通过共聚焦扫描激光检眼镜对具有定制腺相关病毒血清型的视网膜细胞进行纵向体内成像

摘要

该协议描述了使用腺相关病毒 （AAV） 载体进行细胞特异性标记和使用共聚焦扫描激光检眼镜 （CSLO） 进行体内 成像。该方法能够研究不同的视网膜细胞类型及其对视网膜功能和疾病的贡献。

摘要

视网膜细胞过程的动态性质需要基因递送和实时监测技术的进步，以增强对眼部疾病的理解和治疗。本研究介绍了一种优化的腺相关病毒 （AAV） 方法，利用特异性血清型和启动子在靶向视网膜细胞（包括视网膜神经节细胞 （RGC） 和 Müller 胶质细胞）中实现最佳转染效率。利用共聚焦扫描激光检眼镜 （CSLO） 的精度，这项工作提出了一种非侵入性 体内 成像方法，可捕获 AAV 介导的绿色荧光蛋白 （GFP） 的纵向表达。这种方法消除了对终端程序的需求，保持了观察的连续性和受试者的健康状况。此外，在 AAV 感染的 RGC 中，GFP 信号可以沿着视觉通路追踪到上丘 （SC） 和外侧膝状核 （LGN），从而有可能进行直接视觉通路映射。这些发现提供了详细的方案，并展示了这一强大工具在实时研究视网膜细胞行为、疾病发病机制和基因治疗干预疗效方面的应用，为了解活体视网膜及其连接提供了有价值的见解。

引言

视网膜是中枢神经系统唯一可触及的光学部分，是神经科学研究的宝贵模型¹。视网膜神经节细胞 （RGC） 是视网膜向大脑传递视觉信息的输出神经元，在视觉功能中起着至关重要的作用。他们的丧失或功能障碍会导致视力障碍和不可逆的失明，如青光眼和其他视神经病变所见²。Müller 胶质细胞是视网膜中的主要神经胶质细胞，对于维持视网膜稳态、为神经元提供结构和代谢支持、调节神经递质水平以及促进视网膜修复和再生至关重要³。它们的功能障碍与各种视网膜疾病有关，包括糖尿病视网膜病变⁴ （diabetic retinopathy）、年龄相关性黄斑变性⁵ （age-related macular degeneration） 和眼缺血综合征⁶ （ocular ischemic syndrome）。RGC 和 Müller 胶质细胞表现出密切的相互作用和相互依存性;Müller 神经胶质细胞为 RGC 提供必要的支持，而 RGC 活性可以影响 Müller 神经胶质细胞的功能 ^3,7。研究 RGC 和 Müller 胶质细胞对于了解视网膜功能和开发多种视网膜疾病的有效治疗方法至关重要。

目前视网膜研究的评估主要利用光学相干断层扫描 （OCT） 等技术来测量视网膜神经纤维层的厚度或轴突束的轨迹 ^8,9。虽然这些方法对于检测 RGC 丢失非常有价值，但由于分辨率有限，它们无法提供 RGC 形态和神经胶质细胞的详细视图。同样，尽管自适应光学扫描激光检眼镜 （AO-SLO） 等先进技术能够对活体人类视网膜中的 RGC、光感受器和神经胶质细胞进行细胞水平成像¹⁰，但它们的技术复杂性和有限的可及性使其主要局限于专门的研究环境。鉴于这些限制，持续需要开发更可及和可靠的方法来深入研究体内特定的视网膜细胞群。

因此，该协议旨在引入一种适用于视网膜细胞研究应用的替代成像方法。它结合了 AAV 介导的细胞类型特异性标记的力量和 CSLO 成像的非侵入性。腺相关病毒 （AAV） 是一种多功能基因递送载体，以其低免疫原性和转导多种细胞类型（包括分裂细胞和非分裂细胞）的能力而闻名¹¹。这使它们成为在复杂视网膜环境中靶向特定细胞群的理想工具。通过使用具有精心选择的血清型和启动子的 AAV 载体，可以在多种目标细胞类型（如 RGC 和 Müller 神经胶质细胞）中实现荧光蛋白的选择性表达。例如，AAV2 以其在 RGC 中的较高转导效率而闻名^12,13，而 AAV8 在靶向光感受器¹⁴ 方面非常有效，AAV9 在 Müller 神经胶质细胞¹⁵ 中表现出强大的转染能力，在各个视网膜细胞层中表现出广泛的转染效率。需要注意的是，AAV 的有效性不仅取决于血清型的选择，还取决于启动子，启动子决定了转基因表达的强度和细胞特异性，强调了仔细选择以实现最佳转导的重要性。

对于 RGC 标记，该方案使用带有人突触蛋白 （hSyn） 启动子的 AAV2。AAV2 在玻璃体内注射后表现出 RGC 的高效转导¹³，而 hSyn 启动子（一种普遍存在的神经元启动子）驱动这些细胞内强烈而特异性的转基因表达¹⁶。对于 Müller 神经胶质细胞，该方案利用由 GfaABC1D 启动子¹⁷ 驱动的 AAV9 载体，该载体在这些细胞中表现出很强的转基因表达¹⁵。这种靶向标记方法使研究人员能够将这些细胞与周围的视网膜组织区分开来，并随着时间的推移跟踪它们，为视网膜细胞的 体内 监测及其对生物环境变化的反应提供了基础。

共聚焦扫描激光检眼镜 （CSLO） 是一种非侵入性成像技术，可提供活体视网膜的高分辨率图像，从而能够实时可视化荧光标记的视网膜细胞群 18,19,20。聚焦激光束扫描整个视网膜，捕获通过针孔发射的光，以消除失焦信号，从而获得更清晰的图像和增强的对比度。该方案利用了 Heidelberg Spectralis CSLO 系统，该系统已广泛用于活体动物的视网膜细胞成像，包括可视化转基因标记的 RGC^21,22 和小胶质细胞²³ 的研究。通过使用带有 488 nm 激光和适当滤光片的 HRA CSLO 装置，研究人员可以在玻璃体内注射携带荧光报告基因的 AAV 载体后，对活体动物中荧光标记的 RGC 或 Müller 胶质细胞进行成像。纵向成像方案每周一次，涵盖中央和周边视网膜，跟踪随时间的变化。为了优先考虑动物福利，该方案利用了 HRA CSLO 装置的自动眼动追踪系统 （ART），无需全身麻醉或隐形眼镜即可实现精确的图像采集。

该协议利用 AAV 和 CSLO 的综合力量来实现体内特定视网膜 细胞类型的纵向监测。通过将 AAV 介导标记的细胞类型特异性与 CSLO 的非侵入性、高分辨率成像能力相结合，该方法使研究人员能够研究 RGC 和 Müller 胶质细胞对各种刺激或干预的动态变化。这些见解对于为视网膜疾病的新诊断和治疗策略的开发提供信息具有重要潜力。

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研究方案

所有实验均按照 ARVO 关于动物在眼科和视觉研究中的使用声明进行，并得到北京首都医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。4 周龄成年雄性 C57BL/6J 小鼠 （体重在 15-20 g 之间） 用于所有实验，并饲养在温度受控的房间中，光照/黑暗循环为 12/12 小时。可 随意获得标准的啮齿动物食物和水。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. AAV 介导的视网膜细胞转染

注意：对于 RGC 的靶向转导，该方案使用 AAV2-hSyn-eGFP，它结合了 hSyn 启动子来驱动增强型 GFP 的稳健表达。Müller 胶质细胞使用 AAV9-GfaABC1D-eGFP 靶向。为了实现最佳的转导效率和稳健的转基因表达，建议小鼠玻璃体内注射的最低 AAV 滴度为 1 x 10¹² 个病毒基因组 （vg）/^mL13。

1. 在进行 AAV 介导的视网膜细胞转染程序时，请遵守严格的安全方案，以防止意外暴露并确保安全的工作环境。
2. 在经过认证的生物安全柜 （BSC） 中执行涉及病毒载体的所有程序。在整个手术过程中，为人员配备适当的个人防护设备 （PPE），包括实验室外套、手套和护目镜。
3. 根据机构安全规程妥善处理所有尖锐物品和生物危害材料，以保持合规性并保护所有实验室人员。

2. 病毒载体和动物的制备

1. 获得储存在 -80 °C 的 AAV2-hSyn-eGFP 或 AAV9-GfaABC1D-eGFP 载体。 使用前立即在冰上解冻载体，以保持病毒完整性。
2. 通过腹膜内注射剂量为 50 mg/kg 的戊巴比妥钠麻醉小鼠。在进一步行动之前，通过测试后足反射来确认麻醉深度。
3. 修剪胡须以防止在手术过程中干扰手术区域。用 20% 聚维酮碘溶液对眼眶消毒 2 秒，然后用无菌生理盐水彻底冲洗。
4. 局部滴入 0.5% 的丙丙卡因滴剂，以尽量减少不适并防止不自主的眼球运动。

3. 病毒载体的处理和玻璃体内注射

1. 将 1 μL 选定的 AAV 溶液（AAV2-hSyn-eGFP 或 AAV9-GfaABC1D-eGFP）转移到一块干净的预冷石蜡膜中，以避免可能影响病毒活性的温度波动。
2. 在眼科手术显微镜下，使用带有 33 G 斜面针头的 Hamilton 玻璃注射器吸出 AAV 溶液。
3. 将小鼠置于显微镜下的腹侧卧位。稍微倾斜头部以抬高用于注射的眼侧。调整和优化显微镜的放大倍率，以清楚地识别小鼠眼眶的上部区域。
4. 将针头插入眼睛巩膜上缘的角膜缘后 1-2 毫米处，插入玻璃体腔。缓慢注入 AAV 溶液，以避免回流或压力引起的损伤。
   注意：注射部位位置：在眼上颞象限进行注射，距角膜缘后方约 1 毫米。选择此位置可避开主要血管并最大限度地降低晶状体损伤的风险。避免注射部位太靠近角膜缘，以防止虹膜穿透或晶状体磨损。避免脉管系统：注射前使用手术显微镜仔细检查计划的注射部位是否有可见血管。如果存在船只，请稍微调整入口点以避开它们。以平行于虹膜的浅角度插入针头，以进一步降低血管损伤的风险。避免在同一区域重复注射，以降低视网膜下出血的风险。
5. 将针头保持在原位 30 秒，让载体在玻璃体腔内分散并沉淀在视网膜表面，从而最大限度地提高成功转导的机会。
6. 缓慢抽出针头，以尽量减少玻璃体回流的风险。
7. 注射后立即将局部抗生素软膏涂抹在注射部位。确保药膏均匀涂抹以完全覆盖眼表，防止眼部感染和炎症。
   注意：抗生素软膏含有 1 mg/g 地塞米松、3500 IU/g 硫酸新霉素和 6000 IU/g 硫酸多粘菌素 B。
8. 将鼠标放在加热垫上，以在麻醉恢复期间保持体温，并密切监测它们是否有任何痛苦或异常的迹象。一旦完全康复并且没有并发症，就将它们放回笼子里，获得正常的食物和水。

4. 使用 CSLO 进行 体内 成像

1. 动物准备
   1. 选择玻璃体内注射 4 周后感染 AAV2-hSyn-eGFP 或 AAV9-GfaABC1D-eGFP 的小鼠。将一滴含有 0.5% 托吡卡胺和 0.5% 去氧肾上腺素的眼液涂抹在眼表，使瞳孔扩大至直径约 2 毫米²²。
      注意：建议至少 4 周的 AAV 转导时间间隔，以实现玻璃体内注射后的最佳视网膜细胞荧光标记¹³。此外，在我们的视神经挤压 （ONC） 实验中，在感染后 4 周以及挤压伤后第 7 天和第 14 天对视网膜进行成像。选择这些时间点是为了捕捉初始 AAV 表达和 ONC 后视网膜变化的进展。
   2. 用一块干净的垫子盖住成像平台，以避免作过程中可能污染的动物粪便。
      注意：定制的成像平台为动物提供了充足的俯卧空间，确保稳定性并最大限度地减少手动约束期间的移动，以实现最佳图像采集。
   3. 小心地将鼠标转移到成像平台上，并在成像前留出 2-5 分钟的适应期，以最大限度地减少压力并促进适应成像环境。
   4. 在第二名技术人员的协助下，轻轻地约束动物，同时在整个过程中保持清醒状态。成像 15 秒后提供 10 秒的休息间隔，以允许眨眼并保持角膜水分。
      注意：轻轻擦洗头皮皮肤，诱导眼睑自发提拉，避免使用强行眼睑约束装置或夹子等附加装置，从而降低眼睛受伤的风险。全身麻醉不用于在长时间成像期间保持光学清晰度，因为它有可能加剧短暂的晶状体混浊。在整个过程中平衡高质量的图像采集与动物的舒适度和安全性。在 5 分钟内完成整个过程，以确保动物健康并保持成像质量。
   5. 通过微调聚焦旋钮（图 1B）和显微作器（图 1C）来调整头部姿势并对齐相机镜头，以瞄准感兴趣的区域 （ROI） 以进行后续 的体内 成像。
2. 系统配置
   1. 在相机上安装非接触式 55° 广角镜头以扩大眼底区域的视野。
   2. 将滤光片轮设置到位置 A （血管造影）以启用红外 （IR） 和荧光血管造影 （FA） 成像模式的采集（图 1A）。打开激光器和电源以激活 CSLO 成像系统。
   3. 打开软件 Heidelberg Eye Explorer ，然后单击菜单栏顶部的 New Patient 图标创建新检查。在弹出窗口中输入相关的动物信息并接受 7.7 毫米的默认角膜曲率。
   4. 选择控制面板屏幕上的黄色 开始 按钮（图 1E）以启动实时成像模式。
3. 体内 CSLO 成像
   1. 在控制面板上选择具有 820 nm 激发波长自发荧光的 IR 模式（图 1G）。为了实现高分辨率成像， 高分辨率。 （HR） 模式通过窗口界面或手动控制面板激活（图 1F）。
      注意：红外反射 （IR） 成像通常是 CLSO 眼科成像的第一步，在荧光素血管造影 （FA） 之前采集，以提供基线视图。均匀的照明、最小的伪影和对主要视网膜血管的清晰聚焦对于 z 平面聚焦的可靠性和获得高质量 IR 图像至关重要。
   2. 使用带有 XYZ 显微纵器的纵杆将镜头移向鼠标眼进行微调。检查光学透明度并逆时针转动灵敏度旋钮（图 1D），将眼底图像的亮度降低到 40%-60%，从而避免眼底过度曝光并增强视网膜细节的可视化。
   3. 调整聚焦旋钮和显微作器，直到在眼底上明确识别视盘和视网膜血管。
      注意：最佳焦平面的标准：（1） 均匀照明的眼底视图，没有暗角。（2） 视盘周围有均匀的照明，没有焦点黑点或失真。（3） 视网膜大血管的管腔形状清晰，血流运动可见。
   4. 切换到 FA 模式（图 1H），激发波长为 488 nm 的固态蓝色激光器和 500 nm 的屏障滤光片。顺时针转动灵敏度旋钮（图 1D），将眼底图像的亮度增加到 50%-107%，以照亮目标视网膜区域。
   5. 将 ART 平均值（软件界面左下角的蓝色条）设置为至少 15 以提高信噪比。此功能对在同一位置采集的一系列 B 扫描进行平均，从而提高图像质量。
      注意：虽然较高的 ART 平均值通常会通过平均来提高图像质量，但它也会延长扫描持续时间。这种延长的持续时间可能会增加角膜脱水和动物疲劳的风险，这些因素需要仔细考虑，尤其是在清醒的动物成像中。
   6. 重新对齐到视网膜的内平面，专门针对表达 GFP 的 RGC 或 Müller 神经胶质细胞。进行微调以确保对所需细胞群（如 RGC 胞体和轴突）或 Müller 细胞体的清晰照明。成像灵敏度是平衡的，以实现最佳可视化并防止 GFP 阳性细胞过度饱和。
      注意：为了获得具有可比 GFP 信号清晰度和亮度的图像，实验中所有小鼠的灵敏度采集应保持恒定。
   7. 按下灵敏度旋钮（图 1D）启动 ART 模式，该模式在线生成实时平均图像。等到软件界面左下角的蓝色条（代表 ART 平均值）达到设定的 ART 值（≥ 20 帧），然后点击控制界面上的“获取”按钮以捕获眼底图像。
      注意：对于 ART 模式，在 体内 成像过程中，集成了眼动追踪以自动补偿微小的眼球运动，从而在选定的视网膜焦平面上实现一致聚焦。
   8. 获取所需图像后，按下触摸面板上的 灵敏度 旋钮退出 ART 模式。
      注意：为了防止角膜干燥并允许自发性眨眼，在成像过程中每 10 秒实施 15 秒的休息。
   9. 要导航鼻部和颞部视网膜区域，请在观察屏幕上的实时图像的同时水平移动摄像头。到达目标区域后，微调焦点并按照步骤 2.3.1-2.3.8 中的说明开始成像过程。
      注意：保持缓慢和受控的相机移动，同时确保眼底的一致和明亮照明。如果出现暗区，请使用显微作器垂直调整相机位置并重新居中视网膜。
   10. 要对上视网膜进行成像，请轻轻地将鼠标头部姿势调整到正面朝上的位置。适度向上倾斜摄像头以与视网膜上部区域对齐。根据需要重新调整焦距并继续成像。
   11. 成像完成后，所有需要的视网膜区域退出采集窗口，图像会自动保存。在成像的眼睛上涂抹局部润滑剂以保持角膜水合作用。
   12. 要开始检查对侧眼，请将动物重新定位到平台的另一侧，然后重复步骤 2.3.1-2.3.11。

5. 图像处理和分析

1. 图像导出和准备
   1. 打开 Heidelberg Eye Explorer 软件并选择所需的高质量 CSLO 成像会话。选择同一视网膜位置的单个或连续图像，并随着时间的推移保持一致的灵敏度设置。
   2. 排除焦点或角膜清晰度差的模糊图像，确保仅使用视网膜结构清晰可视化的图像进行分析。以 TIFF 格式导出这些图像以供进一步处理。
2. 图像对齐和裁剪
   1. 根据相同的视网膜区域对每只小鼠眼睛的图像进行分组。
      注意：从 CSLO 系统获取的原始图像以下列格式保存：TIFF，尺寸为 1536 x 1536 像素，分辨率为 5.69 um/像素，ART 值为 ≥15。
   2. 对于后续检查，请将图像导入合适的图像处理软件。根据需要旋转和对齐图像以匹配基线图像的方向。在存储或导出已处理的图像时，请使用保持尽可能高图像质量的设置，以最大程度地减少潜在的压缩伪影。
   3. 使用脉管系统和视盘作为地标，通过旋转来自同一只眼睛的时间序列的 CSLO 图像以匹配相应的基线图像来对齐它们。
      注意：仔细检查每个对齐的图像，在继续裁剪之前，确保它们符合以下标准：（1） 完整的视网膜区域捕获：图像必须完全包含预期的感兴趣视网膜区域，包括视盘和主要血管等关键标志;（2） 无运动伪影：图像在成像过程中应没有因眼球运动而引起的模糊、条纹或结构重复;（3） 最小的失真：图像应准确表示视网膜结构，而不会因成像角度或镜头效果而出现翘曲、拉伸或压缩伪影。（4） 图像质量指标的平衡：背景噪声水平的评估（无结构区域中像素强度的标准差< 5（0-255 等级））;信噪比 （SNR >20）、照明一致性（六个图像象限之间的变异系数 <10%） 和图像均匀性（均匀区域的变异系数 <15%）。
   4. 选择旋转后的图像并将其导出为 TIFF 格式。对于每个时间点，使用裁剪工具从质量认可的图像中随机选择并裁剪 5-10 个包含 GFP 阳性细胞的区域（每个 300 x 300 像素）。以 TIFF 格式单独导出每个裁剪的图像以供进一步分析。
3. 荧光强度测量
   1. 在 ImageJ/Fiji 中打开裁剪后的 CSLO 图像（8 位灰度，300 x 300 像素）。
   2. 要检查荧光信号的整体变化，请使用 Analyze > Measure （或 Ctrl + M）测量每个裁剪图像的总荧光强度。记录 “平均值” 值，表示整个裁剪图像的平均 GFP 荧光强度。
4. RGC 定量
   1. 在 ImageJ/Fiji 中，使用 Image > Adjust > Brightness/Contrast 调整裁剪的 CSLO 图像的强度阈值，以实现黑色背景下单个白色胞体的最佳可视化。
      注意：在查看一批裁剪图像后确定个性化阈值，或应用一致的阈值算法（例如，ImageJ/Fiji 中 Huang 的方法⁵ ）。对于 Huang 的方法：（1） 将图像转换为 8 位灰度（图像>类型 > 8 位）。（2） 访问阈值工具（图像 > 调整阈值>）。（3） 选择 Huang 作为阈值方法。（4） 预览分段，然后单击 Apply。阈值将自动计算并显示在图像直方图上。
   2. 激活 Cell Counter 插件并单击每个 GFP 阳性 RGC 胞体进行计数。记录在分析区域中标记的单元格总数。对每个后续时间点的所有裁剪图像重复此过程。
5. 数据分析
   1. 将细胞计数和荧光强度数据导出到电子表格或统计软件（例如 GraphPad Prism）。
   2. 根据相应的实验设计和假设执行适当的统计检验。解释结果并得出结论。

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结果

按照提出的方案，使用 AAV 介导的基因递送和 CSLO 的组合在体内成功观察和跟踪不同的视网膜细胞。AAV2-hSyn-eGFP 有效地转导了 RGC，导致整个视网膜的 eGFP 表达强劲，这通过 CSLO 和与 RGC 特异性标志物共定位证实，即具有多重剪接的 RNA 结合蛋白 （RBPMS），特别是在神经节细胞层中发现（图 2 和图 3）。该方案还证实了使用...

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讨论

所提出的协议详细介绍了一种强大且可访问的方法，用于对特定视网膜细胞群进行 体内 监测，利用 AAV 介导的基因递送和 CSLO 成像的力量。与传统方法相比，这种方法具有多项优势，有助于纵向研究视网膜细胞动力学及其在生理或病理条件下对损伤或疾病的反应。

这种方法的成功取决于几个关键步骤。首先，实现最佳的 AAV 转导效率对于荧光?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 Gauge Needle	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	For intravitreal injection
0.5% proparacaine	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.		Topical Aneasthetics
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., China		Virus titer: 2.7 x 1012 viral genomes (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., China		Virus titer: 4.5 x 1012 viral genomes (vg)/mL
Betadine	Healthy medical company	001651	Topical Antiseptics
Corneal scelar forceps (toothed)	Mingren Eye Instruments, China	MR-F301A	For eyelid secure during intravitreal injection
Dumont 05# forceps	FST	51-AGT5385	For optic nerve crush
Graphpad prism	GraphPad Prism, USA		Graph drawing and statistical analysis
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany		"IR" and "FA" mode for CSLO imaging
Image J/Fiji	National Institutes of Health, USA		Image processing
Maxitrol antibiotic ointment	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	Topical antibiotics
Microliter Syringe	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	For intravitreal injection
Mydrin-P Ophthalmic solution	Santen Pharmaceutical Co.,Ltd, Japan		Pupil dilation
Ophthalmic surgical microscope	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M220	For surgical operations
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		Image alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Germany		Topical lubricant