הדמיה אורכית in vivo של תאי רשתית עם סרוטיפים מותאמים של וירוסים הקשורים לאדנו, באמצעות סריקה קונפוקלית לייזר אופטלמוסקופיה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בווקטורים של נגיף הקשור לאדנו (AAV) לתיוג ספציפי לתא והדמיה in vivo באמצעות אופתלמוסקופ לייזר סורק קונפוקלי (CSLO). שיטה זו מאפשרת לחקור סוגים שונים של תאי רשתית ותרומתם לתפקוד הרשתית ולמחלות.

Abstract

האופי הדינמי של תהליכים תאי ברשתית מחייב התקדמות בהעברת גנים וטכניקות ניטור חיות כדי לשפר את ההבנה והטיפול במחלות עיניים. מחקר זה מציג גישה אופטימלית של נגיף הקשור לאדנו-(AAV), תוך שימוש בסרוטיפים ומקדמים ספציפיים כדי להשיג יעילות טרנספקציה אופטימלית בתאי רשתית ממוקדים, כולל תאי גנגליון רשתית (RGCs) וגליה מולר. תוך מינוף הדיוק של אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית (CSLO), עבודה זו מציגה שיטה לא פולשנית להדמיה in vivo הלוכדת את הביטוי האורכי של חלבון פלואורסצנטי ירוק בתיווך AAV (GFP). גישה זו מבטלת את הצורך בהליכים סופניים, תוך שמירה על המשכיות התצפית ורווחת הנבדק. יתר על כן, ניתן לעקוב אחר אות ה-GFP ב-RGCs נגועים ב-AAV לאורך נתיב הראייה לקוליקולוס העליון (SC) ולגרעין הגניקולט הרוחבי (LGN), מה שמאפשר את הפוטנציאל למיפוי מסלול ראייה ישיר. ממצאים אלה מספקים פרוטוקול מפורט ומדגימים את היישום של כלי רב עוצמה זה למחקרים בזמן אמת של התנהגות תאי הרשתית, פתוגנזה של מחלות ויעילות התערבויות ריפוי גנטי, ומציעים תובנות חשובות לגבי הרשתית החיה והקשרים שלה.

Introduction

בהיותה החלק היחיד הנגיש אופטית של מערכת העצבים המרכזית, הרשתית משמשת כמודל רב ערך למחקר במדעי המוח¹. תאי גנגליון רשתית (RGCs), נוירוני הפלט של הרשתית המעבירים מידע חזותי למוח, ממלאים תפקיד מכריע בתפקוד הראייה. אובדן או תפקוד לקוי שלהם מובילים לליקוי ראייה ולעיוורון בלתי הפיך, כפי שניתן לראות בגלאוקומה ונוירופתיות אופטיות אחרות². Müller glia, תאי הגליה העיקריים ברשתית, חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ברשתית, מתן תמיכה מבנית ומטבולית לנוירונים, ויסות רמות נוירוטרנסמיטורים ותרומה לתיקון והתחדשות הרשתית³. תפקודם הלקוי מעורב במחלות רשתית שונות, כולל רטינופתיה סוכרתית⁴, ניוון מקולרי הקשור לגיל⁵ ותסמונת איסכמית עינית⁶. RGCs ו-Müller glia מציגים אינטראקציות קרובות ותלות הדדית; Müller glia מספק תמיכה חיונית ל-RGCs, בעוד שפעילות RGC יכולה להשפיע על פונקציית Müller glia ^3,7. חקר RGCs ו-Müller glia הוא חיוני להבנת תפקוד הרשתית ולפיתוח טיפולים יעילים למחלות רשתית מרובות.

ההערכות הנוכחיות בחקר הרשתית משתמשות בעיקר בטכניקות כמו טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) כדי למדוד את עובי שכבת סיבי העצב ברשתית או את המסלולים של צרורות אקסונים ^8,9. בעוד ששיטות אלו לא יסולא בפז לאיתור אובדן RGC, הן אינן מספקות תצוגה מפורטת של מורפולוגיה של RGC ותאי גליה עקב רזולוציה מוגבלת. באופן דומה, למרות שטכניקות מתקדמות כמו אופטיקה אדפטיבית סורקת לייזר אופטלמוסקופיה (AO-SLO) מאפשרות הדמיה ברמת התא של RGCs, קולטני אור ותאי גליה ברשתית האנושית החיה^, המורכבות הטכנית והנגישות המוגבלת שלהם מגבילות את השימוש בהם בעיקר למסגרות מחקר מיוחדות. בהתחשב באילוצים אלה, קיים צורך מתמשך בפיתוח שיטות נגישות ואמינות יותר למחקר מעמיק של אוכלוסיות תאי רשתית ספציפיות in vivo.

בהתאם לכך, פרוטוקול זה נועד להציג גישת הדמיה חלופית המתאימה ליישומי מחקר בתאי רשתית. הוא משלב את העוצמה של תיוג ספציפי לסוג תא בתיווך AAV עם האופי הלא פולשני של הדמיית CSLO. נגיפים הקשורים לאדנו (AAVs) הם וקטורים רב-תכליתיים להעברת גנים הידועים באימונוגניות הנמוכה שלהם וביכולתם להמיר מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאים מתחלקים ולא מתחלקים¹¹. זה הופך אותם לכלים אידיאליים למיקוד אוכלוסיות תאים ספציפיות בסביבת הרשתית המורכבת. על ידי שימוש בווקטורי AAV עם סרוטיפים ומקדמים שנבחרו בקפידה, ניתן להשיג ביטוי סלקטיבי של חלבונים פלואורסצנטיים במספר סוגי תאים מעניינים, כגון RGCs ו-Müller glia. לדוגמה, AAV2 ידוע ביעילות ההתמרה הגבוהה יותר שלו ב-RGCs^12,13, בעוד ש-AAV8 יעיל באופן ניכר בהתמקדות בקולטני אור¹⁴, ו-AAV9 מדגים יכולות טרנספקציה חזקות ב-Müller glia¹⁵, המראה יעילות רחבה על פני שכבות תאי רשתית שונות. חשוב לציין כי היעילות של AAV מסתמכת לא רק על בחירת הסרוטיפ אלא גם על המקדמים, המכתיבים את העוצמה והספציפיות של התא של ביטוי טרנסגנים, ומדגישים את החשיבות של בחירה קפדנית להשגת התמרה אופטימלית.

עבור תיוג RGC, פרוטוקול זה משתמש ב-AAV2 עם מקדם הסינפסין האנושי (hSyn). AAV2 מציג התמרה יעילה של RGCs לאחר הזרקה תוך-זגוגית¹³, ומקדם hSyn, מקדם עצבי בכל מקום, מניע ביטוי טרנסגנים חזק וספציפי בתוך תאים אלה¹⁶. עבור Müller glia, הפרוטוקול משתמש בווקטורים AAV9 המונעים על ידי מקדם GfaABC1D¹⁷, המדגים ביטוי טרנסגנים חזק בתאים אלה¹⁵. גישת תיוג ממוקדת זו מאפשרת לחוקרים להבחין בין תאים אלה לבין רקמת הרשתית הסובבת אותם ולעקוב אחריהם לאורך זמן, ומספקת בסיס למעקב in vivo של תאי הרשתית ותגובותיהם לשינויים ביו-סביבתיים.

אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית (CSLO) היא טכניקת הדמיה לא פולשנית המספקת תמונות ברזולוציה גבוהה של הרשתית החיה, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של אוכלוסיות תאי רשתית המסומנות פלואורסצנטית 18,19,20. קרן לייזר ממוקדת סורקת את הרשתית, לוכדת אור הנפלט שעובר דרך חור סיכה כדי למנוע אותות שאינם ממוקדים, וכתוצאה מכך תמונות חדות יותר עם ניגודיות משופרת. פרוטוקול זה משתמש במערכת CSLO של היידלברג ספקטרליס, שהייתה בשימוש נרחב להדמיית תאי רשתית בבעלי חיים חיים, כולל מחקרים המדמים RGCs^21,22 ומיקרוגליה²³ עם תווית טרנסגנית. על ידי שימוש ביחידת HRA CSLO עם לייזר 488 ננומטר ומסננים מתאימים, חוקרים יכולים לדמות RGCs או Müller glia המסומנים פלואורסצנטית בבעלי חיים לאחר הזרקה תוך-זגוגית של וקטורים AAV הנושאים גנים מדווחים פלואורסצנטיים. פרוטוקול ההדמיה האורכי, עם מפגשים שבועיים המכסים את הרשתית המרכזית וההיקפית, עוקב אחר שינויים לאורך זמן. כדי לתעדף את רווחת בעלי החיים, הפרוטוקול משתמש במערכת מעקב העיניים האוטומטית (ART) של יחידת HRA CSLO, המאפשרת קליטת תמונה מדויקת ללא צורך בהרדמה כללית או עדשות מגע.

פרוטוקול זה רותם את הכוח המשולב של AAV ו-CSLO כדי לאפשר ניטור אורך של סוגי תאי רשתית ספציפיים in vivo. על ידי זיווג הספציפיות של סוג התא של תיוג בתיווך AAV עם יכולות ההדמיה הלא פולשניות ברזולוציה גבוהה של CSLO, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את השינויים הדינמיים ב-RGCs וב-Müller glia בתגובה לגירויים או התערבויות שונות. תובנות אלו טומנות בחובן פוטנציאל משמעותי לפיתוח אסטרטגיות אבחון וטיפול חדשות למחלות רשתית.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג'ינג. עכברים זכרים בוגרים בני ארבעה שבועות C57BL/6J (במשקל של בין 15-20 גרם) שימשו לכל הניסויים ושוכנו בחדרים מבוקרי טמפרטורה עם מחזור אור/חושך של 12/12 שעות. צ'או מכרסמים סטנדרטיים ומים היו זמינים אד ליביטום. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. טרנספקציה של תאי רשתית בתיווך AAV

הערה: עבור התמרה ממוקדת של RGCs, פרוטוקול זה משתמש ב-AAV2-hSyn-eGFP, המשלב את מקדם hSyn כדי להניע ביטוי חזק של GFP משופר. Müller glia ממוקד באמצעות AAV9-GfaABC1D-eGFP. כדי להשיג יעילות טרנסדוקציה אופטימלית וביטוי טרנסגנים חזק, מומלץ טיטר AAV מינימלי של 1 x 10¹² גנומים נגיפיים (vg)/mL להזרקות תוך זגוגיות בעכברים¹³.

1. הקפידו על פרוטוקולי בטיחות מחמירים בעת ביצוע הליכי העברת תאי רשתית בתיווך AAV כדי למנוע חשיפה מקרית ולהבטיח סביבת עבודה בטוחה.
2. בצע את כל ההליכים הכוללים וקטורים נגיפיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך (BSC). צייד את הצוות בציוד מגן אישי מתאים (PPE), כולל מעילי מעבדה, כפפות והגנה על העיניים, לאורך כל ההליך.
3. השלך את כל החדים והחומרים המסוכנים כראוי בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות המוסדיים כדי לשמור על תאימות ולהגן על כל אנשי המעבדה.

2. הכנת וקטורים ויראליים ובעלי חיים

1. השג AAV2-hSyn-eGFP או וקטורי AAV9-GfaABC1D-eGFP המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. יש להפשיר וקטורים על קרח מיד לפני השימוש כדי לשמור על שלמות הנגיף.
2. יש להרדים את העכברים בהזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל במינון של 50 מ"ג/ק"ג. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים של כף הרגל האחורית לפני פעולות נוספות.
3. חתוך את השפם כדי למנוע הפרעה לאזור הניתוח במהלך ההליך. יש לחטא את המסלול בתמיסת פובידון-יוד של 20% למשך 2 שניות, ואז לשטוף היטב במי מלח רגילים סטריליים.
4. יש למרוח טיפה של 0.5% פרופרקאין באופן מקומי כדי למזער את אי הנוחות ולמנוע תנועות עיניים לא רצוניות.

3. טיפול והזרקה תוך זגוגית של וקטורים ויראליים

1. העבר 1 מיקרוליטר של תמיסת AAV נבחרת (AAV2-hSyn-eGFP או AAV9-GfaABC1D-eGFP) לחתיכת סרט פרפין נקי ומקורר מראש כדי למנוע תנודות טמפרטורה שעלולות להשפיע על הפעילות הוויראלית.
2. שאפו את תמיסת ה-AAV באמצעות מזרק זכוכית המילטון עם מחט משופעת 33 G מתחת למיקרוסקופ כירורגי עיניים.
3. הנח את העכבר בשכיבה גחונית מתחת למיקרוסקופ. הטה מעט את הראש כדי להרים את צד העין המיועד להזרקה. התאם ובצע אופטימיזציה של ההגדלה של המיקרוסקופ כדי לזהות בבירור את האזור העליון של מסלול העכבר.
4. הכנס את המחט 1-2 מ"מ אחורי הלימבוס בשוליים הסקלרליים העליונים של העין לתוך חלל הזגוגית. הזרקו את תמיסות ה-AAV לאט כדי למנוע זרימה חוזרת או נזק הנגרם על ידי לחץ.
   הערה: מיקום מקום ההזרקה: בצע את ההזרקה ברבע הטמפורלי העליון של העין, כ-1 מ"מ אחורי הלימבוס. בחר מיקום זה כדי להימנע מכלי דם גדולים ולמזער את הסיכון לנזק לעדשות. הימנע מאתרי הזרקה קרובים מדי ללימבוס כדי למנוע חדירת קשתית או שחיקה של העדשה. הימנעות מכלי דם: השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לבחון היטב את אתר ההזרקה המתוכנן לאיתור כלי דם גלויים לפני ההזרקה. אם יש כלי שיט, התאימו מעט את נקודת הכניסה כדי להימנע מהם. הכנס את המחט בזווית רדודה, במקביל לקשתית, כדי להפחית עוד יותר את הסיכון לנזק לכלי הדם. הימנע מזריקות חוזרות ונשנות באותו אזור כדי להפחית את הסיכון לדימום תת-רשתית.
5. שמור את המחט במקומה למשך 30 שניות כדי לאפשר לווקטורים להתפזר בתוך תא הזגוגית ולהתיישב על פני הרשתית, ובכך למקסם את הסיכויים להתמרה מוצלחת.
6. משוך את המחט לאט כדי למזער את הסיכון לזרימה חוזרת של הזגוגית.
7. מרחו משחה אנטיביוטית מקומית על מקום ההזרקה מיד לאחר ההזרקה. ודא שהמשחה נמרחת באופן אחיד כדי לכסות את פני העין במלואם, ולמנוע זיהום ודלקת בעיניים.
   הערה: המשחה האנטיביוטית מכילה 1 מ"ג/גרם דקסמתזון, 3500 יחב"ל/גרם ניאומיצין סולפט ו-6000 יחב"ל/גרם פולימיקסין B סולפט.
8. הנח את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההתאוששות מההרדמה, ועקוב אחריהם מקרוב לאיתור סימני מצוקה או חריגות. לאחר שהתאוששו לחלוטין ולא הראו סיבוכים, החזירו אותם לכלובים שלהם עם גישה למזון ומים רגילים.

4. הדמיה in vivo עם CSLO

1. הכנת בעלי חיים
   1. בחר את העכבר הנגוע ב-AAV2-hSyn-eGFP או AAV9-GfaABC1D-eGFP לאחר 4 שבועות של הזרקה תוך זגוגית. יש למרוח טיפה אחת של תמיסת עיניים המכילה 0.5% טרופיקמיד ו-0.5% פנילפרין על פני העין כדי להרחיב את האישון לקוטר של כ-2 מ"מ²².
      הערה: מומלץ מינימום של 4 שבועות של מרווח זמן התמרת AAV עבור תיוג פלואורסצנטי אופטימלי של תאי רשתית לאחר הזרקה תוך זגוגית¹³. בנוסף, בניסויי ריסוק עצב הראייה (ONC) שלנו, הרשתית צולמה 4 שבועות לאחר ההדבקה, כמו גם ביום 7 ו-14 לאחר פגיעת הריסוק. נקודות זמן אלה נבחרו כדי ללכוד הן את ביטוי ה-AAV הראשוני והן את התקדמות השינויים ברשתית לאחר ONC.
   2. כסו את פלטפורמת ההדמיה בחתיכה מהרפידה הנקייה כדי למנוע זיהום אפשרי של צואת בעלי חיים במהלך תהליך הפעולה.
      הערה: פלטפורמת ההדמיה המותאמת אישית מספקת מספיק מקום לבעל החיים לשכב על הקרקע, מבטיחה יציבות וממזערת את התנועה במהלך ריסון ידני לקליטת תמונה מיטבית.
   3. העבר בזהירות את העכבר לפלטפורמת ההדמיה ואפשר תקופת הסתגלות של 2-5 דקות לפני ההדמיה כדי למזער את הלחץ ולהקל על ההסתגלות לסביבת ההדמיה.
   4. בעזרת טכנאי שני, רסנו בעדינות את בעל החיים תוך שמירה על מצב הכרה לאורך כל ההליך. ספק מרווח מנוחה של 10 שניות לאחר 15 שניות של הדמיה כדי לאפשר מצמוץ עיניים ולשמור על לחות הקרנית.
      הערה: שפשפו בעדינות את עור הקרקפת כדי לגרום להרמת עפעפיים ספונטנית, הימנעו משימוש בריסון עפעפיים מאולץ או במכשירים נוספים כגון קליפסים, ובכך הפחיתו את הסיכון לפגיעה בעיניים. הרדמה כללית אינה משמשת לשמירה על בהירות אופטית במהלך מפגשי הדמיה ממושכים, מכיוון שיש לה פוטנציאל להחמיר את אטימות העדשה החולפת. איזון בין רכישת תמונה באיכות גבוהה לבין נוחות ובטיחות של בעלי חיים לאורך כל ההליך. השלם את ההליך כולו תוך 5 דקות כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים ולשמור על איכות ההדמיה.
   5. כוונן את תנוחת הראש ויישר את עדשת המצלמה על ידי כוונון עדין של כפתור המיקוד (איור 1B) והמיקרומניפולטור (איור 1C) כדי לכוון את אזור העניין (ROI) להדמיה עוקבת in vivo .
2. תצורת מערכת
   1. חבר עדשת זווית רחבה ללא מגע של 55° על המצלמה כדי להרחיב את שדה הראייה של אזור הפונדוס.
   2. הגדר את גלגל המסנן למיקום A (אנגיוגרפיה) כדי לאפשר רכישה של אופן הדמיה אינפרה-אדום (IR) ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) (איור 1A). הפעל את הלייזר ואת ספק הכוח כדי להפעיל את מערכת ההדמיה CSLO.
   3. פתח את התוכנה Heidelberg Eye Explorer וצור בדיקה חדשה על ידי לחיצה על סמל המטופל החדש בחלק העליון של שורת התפריטים. הזן את פרטי החיה הרלוונטיים וקבל את עקמומיות הקרנית המוגדרת כברירת מחדל של 7.7 מ"מ בחלון המוקפץ.
   4. בחר בלחצן התחל הצהוב (איור 1E) במסך לוח הבקרה כדי להפעיל את מצב ההדמיה החיה.
3. הדמיית CSLO in vivo
   1. בחר את אופן ה-IR (איור 1G) עם אופלואורסצנציה אוטומטית באורך גל עירור של 820 ננומטר בלוח הבקרה. כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה, הרזולוציה הגבוהה. מצב (HR) מופעל דרך ממשק החלון או לוח הבקרה הידני (איור 1F).
      הערה: הדמיית רפלקציה אינפרא אדום (IR) היא בדרך כלל הצעד הראשון בהדמיית עיניים CLSO, הנרכשת לפני אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA), כדי לספק תצוגה בסיסית. אפילו תאורה, חפצים מינימליים ומיקוד חד בכלי רשתית עיקריים הם חיוניים לאמינות מיקוד מישור z והשגת תמונות IR באיכות גבוהה.
   2. הזז את העדשה לכיוון עין העכבר באמצעות הג'ויסטיק עם המיקרומניפולטור XYZ להתאמה עדינה. בדוק את השקיפות האופטית וסובב את כפתור הרגישות (איור 1D) נגד כיוון השעון כדי להפחית את בהירות תמונת הפונדוס ל-40%-60%, ובכך להימנע מחשיפת יתר של הפונדוס ולשפר את ההדמיה של פרטי הרשתית.
   3. כוונן את כפתור המיקוד והמיקרומניפולטור עד שהדיסק האופטי וכלי הרשתית מזוהים באופן חד משמעי על הפונדוס.
      הערה: קריטריונים של מישור המוקד האופטימלי: (1) מבט על פונדוס מואר באופן שווה ללא פינות כהות. (2) תאורה אחידה המקיפה את הדיסק האופטי ללא כתמים כהים מוקדיים או עיוותים. (3) צורת לומן ברורה של כלי הרשתית הגדולים עם התנועה הנראית לעין של זרימת הדם.
   4. עבור לאופן FA (איור 1H) עם לייזר כחול מצב-מוצק באורך גל עירור של 488 ננומטר ומסנן מחסום ב- 500 ננומטר. סובב את כפתור הרגישות (איור 1D) בכיוון השעון כדי להגדיל את בהירות תמונת הפונדוס ל-50%-107% כדי להאיר את אזור הרשתית הממוקד.
   5. הגדר את הערך הממוצע של ART (פס כחול בפינה השמאלית התחתונה של ממשק התוכנה) ל-15 לפחות כדי לשפר את יחס האות לרעש. פונקציה זו מבצעת ממוצע של סדרה של סריקות B שנרכשו באותו מיקום, ומשפרת את איכות התמונה.
      הערה: בעוד שערך ממוצע ART גבוה יותר משפר בדרך כלל את איכות התמונה באמצעות חישוב ממוצע, הוא גם מאריך את משך הסריקה. משך זמן ממושך זה עלול להגביר את הסיכון להתייבשות בקרנית ועייפות בעלי חיים, גורמים שיש לקחת בחשבון בקפידה, במיוחד בהדמיה ערה של בעלי חיים.
   6. יישור מחדש למישור הפנימי של הרשתית, תוך התמקדות ספציפית ב-GFP המבטא RGCs או בתאי הגליה של מולר. התאמות עדינות נעשות כדי להבטיח תאורה חדה של אוכלוסיית התאים הרצויה, כגון RGC סומה ואקסונים, או גוף התא מולר. רגישות ההדמיה מאוזנת כדי להשיג הדמיה אופטימלית ולמנוע רוויה יתר של התאים החיוביים ל-GFP.
      הערה: כדי להשיג את התמונות עם בהירות ובהירות דומות של אות ה-GFP, רכישת הרגישות צריכה להיות קבועה עבור כל העכברים בניסוי.
   7. לחץ כלפי מטה על כפתור הרגישות (איור 1D) כדי להפעיל את מצב ART, שיוצר תמונה ממוצעת חיה באינטרנט. המתן עד שהפס הכחול (המייצג את ערך ה-ART Mean) בפינה השמאלית התחתונה של ממשק התוכנה יגיע לערך ה-ART שנקבע (≥-20 פריימים) והקש על כפתור הרכישה בממשק הבקרה כדי ללכוד את תמונות הפונדוס.
      הערה: עבור מצב ART, מעקב אחר תנועות עיניים משולב כדי לפצות באופן אוטומטי על תנועות עיניים קלות במהלך הדמיה in vivo , מה שמאפשר מיקוד עקבי במישור המוקד של הרשתית שנבחר.
   8. לאחר רכישת התמונות הרצויות, צא ממצב ART על ידי לחיצה על כפתור הרגישות בלוח המגע.
      הערה: כדי למנוע התייבשות בקרנית ולאפשר מצמוץ עיניים ספונטני, יושמו הפסקות של 10 שניות כל 15 שניות במהלך תהליך ההדמיה.
   9. כדי לנווט באזורי הרשתית של האף והטמפורל, הזז את ראש המצלמה אופקית תוך התבוננות בתמונה החיה על המסך. לאחר הגעה לאזור היעד, כוונן את המיקוד והתחל את תהליך ההדמיה כמתואר בשלבים 2.3.1-2.3.8.
      הערה: שמור על תנועות מצלמה איטיות ומבוקרות תוך הקפדה על תאורה עקבית ובהירה של הפונדוס. אם מופיעים אזורים כהים, השתמש במיקרומניפולטור כדי לכוונן את מיקום המצלמה אנכית ולמרכז מחדש את הרשתית.
   10. כדי לדמות את הרשתית העליונה, כוונן בעדינות את תנוחת ראש העכבר למצב עם הפנים כלפי מעלה. הטה בעדינות את ראש המצלמה כלפי מעלה כדי ליישר קו עם אזור הרשתית העליון. כוונן מחדש את המיקוד לפי הצורך והמשך בהדמיה.
   11. עם השלמת ההדמיה, כל אזורי הרשתית הרצויים, יוצאים מחלון הרכישה, והתמונות נשמרות אוטומטית. יש למרוח חומר סיכה מקומי על העין המצולמת כדי לשמור על לחות הקרנית.
   12. כדי ליזום את בדיקת העין הנגדית, מקם מחדש את החיה לצד הנגדי של הפלטפורמה וחזור על שלבים 2.3.1-2.3.11.

5. עיבוד וניתוח תמונה

1. ייצוא והכנה של תמונות
   1. פתח את תוכנת Heidelberg Eye Explorer ובחר את הפעלת ההדמיה הרצויה של CSLO באיכות טובה. בחר תמונות בודדות או עוקבות של אותו מיקום רשתית עם הגדרות רגישות עקביות לאורך זמן.
   2. אל תכלול תמונות מטושטשות עם מיקוד גרוע או בהירות קרנית, וודא שרק תמונות עם הדמיה ברורה של מבני רשתית משמשות לניתוח. ייצא תמונות אלה בתבנית TIFF להמשך עיבוד.
2. יישור וחיתוך תמונה
   1. קבץ תמונות לכל עין עכבר בהתבסס על אותו אזור רשתית.
      הערה: התמונות המקוריות שהתקבלו ממערכת CSLO נשמרות בפורמט הבא: TIFF, עם ממד של 1536 x 1536 פיקסלים, רזולוציה של 5.69 אום/פיקסל וערך ART של ≥15.
   2. לבדיקות המשך, ייבא תמונות לתוכנת עיבוד תמונה מתאימה. סובבו ויישרו את התמונות בהתאם לצורך, כך שיתאימו לכיוון של תמונת קו הבסיס. בשעת שמירה או ייצוא של התמונות המעובדות, השתמשו בקביעות השומרות על איכות התמונה הגבוהה ביותר האפשרית כדי למזער פריטי דחיסה פוטנציאליים.
   3. יישר את תמונות ה-CSLO מסדרת זמן של אותה עין על ידי סיבובם כך שיתאימו לתמונת הבסיס המתאימה באמצעות כלי הדם והדיסק האופטי כציוני דרך.
      הערה: בדוק בקפידה כל תמונה מיושרת, ולפני שתמשיך לחתוך, ודא שהיא עומדת בקריטריונים הבאים: (1) לכידת אזור רשתית מלא: התמונה חייבת להקיף במלואה את אזור העניין המיועד ברשתית, כולל ציוני דרך מרכזיים כמו הדיסק האופטי וכלי הדם העיקריים; (2) היעדר חפצי תנועה: התמונה צריכה להיות נקייה מטשטוש, פסים או שכפול של מבנים הנגרמים מתנועת עיניים במהלך ההדמיה; (3) עיוות מינימלי: התמונה צריכה לייצג במדויק את מבנה הרשתית ללא עיוות, מתיחה או דחיסה של חפצים שעלולים לנבוע מזוויות הדמיה או אפקטים של עדשות. (4) מדדי איזון איכות התמונה: הערכות של רמות רעשי רקע (סטיית תקן של עוצמות פיקסלים באזורים נטולי מבנה < 5 (סולם 0-255)); יחס אות לרעש (SNR >20), עקביות תאורה (מקדם שונות בין שישה רבעי תמונה <10%) ואחידות תמונה (מקדם שונות באזורים הומוגניים <15%).
   4. בחר את התמונה המסובבת וייצא אותה בפורמט TIFF. עבור כל נקודת זמן, השתמש בכלי החיתוך כדי לבחור ולחתוך באופן אקראי 5-10 אזורים (300 x 300 פיקסלים כל אחד) המכילים תאים חיוביים ל-GFP מהתמונות שאושרו באיכות. ייצא כל תמונה שנחתכה בנפרד בתבנית TIFF להמשך ניתוח.
3. מדידת עוצמת הקרינה
   1. פתחו את תמונות CSLO שנחתכו (גווני אפור של 8 סיביות, 300 x 300 פיקסלים) ב- ImageJ/Fiji.
   2. כדי לבחון את השינויים הכוללים באותות פלואורסצנטיים, מדוד את עוצמת הקרינה הכוללת לכל תמונה שנחתכה באמצעות ניתוח > מדידה (או Ctrl + M). רשום את הערך "Mean", המייצג את עוצמת הקרינה הממוצעת של GFP של כל התמונה שנחתכה.
4. כימות RGC
   1. ב-ImageJ/Fiji, התאם את סף העוצמה של תמונות CSLO שנחתכו באמצעות Image > Adjust > Brightness/Contrast כדי להשיג תצוגה חזותית מיטבית של גופי סומה לבנים בודדים על הרקע השחור.
      הערה: קבע סף אישי לאחר סקירת אצווה של תמונות שנחתכו, או החל אלגוריתם סף עקבי (למשל, שיטה⁵ של הואנג ב-ImageJ/Fiji). לשיטה של הואנג: (1) המרת תמונות לגווני אפור של 8 סיביות (Image > Type > 8 סיביות). (2) גש לכלי הסף (תמונה > התאם > סף). (3) בחר בהואנג כשיטת הסף. (4) תצוגה מקדימה של הפילוח ולחץ על החל. הסף יחושב באופן אוטומטי ויוצג בהיסטוגרמה של התמונה.
   2. הפעל את התוסף Cell Counter ולחץ על כל סומה RGC חיובית ל-GFP לספירה. רשום את המספר הכולל של תאים המסומנים באזור המנותח. חזור על תהליך זה עבור כל התמונות שנחתכו מכל נקודת זמן המשך.
5. ניתוח נתונים
   1. ייצא את נתוני ספירת התאים ועוצמת הקרינה לגיליון אלקטרוני או לתוכנה סטטיסטית (למשל, GraphPad Prism).
   2. לבצע בדיקות סטטיסטיות מתאימות על סמך תכנון הניסוי וההשערות המתאימות. פרש את התוצאות והסכם.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול שהוצג, תאי רשתית שונים הודגמו בהצלחה ועקבו אחר in vivo באמצעות שילוב של העברת גנים בתיווך AAV ו-CSLO. AAV2-hSyn-eGFP התמיר ביעילות RGCs, וכתוצאה מכך ביטוי eGFP חזק בכל הרשתית, כפי שאושר על ידי CSLO וקו-לוקליזציה עם הסמן הספציפי ל-RGC, חלבון קושר RNA עם שחבור מרובה (RBPMS), שנמצא...

Discussion

הפרוטוקול המוצג מפרט שיטה חזקה ונגישה למעקב in vivo של אוכלוסיות תאי רשתית ספציפיות, תוך רתימת הכוח של העברת גנים בתיווך AAV והדמיית CSLO. גישה זו מציעה מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות, המאפשרת מחקרי אורך של דינמיקת תאי הרשתית ותגובותיהם לפציעה או מחלה בתנאים פיזיולוגי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 Gauge Needle	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	For intravitreal injection
0.5% proparacaine	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.		Topical Aneasthetics
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., China		Virus titer: 2.7 x 1012 viral genomes (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., China		Virus titer: 4.5 x 1012 viral genomes (vg)/mL
Betadine	Healthy medical company	001651	Topical Antiseptics
Corneal scelar forceps (toothed)	Mingren Eye Instruments, China	MR-F301A	For eyelid secure during intravitreal injection
Dumont 05# forceps	FST	51-AGT5385	For optic nerve crush
Graphpad prism	GraphPad Prism, USA		Graph drawing and statistical analysis
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany		"IR" and "FA" mode for CSLO imaging
Image J/Fiji	National Institutes of Health, USA		Image processing
Maxitrol antibiotic ointment	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	Topical antibiotics
Microliter Syringe	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	For intravitreal injection
Mydrin-P Ophthalmic solution	Santen Pharmaceutical Co.,Ltd, Japan		Pupil dilation
Ophthalmic surgical microscope	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M220	For surgical operations
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		Image alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Germany		Topical lubricant