kez birleştikten sonra, tam endotel hücre büyüme ortamı MV'yi çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın.
2. Her oyuğa 500 μL serum açlık ortamı (takviyesiz endotel hücre büyüme ortamı MV) ekleyin ve 4 saat boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe etmeye bırakın. Bu süre zarfında, serum açlık ortamında hazırlanan 500 μL'lik artan insülin konsantrasyonları (0-150 μM) hazırlayın.
3. 4 saat boyunca serum aç bırakıldıktan sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın, her oyuğa 1 mL insülin içeren ortam (artan konsantrasyonlarda) ekleyin ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
4. Protein için liz hücrelerine proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 100 μL protein lizis tamponu eklemeden önce soğuk PBS ile iki kez yıkayın. BCA tahlili kullanarak proteini ölçün.
   NOT: Aşağıda açıklanan deneyde, hücre lizatları bir buz banyosunda 30 dakika inkübe edildi ve 15 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjlendi. Elektroforezden önce, protein numuneleri, proteinleri 95 ° C'de 5 dakika boyunca denatüre etmek için kaynatıldı. Proteinler bir NuPAGE %4-12 Bis-Tris Jel üzerinde çözüldü ve bir nitroselüloz membrana aktarıldı. İmmünoblot analizi, ilgili fosfoprotein antikorları ve toplam protein antikorları (üreticinin talimatlarına göre) kullanılarak standart protokollere göre gerçekleştirildi. Primer antikoru tespit etmek için uygun bir Ig/HRP sekonder antikoru kullanıldı (üreticinin talimatlarına göre). Protein seviyeleri, her bir numuneden alınan bantların yoğunluğuna dayalı olarak dansitometri kullanılarak ölçüldü. Uygun olduğunda yükleme kontrolü olarak ß-aktin kullanıldı.

7. hSATMVEC-adiposit ko-kültür kurulumu (Şekil 4)

NOT: Aşağıdaki sonuçlarda, tüm adiposit testlerinde tek bir erkek Kafkas donöründen alınan 2. pasajda ticari olarak temin edilebilen insan beyaz deri altı preadipositleri kullanılmıştır. Preadipositler başlangıçta satıcı tarafından sağlanan flakondan (pasaj 0) kriyo-SFM dondurma ortamı içeren on iki kriyoviyal (pasaj 1) genişletildi.

1. Her 24 oyuklu ko-kültür plakası, bir kriyoviyal preadiposit gerektirir (pasaj 1). Her bir şişeyi ve plakayı 12-15 mL ılık PGM-2 ortamı (% 10 FBS, 30 μg / mL L-glutamin ve 15 ng / mL GA-1000 SingleQuots içeren) içeren bir T75 şişesine hızla çözün. %90 birleşene kadar medyayı her 3 günde bir değiştirin.
2. % 90 birleştiğinde, insan beyaz deri altı preadipositlerini PBS ile yıkayın ve ardından 1 mL tripsin / EDTA çözeltisi (% 0.25) ekleyin. RT'de 2 dakika bekletin ve ışık mikroskobu ile ayrılmayı onaylayın. Tripsin / EDTA'yı nötralize etmek için 23 mL PGM-2 ortamı ekleyin ve 24 mL preadiposit süspanse edilmiş bir çözelti yapın.
3. 24 oyuklu bir ko-kültür eşlik eden plakanın her bir oyuğuna 1 mL askıda insan deri altı beyaz preadiposit çözeltisi koyun ve birleşene kadar büyütün (genellikle 2-3 gün).
4. Birleşim noktasına kadar büyürken, preadiposit farklılaşma ortamı (PDM) hazırlayın. PDM'yi hazırlamak için, PGM baz ortamına tescilli bir insülin, deksametazon, indometazin ve izobütil-metilksantin karışımı ekleyerek 2x PDM stoğu yapın. 1x PDM yapmak için 2x PDM'yi PGM ile 1:1 oranında seyreltin.
5. Bir kez birleştikten sonra, ortamı her bir oyuğa 1 mL 1x PDM ortamına değiştirerek insan deri altı beyaz preadipositlerini ayırt edin (Gün 0). İnsan deri altı beyaz preadipositlerini tamamen farklılaşması için 37 ° C% 5 CO_2'de 10 gün boyunca (ortam değişiklikleri olmadan) inkübe etmeye bırakın. Işık fazı mikroskobu kullanarak farklılaşmayı izleyin (bkz. Şekil 4B).
   NOT: Farklılaşmış adipositler pasajlanamaz ve 10. günden 12. güne kadar testler için kullanılabilir. Adiposit farklılaşması, leptin, adiponektin ve PPAR-γ'nin mRNA amplifikasyonu ile ölçülebilir.
6. Farklılaşmanın 6. gününde, transwell ekler (0.4 μM membran) üzerinde 500 μL'lik tam EC büyüme ortamı MV'sinde insert başına 5 x 10⁴ hücre yoğunluğunda tohum hSATMVEC'ler. Transwell eklerini 500 μL tam EC büyüme ortamı MV () içeren bir kuyuya yerleştirin ve 37 °C'de %5 CO 2 ile birleşene kadar büyütün_.
7. 10. günde, adipositler tamamen farklılaştığında, her bir oyuktan PDM ortamının yarısını çıkarın ve kendi ortamlarında (ECGM-MV) birleşik hSATMVEC içeren transwell eklerini her bir oyuğa aktarın (bkz. Şekil 4A).
8. Transwell eklerini çıkarmadan önce hücreleri 24 saat ko-kültürde bırakın ve adiposit fonksiyonunu değerlendiren testler yapın.
   NOT: Bu zaman noktasında, adipositler gerekirse protein veya RNA izolasyonu için de parçalanabilir.

8. Adiposit 2- (N- (7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il) Amino) -2-Deoksiglukoz (2-NBD) -glikoz alımı

1. Ko-kültürde 24 saat sonra, hSATMVEC içeren hücre eklerini çıkarın. Daha sonra, 20 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her bir oyuktaki ortama 2-NBD-glikoz ekleyin. Işıktan koruyun ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
2. Hücreleri PBS'de iki kez yıkayın ve RT'de 15 dakika boyunca 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak adipositleri sabitleyin. 100 μL PBS'de bırakmadan önce hücreleri PBS'de üç kez yıkayın.
   NOT: Bu noktada, adipositler görüntülenmeye hazırdır. Dahil edilen şekillerde, faz görüntüleme ve yeşil ışık (uyarma 440-480 nm / emisyon 504-544 nm), dört yüksek güçlü alanda 10x büyütmede canlı hücre analiz sisteminde elde edilmiştir (bkz. Şekil 4C).
3. ImageJ'de (veya başka bir benzer yazılım paketinde) eşikleme kullanarak toplam alanın yeşil yüzdesini ölçerek glikoz alım seviyesini ölçün.

Tartışmalar

Bu çalışma, CIED'lerin rutin implantasyonu sırasında SAT'den alınan hSATMVEC'i izole etme tekniğini açıklamaktadır. İzole edilen hSATMVEC'in yüksek saflığa sahip olduğunu, EC'ye özgü transmembran proteinleri CD144 ve CD31'i eksprese ettiğini ve lökosit CD45'in önemli bir ekspresyonunu göstermediğini gösterdik. Tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde, izole edilmiş hSATMVEC proliferasyonunu ve insülin sinyalizasyonu ve anjiyogenezde yer alan hücre içi mekanizmayı incelemek için deneysel olarak kullanılabileceğini göstermeye devam ediyoruz. Onları ayrı ayrı kültürleyebilmenin yanı sıra, hSATMVEC-adiposit çapraz konuşmasını incelemek için ortak kültürde de kullanılabilirler.

Temel ve translasyonel araştırmalarda kullanılan endotel hücreleri genellikle aort ve insan göbek damarı veya mikrovaskülatür gibi büyük damarlardan elde edilir. Bu kaynakların her ikisinin de kendi sınırlamaları vardır ^7,8; Büyük damarlardan gelen endotel hücrelerine erişmek zordur (aort dokusu durumunda) veya potansiyel olarak farklı fizyoloji ve çevresel maruziyete sahip yenidoğan dokusundan türetilir⁹. CIED implantasyonu sırasında alınan dokudan izole edilen endotel hücrelerinin kullanılması, belirli gerçek dünya hasta gruplarında hücresel fizyolojinin araştırılmasına ve denenmesine olanak tanır. CIED'ler, bradiaritmi, kalp yetmezliği ve ventriküler taşiaritmilerin birincil ve ikincil önlenmesi olan hastalar dahil olmak üzere çeşitli endikasyonlar için implante edilir¹⁰. Bu hastalar sıklıkla diyabet, obezite ve koroner arter hastalığı dahil olmak üzere kardiyovasküler araştırmaların önemli bir küresel odak noktası olan çoklu komorbiditeye sahiptir 11,12,13. Ayrıca, bu yazıdaki açıklayıcı veriler kontrol hastaları ile ilgili olsa da, bu teknikleri, ileri kalp yetmezliği ve/veya tip 2 diabetes mellituslu hastalar da dahil olmak üzere bir dizi hastadan SATMVEC'i izole etmek ve incelemek için uyguladık.

Nadiren değil, hücre izolasyonu girişimini takiben zayıf hSATMVEC verimleri ile ilgili problemlerle karşılaşıyoruz. Bu risk, hSATMVEC'i izole etmek için daha büyük bir SAT başlangıç hacmi kullanılarak önemli ölçüde azaltılabilir. Ayrıca SAT'ta kardiyometabolik hastalığı olan ve özellikle diyabeti olan kişilerden bu durumla daha sık karşılaşıyoruz.

Bu tekniğin bir sınırlaması, izole edilmiş hSATMVEC'in yalnızca sınırlı sayıda geçişe maruz kalabilmesidir. Pasaj 5'ten sonraki deneyimlerimize göre, hasta fenotipinden bağımsız olarak, hSATMVEC proliferasyonu önemli ölçüde yavaşlar. Ek olarak, bu teknik kullanılarak izole edilen hSATMVEC, çok seyrek nüfuslu olduğunda iyi çoğalmaz; bu nedenle, hSATMVEC'i 1:6'dan daha büyük bir oranda geçirmemenizi öneririz. Sayfa 1'de belirtildiği gibi. 4 yıla kadar sıvı nitrojen içinde depolanan hSATMVEC'i başarıyla çözdük ve yeniden canlandırdık ve deneyimlerimize göre, daha düşük bir geçiş numarasında kriyoprezervasyon yapıldığında yeniden canlandırma şansı daha yüksektir (genellikle hSATMVEC'i 2. geçişte kriyoprezervasyon yaparız).

CIED yerleştirilmesinde alınan doku serbestçe temin edilebilir ve hastaya zarar vermeden toplanabilir. Bu nedenle, bu hasta gruplarından erişimi kolay, nispeten invaziv olmayan bir endotel hücresi kaynağı, hedefe yönelik araştırmaların yürütülmesinde büyük fayda sağlar. Bu yazıdaki temsili görüntüler 'kontrol' hastalarından (yani, CIED implantasyonu endikasyonu olmasına rağmen kalp yetmezliği veya diyabet tanısı olmayan hastalardan) türetilirken, kalp yetmezliği, diyabet ve bu patolojilerin bir kombinasyonu olan hastalardan SATMVEC'leri başarıyla izole ettik, kültürledik ve birlikte kültürledik. Ayrıca, bu teknikler iskelet kası da dahil olmak üzere diğer mikrovasküler yataklara da uygulanabilir ve şu anda bir iskelet kası MVEC-miyosit karışma modelini optimize ediyoruz.

hSATMVEC'ler, CIED yerleştirme sırasında alınan insan dokusundan izole edilebilir ve kardiyometabolik hastalığı olan ve olmayan kişilerde mikrovasküler disfonksiyonu ve endotel hücre-adiposit çapraz konuşmasını incelemek için deneysel olarak kullanılmak üzere yeterli saflıktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
170L CO2 Incubator	GS Biotech	170G-014
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose)	Invitrogen	N13195
4% PARAFIX buffered histological fixative	VWR Chemicals	PRC/R/38/1
Akt (tAkt) Rabbit  1:1000	Cell Signalling Technology	9272
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pk	Medisave	393230
Bovine Serum Albumin solution, 7.5%	Merck	A8412-100ML
CD144 (VE-Cadherin) Antibody, anti-human, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-118-495
CD31 Antibody, anti-human, PerCP-Vio 700, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-811
CD31 MicroBead Kit, human, 1 kit	Miltenyi Biotec	130-091-935
CD45 Antibody, anti-human, FITC, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-769
Cell Extraction Buffer	Invitrogen	FNN0011
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000060
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye	Invitrogen	C10337	Cell proliferation imaging kit
Collagenase/Dispase, 500 mg	Roche/Merck	11097113001
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Basement Membrane Matrix
Corning 100 mm TC-treated Culture Dish	Corning	430167
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3526
Costar 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3516
CytoFLEX S – 4 laser flow Cytometer	Beckman
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline	Merck	D8537-500ML
EASYstrainer Cell sieve for 50 mL tubes, 70 µm mesh, Blue, sterile, 50/pk	Greiner Bio-One	542070
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes	Merck	EP0030120094
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	Merck	E8008-100ML
Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polystyrene Permeable Support Companion Plate, with Lid, Sterile, 1/Pack, 50/Case	Appleton Woods	CF537
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 0.4 µm Transparent PET Membrane, Sterile, 1/Pack, 48/Case	Appleton Woods	CF521
Freezing Medium Cryo-SFM	PromoCell	C-29912
Gelatin solution, 2% in water	Merck	G1393-100ML
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x), 100mL	Fisher Scientific	11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Fisher Scientific	12563029
Hanks′ Balanced Salt solution	Merck	H6648-500ML
Human Subcutaneous Preadipocyte Cells	Lonza	PT-5020
Incucyte ZOOM	Essen BioScience		Live-cell analysis system
Insulin solution human	Merck	I9278-5ML
LS Columns, 25/pk	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi Biotec	130-100-008
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Tube Rotator
MS Columns, 25/pk	Miltenyi Biotec	130-042-201
NuPAGE 4–12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	PT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000	Cell Signalling Technology	9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  1:1000	Cell Signalling Technology	4060
Pre-Separation Filters 30 µm, 50/pk	Miltenyi Biotec	130-041-407
Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution	Cell Signalling Technology	4087
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Scalpel Disposable Sterile Style 10	VWRI	501
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstetd	62.554.502
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print	Sarstedt	62.547.254
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print	Sarstetd	62.547.254
Total eNOS Mouse 1:1000	BD Biosciences	610297
Triton X-100, BioUltra, for molecular biology	Merck	93443-500ML
β-Actin (C4) Mouse 1:5000	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778