Burada, insan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC'ler) mikrovasküler endotel hücrelerinin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fenotiplendirilmesi için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modelini açıklıyoruz.
Mikrovasküler endotel hücreleri (MVEC'ler), vasküler tonusun kontrolü, trombozun düzenlenmesi ve anjiyogenez dahil olmak üzere birçok kritik role sahiptir. Endotel hücre (EC) genotipi ve fenotipindeki önemli heterojenlik, vasküler yataklarına ve konak hastalık durumuna bağlıdır. MVEC'leri dokuya özgü vasküler yataklardan ve bireysel hasta gruplarından izole etme yeteneği, farklı hastalık durumlarında MVEC fonksiyonunu doğrudan karşılaştırma fırsatı sunar. Burada, kardiyak implante edilebilir elektronik cihazların (CIED) yerleştirilmesi sırasında alınan deri altı yağ dokusu (SAT) kullanılarak, fonksiyonel insan deri altı yağ dokusu MVEC'nin (hSATMVEC) saf bir popülasyonunun izolasyonu için bir yöntem ve deneysel bir hSATMVEC-adiposit çapraz konuşma modeli açıklanmaktadır.
hSATMVEC, SAT'ın anti-CD31 antikor kaplı manyetik boncuklarla inkübe edilerek enzimatik sindirilmesini ve manyetik kolonlardan geçirilmesini takiben izole edildi. hSATMVEC, jelatin kaplı plakalar üzerinde büyütüldü ve geçirildi. Deneylerde 2-4 pasajlarında hücreler kullanıldı. Hücreler, en az 5. pasaja kadar EC morfolojisinin klasik özelliklerini korudular. Flow sitometrik değerlendirmede CD31+/CD144+/CD45- olarak tanımlanan izole hSATMVEC'in saflığı %99.5 olarak görüldü. Kontrollerden izole edilen hSATMVEC, yaklaşık 57 saatlik bir popülasyon ikiye katlama süresine sahipti ve aktif proliferasyon, bir hücre proliferasyonu görüntüleme kiti kullanılarak doğrulandı. İzole hSATMVEC fonksiyonu, insülin stimülasyonuna yanıtları ve anjiyojenik tüp oluşturma potansiyeli kullanılarak değerlendirildi. Daha sonra hücresel çapraz konuşmayı incelemek için bir hSATMVEC-deri altı adiposit ko-kültür modeli kurduk ve hSATMVEC'in adiposit fonksiyonu üzerinde aşağı yönlü bir etkisi olduğunu gösterdik.
hSATMVEC, CIED yerleştirme sırasında alınan SAT'den izole edilebilir ve hem deneysel olarak fenotip hem de hSATMVEC-adiposit çapraz konuşmasını incelemek için yeterli saflıktadır.
Endotel hücreleri (EC'ler), kan damarı duvarının iç yüzeyini tek tabaka halinde kaplayan skuamöz hücrelerdir. Vasküler tonusun kontrolü, trombozun düzenlenmesi, inflamatuar yanıtın modüle edilmesi ve anjiyogeneze katkıda bulunulması gibi birçok önemli rolleri vardır1. Endotel hücrelerinin kardiyometabolik fizyolojideki önemi göz önüne alındığında, patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasında ve kardiyometabolik hastalıklar için yeni farmakolojik tedavilerin incelenmesinde sıklıkla deneysel olarak kullanılmaktadırlar.
Bununla birlikte, vasküler yataklarınınkökenine bağlı olarak endotel hücre morfolojisi, işlevi, gen ekspresyonu ve antijen bileşiminde muazzam bir heterojenlik vardır 2. Büyük arterlerden alınan endotel hücreleri ateroskleroz çalışmaları için en uygun iken, mikrovasküler endotel hücreleri (MVEC'ler) olarak bilinen küçük damarlardan alınan endotel hücreleri anjiyogenez çalışmaları için daha uygundur2. Endotelyal heterojenitenin moleküler temelini anlamak, vasküler yatağa özgü tedaviler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Mikrovasküler endotel fonksiyonu ayrıca diyabet, kardiyovasküler hastalık ve sistemik enfeksiyon dahil olmak üzere çok sayıda hastalıkta önemli ölçüde farklılık gösterir 3,4. Bu nedenle, endotel hücrelerini tanımlanmış hasta gruplarından izole etme yeteneği, endotel hücre fonksiyonlarının ve hücresel çapraz konuşmanın doğrudan karşılaştırılmasına izin verir5.
Bu yazıda, kardiyak implante edilebilir elektronik cihaz (CIED) yerleştirilmesi sırasında alınan deri altı yağ dokusundan (hSATMVEC) insan MVEC'lerini izole etmek için yeni bir yöntem tanımlanmıştır. Deri altı yağ dokusunun (SAT) enzimatik sindirimini takiben izole edilen hSATMVEC, büyütüldü ve jelatin kaplı plakalar üzerinde geçirildi. Daha sonra, fenotiplerini doğrulamak ve rutin endotel hücre testlerinde kullanımlarını göstermek için hSATMVEC'lere başarıyla uygulanan bir dizi fenotipleme testini açıklıyoruz. Son olarak, deneysel bir hSATMVEC'ler-adiposit çapraz konuşma modelinde hSATMVEC'lerin bir uygulamasını açıklıyoruz.
Tarif edilen teknikte kullanılan insan dokusu örnekleri, Leeds Eğitim Hastaneleri NHS Trust'ta (Leeds, Birleşik Krallık) rutin klinik uygulamaya göre CIED'lerin kılavuzda belirtilen yerleştirilmesi uygulanan hastalardan alınmıştır. Çalışma protokolü, diğer tüm belgelerle birlikte, katılımcı kaydından önce yerel etik kurul (11/YH/0291) tarafından onaylanmıştır. Çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür.
1. Hasta popülasyonu
2. Endotel hücre izolasyonu ve kültürü
NOT: hSATMVEC izolasyonu için bir şema Şekil 1'de gösterilmiştir.
3. Akış sitometrisi
4. Endotel hücre ikiye katlanma süresi ve hücre proliferasyonu (Şekil 3)
5. Endotel hücre tüpü oluşumu
6. hSATMVEC'in insülin stimülasyonu
7. hSATMVEC-adiposit ko-kültür kurulumu (Şekil 4)
NOT: Aşağıdaki sonuçlarda, tüm adiposit testlerinde tek bir erkek Kafkas donöründen alınan 2. pasajda ticari olarak temin edilebilen insan beyaz deri altı preadipositleri kullanılmıştır. Preadipositler başlangıçta satıcı tarafından sağlanan flakondan (pasaj 0) kriyo-SFM dondurma ortamı içeren on iki kriyoviyal (pasaj 1) genişletildi.
8. Adiposit 2- (N- (7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il) Amino) -2-Deoksiglukoz (2-NBD) -glikoz alımı
hSATMVEC saflığı ve fenotip
Kontrol hastalarından (yani kardiyometabolik hastalık öyküsü olmayan kişilerden) izole edilen hSATMVEC, akım sitometrisinde %99.5 CD31 + CD144 + CD45- idi (Şekil 2). İzole edilmiş hSATMVEC, EC'lere özgü parke taşı benzeri bir morfolojiye sahipti (Şekil 3A). hSATMVEC'lerin ortalama popülasyon ikiye katlanma süresi 56.6 saat ± 8.1 saat (ortalama ± SEM, n = 10) idi (Şekil 3B) ve hSATMVEC'lerde aktif DNA replikasyonu bir hücre proliferasyonu görüntüleme kiti kullanılarak doğrulandı (Şekil 3C).
hSATMVEC, çalışan MVEC'ler gibi davrandı ve Matrigel'de tüpler oluşturdu (Şekil 3D). İnsülin sinyal Akt-eNOS yolağında yer alan anahtar proteinlerin nispi ekspresyonu Şekil 3E'de gösterilmiştir. Hem eNO'lar hem de Akt, insülinin neden olduğu fosforilasyonda artışlar gösterdi, bu da μ-aktine normalize edilmiş fosforile protein/toplam protein oranı olarak temsil edildi (Şekil 3E).
hSATMVEC-adiposit ko-kültürü
hSATMVEC-adiposit ko-kültürünün açıklayıcı bir modeli Şekil 4A'da görülebilir. İnsan deri altı beyaz preadipositleri daha belirgin hale geldikçe, Yağ Kırmızısı O boyaması ile ölçülebilen lipid vakuollerinin gelişimi fark edilecektir (Şekil 4B).
20 μM 2-NBD glukoz ile 30 dakikalık inkübasyonu takiben farklılaşmış adipositlerin açıklayıcı faz kontrastı ve floresan görüntülemesi (uyarma 440-480 nm / emisyon 504-544 nm) Şekil 4C'de gösterilmiştir. Glikoz alımı, yeşil alanın toplam hücre alanının yüzdesi olarak ölçülmesiyle ölçülebilir.
Şekil 1: hSATMVEC'lerin hasat edilmesini ve işlenmesini gösteren şematik Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kültürlenmiş hSATMVEC'lerin akış sitometrisi analizinin tipik çıktısı. (A) Yan saçılma alanının (SSC-A) ve ileri saçılma alanının (FSC-A) dağılım grafiği, kültürlenmiş hSATMVEC'lerin belirli hücre popülasyon yoğunluğu etrafında geçitini (kırmızı kutu) gösterir. (B) Belirli hücre popülasyon yoğunluğu etrafında kültürlenmiş hSATMVEC'lerin ileri saçılma genişliğini (FSC-Genişlik) ve FSC-A'yı gösteren saçılma grafiği. (C) Kapılı hücrelerin CD45-FITC'ye floresansını gösteren histogram. (D) CD144-PE (x ekseni) ve CD31-PerCP'nin (y ekseni) floresan yoğunluğunun saçılma grafiği. (E) Kapılı hücrelerin CD144-PE'ye floresansını gösteren histogram. (F) Kapılı hücrelerin CD31-PerCP'ye floresansını gösteren histogram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: hSATMVEC fenotipi. (A) parke taşı benzeri bir görünüm gösteren kavşağın yakınında hSATMVEC'in ışık mikroskobu görüntüsü. (B) hSATMVEC ikiye katlama süresi - HATEC'in ışık mikroskobu 24 saat arayla alındı ve hücre proliferasyonunun derecesini gösterdi. (C) hSATMVEC çoğalması. Kontrol deneklerinden propidyum iyodür ve EdU / Alexa-fluor 488 ile hSATMVEC'in floresan mikroskobu. (D) kontrol deneklerinden hSATMVEC tüp oluşumu (4x büyütmede çekilen görüntüler). (E) HATEC'lerin insülin stimülasyonu - fosforile Akt'in (serin 473) toplam Akt'a (sol panel) fosforile eNOS'a (serin 1177) toplam eNOS'a (sağ panel) artan insülin konsantrasyonlarında nispi ekspresyonunu gösterir B-aktin standardize edilmiş açıklayıcı western lekeleri ile. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Örnek boyutları her panelin altındadır. Kısaltmalar: 5-Etinil-2'-deoksiüridin (EdU), insan deri altı yağ dokusu mikrovasküler endotel hücreleri (hSATMVEC), ortalamanın standart hatası (SEM). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: hSATMVEC-adiposit ko-kültürü. (A) hSATMVEC-adiposit ko-kültürünün şematik görüntüsü. (B) Adipositlerin farklılaşması. Sol panel 0. günde preadipositleri gösterir ve sağ panel PDM ilavesinden sonra 10. günde farklılaşmış adipositleri gösterir. Alttaki şekil, Yağ Kırmızısı O. (C) Glikoz alım testi ile boyanmış adipositlerde ve preadipositlerde depolanan lipit miktarını göstermektedir. Sol panel, 30 dakika boyunca 20 μM 2-NBD glukoz ile ko-kültür ve inkübasyonu takiben adipositlerin faz görüntülemesini gösterir. Sağdaki panel, glikoz alımının (toplam alanın %'si yeşil olarak) ölçülebildiği yeşil görüntülemeyi gösterir. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. Kısaltmalar: Gün 10 (D10), insan deri altı yağ dokusu mikrovasküler endotel hücreleri (hSATMVEC), preadiposit farklılaşma ortamı (PDM) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Akış sitometrisi için boyama kokteyli. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu çalışma, CIED'lerin rutin implantasyonu sırasında SAT'den alınan hSATMVEC'i izole etme tekniğini açıklamaktadır. İzole edilen hSATMVEC'in yüksek saflığa sahip olduğunu, EC'ye özgü transmembran proteinleri CD144 ve CD31'i eksprese ettiğini ve lökosit CD45'in önemli bir ekspresyonunu göstermediğini gösterdik. Tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde, izole edilmiş hSATMVEC proliferasyonunu ve insülin sinyalizasyonu ve anjiyogenezde yer alan hücre içi mekanizmayı incelemek için deneysel olarak kullanılabileceğini göstermeye devam ediyoruz. Onları ayrı ayrı kültürleyebilmenin yanı sıra, hSATMVEC-adiposit çapraz konuşmasını incelemek için ortak kültürde de kullanılabilirler.
Temel ve translasyonel araştırmalarda kullanılan endotel hücreleri genellikle aort ve insan göbek damarı veya mikrovaskülatür gibi büyük damarlardan elde edilir. Bu kaynakların her ikisinin de kendi sınırlamaları vardır 7,8; Büyük damarlardan gelen endotel hücrelerine erişmek zordur (aort dokusu durumunda) veya potansiyel olarak farklı fizyoloji ve çevresel maruziyete sahip yenidoğan dokusundan türetilir9. CIED implantasyonu sırasında alınan dokudan izole edilen endotel hücrelerinin kullanılması, belirli gerçek dünya hasta gruplarında hücresel fizyolojinin araştırılmasına ve denenmesine olanak tanır. CIED'ler, bradiaritmi, kalp yetmezliği ve ventriküler taşiaritmilerin birincil ve ikincil önlenmesi olan hastalar dahil olmak üzere çeşitli endikasyonlar için implante edilir10. Bu hastalar sıklıkla diyabet, obezite ve koroner arter hastalığı dahil olmak üzere kardiyovasküler araştırmaların önemli bir küresel odak noktası olan çoklu komorbiditeye sahiptir 11,12,13. Ayrıca, bu yazıdaki açıklayıcı veriler kontrol hastaları ile ilgili olsa da, bu teknikleri, ileri kalp yetmezliği ve/veya tip 2 diabetes mellituslu hastalar da dahil olmak üzere bir dizi hastadan SATMVEC'i izole etmek ve incelemek için uyguladık.
Nadiren değil, hücre izolasyonu girişimini takiben zayıf hSATMVEC verimleri ile ilgili problemlerle karşılaşıyoruz. Bu risk, hSATMVEC'i izole etmek için daha büyük bir SAT başlangıç hacmi kullanılarak önemli ölçüde azaltılabilir. Ayrıca SAT'ta kardiyometabolik hastalığı olan ve özellikle diyabeti olan kişilerden bu durumla daha sık karşılaşıyoruz.
Bu tekniğin bir sınırlaması, izole edilmiş hSATMVEC'in yalnızca sınırlı sayıda geçişe maruz kalabilmesidir. Pasaj 5'ten sonraki deneyimlerimize göre, hasta fenotipinden bağımsız olarak, hSATMVEC proliferasyonu önemli ölçüde yavaşlar. Ek olarak, bu teknik kullanılarak izole edilen hSATMVEC, çok seyrek nüfuslu olduğunda iyi çoğalmaz; bu nedenle, hSATMVEC'i 1:6'dan daha büyük bir oranda geçirmemenizi öneririz. Sayfa 1'de belirtildiği gibi. 4 yıla kadar sıvı nitrojen içinde depolanan hSATMVEC'i başarıyla çözdük ve yeniden canlandırdık ve deneyimlerimize göre, daha düşük bir geçiş numarasında kriyoprezervasyon yapıldığında yeniden canlandırma şansı daha yüksektir (genellikle hSATMVEC'i 2. geçişte kriyoprezervasyon yaparız).
CIED yerleştirilmesinde alınan doku serbestçe temin edilebilir ve hastaya zarar vermeden toplanabilir. Bu nedenle, bu hasta gruplarından erişimi kolay, nispeten invaziv olmayan bir endotel hücresi kaynağı, hedefe yönelik araştırmaların yürütülmesinde büyük fayda sağlar. Bu yazıdaki temsili görüntüler 'kontrol' hastalarından (yani, CIED implantasyonu endikasyonu olmasına rağmen kalp yetmezliği veya diyabet tanısı olmayan hastalardan) türetilirken, kalp yetmezliği, diyabet ve bu patolojilerin bir kombinasyonu olan hastalardan SATMVEC'leri başarıyla izole ettik, kültürledik ve birlikte kültürledik. Ayrıca, bu teknikler iskelet kası da dahil olmak üzere diğer mikrovasküler yataklara da uygulanabilir ve şu anda bir iskelet kası MVEC-miyosit karışma modelini optimize ediyoruz.
hSATMVEC'ler, CIED yerleştirme sırasında alınan insan dokusundan izole edilebilir ve kardiyometabolik hastalığı olan ve olmayan kişilerde mikrovasküler disfonksiyonu ve endotel hücre-adiposit çapraz konuşmasını incelemek için deneysel olarak kullanılmak üzere yeterli saflıktadır.
SS, AstraZeneca'dan finansal olmayan destek, konuşmacı ücretleri ve onur ödülü aldı. RC, Janssen Onkoloji'den konuşmacı ücreti aldı. OİB, Novartis'ten konuşmacı ücreti almıştır.
Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi hibe fonu (BBSRC BB/R000352/1) tarafından desteklenen akış sitometrisi tesisinin kullanımı için Biyolojik Bilimler Fakültesi Biyogörüntüleme Bölümü'ne (Leeds Üniversitesi, Birleşik Krallık) çok müteşekkiriz. SS, İngiliz Kalp Vakfı Klinik Araştırma Eğitim Bursu (FS/CRTF/20/24071) tarafından desteklenmiştir. CL, İngiliz Kalp Vakfı doktora öğrencisi (FS/19/59/34896) tarafından desteklenmiştir. LDR, Diabetes UK RD Lawrence Fellowship ödülü (16/0005382) tarafından desteklenmiştir. RMC, İngiliz Kalp Vakfı Orta Düzey Klinik Araştırma Bursu (FS / 12/80/29821) tarafından desteklenmiştir. MTK, İngiliz Kalp Vakfı Kardiyovasküler ve Diyabet Araştırmaları Profesörüdür (CH/13/1/30086) ve İngiliz Kalp Vakfı programı hibesine (RG/F/22/110076) sahiptir
Name | Company | Catalog Number | Comments |
170L CO2 Incubator | GS Biotech | 170G-014 | |
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) | Invitrogen | N13195 | |
4% PARAFIX buffered histological fixative | VWR Chemicals | PRC/R/38/1 | |
Akt (tAkt) Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 9272 | |
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pk | Medisave | 393230 | |
Bovine Serum Albumin solution, 7.5% | Merck | A8412-100ML | |
CD144 (VE-Cadherin) Antibody, anti-human, PE, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-118-495 | |
CD31 Antibody, anti-human, PerCP-Vio 700, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-811 | |
CD31 MicroBead Kit, human, 1 kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
CD45 Antibody, anti-human, FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-769 | |
Cell Extraction Buffer | Invitrogen | FNN0011 | |
Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5805000060 | |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | Cell proliferation imaging kit |
Collagenase/Dispase, 500 mg | Roche/Merck | 11097113001 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Basement Membrane Matrix |
Corning 100 mm TC-treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3526 | |
Costar 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3516 | |
CytoFLEX S – 4 laser flow Cytometer | Beckman | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Merck | D8537-500ML | |
EASYstrainer Cell sieve for 50 mL tubes, 70 µm mesh, Blue, sterile, 50/pk | Greiner Bio-One | 542070 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | |
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes | Merck | EP0030120094 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Merck | E8008-100ML | |
Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polystyrene Permeable Support Companion Plate, with Lid, Sterile, 1/Pack, 50/Case | Appleton Woods | CF537 | |
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 0.4 µm Transparent PET Membrane, Sterile, 1/Pack, 48/Case | Appleton Woods | CF521 | |
Freezing Medium Cryo-SFM | PromoCell | C-29912 | |
Gelatin solution, 2% in water | Merck | G1393-100ML | |
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x), 100mL | Fisher Scientific | 11570486 | |
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12563029 | |
Hanks′ Balanced Salt solution | Merck | H6648-500ML | |
Human Subcutaneous Preadipocyte Cells | Lonza | PT-5020 | |
Incucyte ZOOM | Essen BioScience | Live-cell analysis system | |
Insulin solution human | Merck | I9278-5ML | |
LS Columns, 25/pk | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Tube Rotator |
MS Columns, 25/pk | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
NuPAGE 4–12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | PT-8002 | |
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 9570 | |
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit 1:1000 | Cell Signalling Technology | 4060 | |
Pre-Separation Filters 30 µm, 50/pk | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution | Cell Signalling Technology | 4087 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Scalpel Disposable Sterile Style 10 | VWRI | 501 | |
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstetd | 62.554.502 | |
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print | Sarstedt | 62.547.254 | |
Screw cap tube, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, with print | Sarstetd | 62.547.254 | |
Total eNOS Mouse 1:1000 | BD Biosciences | 610297 | |
Triton X-100, BioUltra, for molecular biology | Merck | 93443-500ML | |
β-Actin (C4) Mouse 1:5000 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır
Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz
Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.