Imaging longitudinale in vivo di cellule retiniche con sierotipi virali adeno-associati su misura tramite oftalmoscopia laser a scansione confocale

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso di vettori di virus adeno-associati (AAV) per la marcatura cellulare specifica e l'imaging in vivo utilizzando un oftalmoscopio laser a scansione confocale (CSLO). Questo metodo consente lo studio di diversi tipi di cellule retiniche e del loro contributo alla funzione e alla malattia retinica.

Abstract

La natura dinamica dei processi cellulari retinici richiede progressi nella consegna genica e nelle tecniche di monitoraggio in tempo reale per migliorare la comprensione e il trattamento delle malattie oculari. Questo studio introduce un approccio ottimizzato al virus adeno-associato (AAV), utilizzando sierotipi e promotori specifici per ottenere un'efficienza di trasfezione ottimale nelle cellule retiniche bersaglio, comprese le cellule gangliari retiniche (RGC) e la glia di Müller. Sfruttando la precisione dell'oftalmoscopia laser a scansione confocale (CSLO), questo lavoro presenta un metodo non invasivo per l'imaging in vivo che cattura l'espressione longitudinale della proteina fluorescente verde (GFP) mediata da AAV. Questo approccio elimina la necessità di procedure terminali, preservando la continuità dell'osservazione e il benessere del soggetto. Inoltre, il segnale GFP può essere rintracciato nelle RGC infettate da AAV lungo la via visiva verso il collicolo superiore (SC) e il nucleo genicolato laterale (LGN), consentendo il potenziale per la mappatura diretta della via visiva. Questi risultati forniscono un protocollo dettagliato e dimostrano l'applicazione di questo potente strumento per studi in tempo reale sul comportamento delle cellule retiniche, sulla patogenesi della malattia e sull'efficacia degli interventi di terapia genica, offrendo preziose informazioni sulla retina vivente e sulle sue connessioni.

Introduzione

Essendo l'unica parte otticamente accessibile del sistema nervoso centrale, la retina funge da modello prezioso per la ricerca neuroscientifica¹. Le cellule gangliari retiniche (RGC), i neuroni di uscita della retina che trasmettono le informazioni visive al cervello, svolgono un ruolo cruciale nella funzione visiva. La loro perdita o disfunzione porta a compromissione della vista e cecità irreversibile, come si vede nel glaucoma e in altre neuropatie ottiche². La glia di Müller, le principali cellule gliali della retina, è essenziale per mantenere l'omeostasi retinica, fornire supporto strutturale e metabolico ai neuroni, regolare i livelli di neurotrasmettitori e contribuire alla riparazione e alla rigenerazione retinica³. La loro disfunzione è implicata in varie malattie della retina, tra cui la retinopatia diabetica⁴, la degenerazione maculare legata all'età⁵ e la sindrome ischemica oculare⁶. Le RGC e la glia di Müller mostrano strette interazioni e interdipendenza; La glia di Müller fornisce un supporto essenziale alle RGC, mentre l'attività delle RGC può influenzare la funzione della glia di Müller ^3,7. Lo studio sia delle RGC che della glia di Müller è fondamentale per comprendere la funzione retinica e sviluppare trattamenti efficaci per molteplici malattie retiniche.

Le attuali valutazioni nella ricerca retinica utilizzano principalmente tecniche come la tomografia a coerenza ottica (OCT) per misurare lo spessore dello strato di fibre nervose retiniche o le traiettorie dei fasci di assoni ^8,9. Sebbene questi metodi siano preziosi per rilevare la perdita di RGC, non forniscono una visione dettagliata della morfologia RGC e delle cellule gliali a causa della risoluzione limitata. Allo stesso modo, sebbene tecniche avanzate come l'oftalmoscopia laser a scansione ottica adattiva (AO-SLO) consentano l'imaging a livello cellulare di RGC, fotorecettori e cellule gliali nella retina umana vivente¹⁰, la loro complessità tecnica e la limitata accessibilità ne limitano l'uso principalmente a contesti di ricerca specializzati. Dati questi vincoli, vi è la continua necessità di sviluppare metodi più accessibili e affidabili per lo studio approfondito di specifiche popolazioni di cellule retiniche in vivo.

Di conseguenza, questo protocollo mira a introdurre un approccio di imaging alternativo adatto per applicazioni di ricerca nelle cellule retiniche. Combina la potenza della marcatura specifica del tipo di cellula mediata da AAV con la natura non invasiva dell'imaging CSLO. I virus adeno-associati (AAV) sono vettori di consegna genica versatili noti per la loro bassa immunogenicità e capacità di trasdurre un'ampia gamma di tipi di cellule, comprese le cellule in divisione e non in divisione¹¹. Questo li rende strumenti ideali per indirizzare specifiche popolazioni cellulari all'interno del complesso ambiente retinico. Utilizzando vettori AAV con sierotipi e promotori accuratamente selezionati, è possibile ottenere l'espressione selettiva di proteine fluorescenti in diversi tipi cellulari di interesse, come le RGC e la glia di Müller. Ad esempio, AAV2 è noto per la sua maggiore efficienza di trasduzione nelle RGC^12,13, mentre AAV8 è marcatamente efficace nel colpire i fotorecettori¹⁴ e AAV9 dimostra forti capacità di trasfezione nella glia di Müller¹⁵, mostrando un'ampia efficienza in vari strati cellulari della retina. È importante notare che l'efficacia dell'AAV si basa non solo sulla scelta del sierotipo, ma anche sui promotori, che dettano l'intensità e la specificità cellulare dell'espressione del transgene, sottolineando l'importanza di un'attenta selezione per ottenere una trasduzione ottimale.

Per la marcatura RGC, questo protocollo impiega AAV2 con il promotore della sinapsina umana (hSyn). AAV2 mostra un'efficiente trasduzione delle RGC dopo l'iniezione intravitreale¹³ e il promotore hSyn, un promotore neuronale ubiquitario, guida un'espressione transgenica forte e specifica all'interno di queste cellule¹⁶. Per la glia di Müller, il protocollo utilizza vettori AAV9 guidati dal promotore¹⁷ di GfaABC1D, che dimostra una forte espressione transgenica in queste cellule¹⁵. Questo approccio di etichettatura mirata consente ai ricercatori di distinguere queste cellule dal tessuto retinico circostante e di tracciarle nel tempo, fornendo una base per la sorveglianza in vivo delle cellule retiniche e delle loro risposte ai cambiamenti bioambientali.

L'oftalmoscopia laser a scansione confocale (CSLO) è una tecnica di imaging non invasiva che fornisce immagini ad alta risoluzione della retina vivente, consentendo la visualizzazione in tempo reale di popolazioni di cellule retiniche marcate in fluorescenza 18,19,20. Un raggio laser focalizzato esegue la scansione della retina, catturando la luce emessa che passa attraverso un foro stenopeico per eliminare i segnali sfocati, ottenendo immagini più nitide con un contrasto migliorato. Questo protocollo utilizza un sistema Heidelberg Spectralis CSLO, che è stato ampiamente utilizzato per l'imaging delle cellule retiniche in animali vivi, compresi gli studi che visualizzano RGC^21,22 e microglia²³ marcati con transgenici. Utilizzando l'unità HRA CSLO con un laser a 488 nm e filtri appropriati, i ricercatori possono visualizzare RGC marcati in fluorescenza o glia di Müller in animali vivi dopo l'iniezione intravitreale di vettori AAV portatori di geni reporter fluorescenti. Il protocollo di imaging longitudinale, con sessioni settimanali che coprono sia la retina centrale che quella periferica, tiene traccia dei cambiamenti nel tempo. Per dare priorità al benessere degli animali, il protocollo utilizza il sistema di tracciamento oculare automatico (ART) dell'unità HRA CSLO, che consente un'acquisizione precisa delle immagini senza la necessità di anestesia generale o lenti a contatto.

Questo protocollo sfrutta la potenza combinata di AAV e CSLO per consentire il monitoraggio longitudinale di specifici tipi di cellule retiniche in vivo. Abbinando la specificità del tipo cellulare della marcatura mediata da AAV con le capacità di imaging non invasive e ad alta risoluzione di CSLO, questo metodo consente ai ricercatori di studiare i cambiamenti dinamici nelle RGC e nella glia di Müller in risposta a vari stimoli o interventi. Queste intuizioni hanno un potenziale significativo per informare lo sviluppo di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche per le malattie della retina.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Capital Medical University di Pechino. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6J di quattro settimane (di peso compreso tra 15 e 20 g) e alloggiati in stanze a temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12/12 ore. Il cibo e l'acqua standard per roditori erano disponibili ad libitum. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Trasfezione di cellule retiniche mediata da AAV

NOTA: Per la trasduzione mirata delle RGC, questo protocollo utilizza AAV2-hSyn-eGFP, che incorpora il promotore hSyn per guidare l'espressione robusta della GFP potenziata. La glia di Müller è mirata utilizzando AAV9-GfaABC1D-eGFP. Per ottenere un'efficienza di trasduzione ottimale e una robusta espressione transgenica, si raccomanda un titolo AAV minimo di 1 x 10¹² genomi virali (vg)/mL per le iniezioni intravitreali nei topi¹³.

1. Aderire a rigorosi protocolli di sicurezza durante l'esecuzione di procedure di trasfezione di cellule retiniche mediate da AAV per prevenire l'esposizione accidentale e garantire un ambiente di lavoro sicuro.
2. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono vettori virali all'interno di una cabina di biosicurezza (BSC) certificata. Dotare il personale di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), inclusi camici da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi, per tutta la durata della procedura.
3. Smaltire correttamente tutti i materiali taglienti e a rischio biologico in conformità con i protocolli di sicurezza istituzionali per mantenere la conformità e salvaguardare tutto il personale di laboratorio.

2. Preparazione di vettori virali e animali

1. Ottenere i vettori AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP conservati a -80 °C. Scongelare i vettori sul ghiaccio immediatamente prima dell'uso per preservarne l'integrità virale.
2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico alla dose di 50 mg/kg. Confermare la profondità dell'anestesia testando i riflessi del piede posteriore prima di ulteriori azioni.
3. Taglia i baffi per evitare interferenze con l'area chirurgica durante la procedura. Disinfettare l'orbita con una soluzione di iodio povidone al 20% per 2 s, quindi risciacquare abbondantemente con soluzione fisiologica sterile.
4. Applicare una goccia di proparacaina allo 0,5% per via topica per ridurre al minimo il disagio e prevenire movimenti oculari involontari.

3. Manipolazione e iniezione intravitreale di vettori virali

1. Trasferire 1 μL della soluzione AAV selezionata (AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP) in un pezzo di pellicola di paraffina pulita e preraffreddata per evitare fluttuazioni di temperatura che potrebbero influenzare l'attività virale.
2. Aspirare la soluzione di AAV utilizzando una siringa di vetro Hamilton con ago smussato da 33 G sotto il microscopio chirurgico oftalmico.
3. Posizionare il topo in decubito ventrale sotto il microscopio. Inclinare leggermente la testa per sollevare il lato oculare destinato all'iniezione. Regola e ottimizza l'ingrandimento del microscopio per identificare chiaramente la regione superiore dell'orbita del topo.
4. Inserire l'ago 1-2 mm posteriormente al limbus al margine sclerale superiore dell'occhio nella cavità vitreale. Iniettare lentamente le soluzioni AAV per evitare il riflusso o danni indotti dalla pressione.
   NOTA: Posizione del sito di iniezione: Eseguire l'iniezione nel quadrante temporale superiore dell'occhio, circa 1 mm posteriormente al limbus. Scegliere questa posizione per evitare i principali vasi sanguigni e ridurre al minimo il rischio di danni alle lenti. Evitare i siti di iniezione troppo vicini al limbus per prevenire la penetrazione dell'iride o l'abrasione del cristallino. Evitare la vascolarizzazione: utilizzare un microscopio operatorio per esaminare attentamente il sito di iniezione pianificato per i vasi sanguigni visibili prima dell'iniezione. Se sono presenti imbarcazioni, regolare leggermente il punto di ingresso per evitarle. Inserire l'ago con un angolo poco profondo, parallelo all'iride, per ridurre ulteriormente il rischio di danni vascolari. Evitare iniezioni ripetute nella stessa area per ridurre il rischio di emorragia sottoretinica.
5. Tenere l'ago in posizione per 30 secondi per consentire ai vettori di disperdersi all'interno della camera vitreale e depositarsi sulla superficie retinica, massimizzando così le possibilità di trasduzione riuscita.
6. Estrarre lentamente l'ago per ridurre al minimo il rischio di riflusso del vitreo.
7. Applicare un unguento antibiotico topico sul sito di iniezione subito dopo l'iniezione. Assicurarsi che l'unguento sia applicato in modo uniforme per coprire completamente la superficie oculare, prevenendo infezioni e infiammazioni oculari.
   NOTA: L'unguento antibiotico contiene 1 mg/g di desametasone, 3500 UI/g di neomicina solfato e 6000 UI/g di polimixina B solfato.
8. Posiziona il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea durante il recupero dall'anestesia e monitoralo attentamente per eventuali segni di angoscia o anomalie. Una volta che si sono completamente ripresi e non mostrano complicazioni, riportali nelle loro gabbie con accesso a cibo e acqua normali.

4. Imaging in vivo con CSLO

1. Preparazione degli animali
   1. Selezionare il topo infetto da AAV2-hSyn-eGFP o AAV9-GfaABC1D-eGFP dopo 4 settimane di iniezione intravitreale. Applicare una goccia di una soluzione oculare contenente lo 0,5% di tropicamide e lo 0,5% di fenilefrina sulla superficie dell'occhio per dilatare la pupilla a circa 2 mm di diametro²².
      NOTA: Si raccomanda un minimo di 4 settimane di intervallo di tempo di trasduzione dell'AAV per la marcatura fluorescente ottimale delle cellule retiniche dopo l'iniezione intravitreale¹³. Inoltre, nei nostri esperimenti di schiacciamento del nervo ottico (ONC), le retine sono state visualizzate a 4 settimane dopo l'infezione, nonché il giorno 7 e 14 dopo la lesione da schiacciamento. Questi punti temporali sono stati scelti per catturare sia l'espressione iniziale di AAV che la progressione dei cambiamenti retinici dopo ONC.
   2. Coprire la piattaforma di imaging con un pezzo del tampone di pulizia per evitare la possibile contaminazione di escrementi animali durante il processo operativo.
      NOTA: La piattaforma di imaging personalizzata offre ampio spazio per la pronazione dell'animale, garantendo stabilità e riducendo al minimo i movimenti durante il trattenimento manuale per un'acquisizione ottimale dell'immagine.
   3. Trasferire con cautela il mouse sulla piattaforma di imaging e attendere un periodo di acclimatazione di 2-5 minuti prima dell'imaging per ridurre al minimo lo stress e facilitare l'adattamento all'ambiente di imaging.
   4. Con l'assistenza di un secondo tecnico, trattenere delicatamente l'animale mantenendo uno stato di coscienza durante tutta la procedura. Fornire un intervallo di riposo di 10 s dopo 15 s di imaging per consentire l'ammiccamento degli occhi e mantenere l'umidità corneale.
      NOTA: Strofinare delicatamente la pelle del cuoio capelluto per indurre il sollevamento spontaneo delle palpebre, evitando l'uso di trattenute palpebrali forzate o dispositivi aggiuntivi come clip, riducendo così il rischio di lesioni agli occhi. L'anestesia generale non viene impiegata per preservare la chiarezza ottica durante sessioni di imaging prolungate, poiché ha il potenziale per esacerbare l'opacità transitoria della lente. Bilancia l'acquisizione di immagini di alta qualità con il comfort e la sicurezza degli animali durante tutta la procedura. Completa l'intera procedura entro 5 minuti per garantire il benessere dell'animale e mantenere la qualità dell'imaging.
   5. Regolare la postura della testa e allineare l'obiettivo della fotocamera regolando con precisione la manopola di messa a fuoco (Figura 1B) e il micromanipolatore (Figura 1C) per puntare la regione di interesse (ROI) per la successiva imaging in vivo .
2. Configurazione del sistema
   1. Collegare un obiettivo grandangolare da 55° senza contatto sulla fotocamera per espandere il campo visivo dell'area del fondo oculare.
   2. Impostare la ruota portafiltri in posizione A (angiografia) per abilitare l'acquisizione della modalità di imaging con angiografia a infrarossi (IR) e fluorescente (FA) (Figura 1A). Accendere il laser e l'alimentatore per attivare il sistema di imaging CSLO.
   3. Apri il software Heidelberg Eye Explorer e crea un nuovo esame facendo clic sull'icona Nuovo paziente nella parte superiore della barra dei menu. Inserisci le informazioni pertinenti sull'animale e accetta la curvatura corneale predefinita di 7,7 mm nella finestra pop-up.
   4. Selezionare il pulsante giallo di avvio (Figura 1E) sullo schermo del pannello di controllo per avviare la modalità di imaging dal vivo.
3. Imaging CSLO in vivo
   1. Selezionare la modalità IR (Figura 1G) con autofluorescenza a lunghezza d'onda di eccitazione di 820 nm sul pannello di controllo. Per ottenere immagini ad alta risoluzione, l'High Res. La modalità (HR) viene attivata tramite l'interfaccia della finestra o il pannello di controllo manuale (Figura 1F).
      NOTA: L'imaging a riflettanza infrarossa (IR) è in genere il primo passo dell'imaging oftalmico CLSO, acquisito prima dell'angiografia con fluoresceina (FA), per fornire una visione di base. Anche l'illuminazione, gli artefatti minimi e la messa a fuoco nitida sui principali vasi retinici sono fondamentali per l'affidabilità della messa a fuoco del piano z e il raggiungimento di immagini IR di alta qualità.
   2. Spostare l'obiettivo verso l'occhio del mouse utilizzando il joystick con il micromanipolatore XYZ per una regolazione fine. Esaminare la trasparenza ottica e ruotare la manopola della sensibilità (Figura 1D) in senso antiorario per ridurre la luminosità dell'immagine del fondo oculare al 40%-60%, evitando così la sovraesposizione del fondo oculare e migliorando la visualizzazione dei dettagli retinici.
   3. Regolare la manopola di messa a fuoco e il micromanipolatore fino a quando il disco ottico e i vasi retinici non sono identificati in modo univoco sul fondo oculare.
      NOTA: Criteri del piano focale ottimale: (1) Vista del fondo oculare illuminata in modo uniforme senza angoli scuri. (2) Illuminazione uniforme che circonda il disco ottico senza macchie scure focali o distorsioni. (3) Forma chiara del lume dei grandi vasi retinici con il movimento visibile del flusso sanguigno.
   4. Passa alla modalità FA (Figura 1H) con un laser blu a stato solido a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e un filtro barriera a 500 nm. Ruotare la manopola della sensibilità (Figura 1D) in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine del fondo oculare al 50%-107% per illuminare l'area retinica interessata.
   5. Impostare il valore medio ART (una barra blu in basso a sinistra dell'interfaccia software) su almeno 15 per migliorare il rapporto segnale/rumore. Questa funzione calcola la media di una serie di B-scan acquisiti nella stessa posizione, migliorando la qualità dell'immagine.
      NOTA: Sebbene un valore medio ART più elevato generalmente migliori la qualità dell'immagine attraverso la media, prolunga anche la durata della scansione. Questa durata prolungata potrebbe potenzialmente aumentare il rischio di disidratazione corneale e affaticamento degli animali, fattori che devono essere attentamente considerati, soprattutto nell'imaging degli animali da svegli.
   6. Riallinearsi al piano interno della retina, mirando in modo specifico alle RGC che esprimono GFP o alle cellule gliali di Müller. Vengono effettuate regolazioni di precisione per garantire un'illuminazione nitida della popolazione cellulare desiderata, come il soma RGC e gli assoni, o il corpo cellulare Müller. La sensibilità dell'imaging è bilanciata per ottenere una visualizzazione ottimale e prevenire la sovrasaturazione delle cellule GFP-positive.
      NOTA: Per ottenere le immagini con chiarezza e luminosità comparabili del segnale GFP, l'acquisizione della sensibilità dovrebbe essere costante per tutti i topi nell'esperimento.
   7. Premere la manopola della sensibilità (Figura 1D) per avviare la modalità ART, che genera un'immagine media in tempo reale online. Attendere che la barra blu (che rappresenta il valore medio ART) in basso a sinistra dell'interfaccia software abbia raggiunto il valore ART impostato (≥ 20 fotogrammi) e toccare il pulsante Acquisisci sull'interfaccia di controllo per acquisire le immagini del fondo oculare.
      NOTA: Per la modalità ART, l'eye-tracking è incorporato per compensare automaticamente i piccoli movimenti oculari durante l'imaging in vivo , consentendo una messa a fuoco costante sul piano focale retinico selezionato.
   8. Una volta acquisite le immagini desiderate, uscire dalla modalità ART premendo la manopola della sensibilità sul pannello touch.
      NOTA: Per prevenire l'essiccazione corneale e consentire l'ammiccamento spontaneo degli occhi, sono state implementate pause di 10 secondi ogni 15 secondi durante il processo di imaging.
   9. Per navigare tra le aree nasali e temporali della retina, muovere la testa della telecamera orizzontalmente mentre si osserva l'immagine dal vivo sullo schermo. Una volta raggiunta la regione di destinazione, regolare la messa a fuoco e avviare il processo di imaging come descritto nei passaggi 2.3.1-2.3.8.
      NOTA: Mantenere movimenti lenti e controllati della fotocamera garantendo un'illuminazione uniforme e brillante del fondo oculare. Se compaiono aree scure, utilizzare il micromanipolatore per regolare la posizione della telecamera verticalmente e ricentrare la retina.
   10. Per visualizzare la retina superiore, regolare delicatamente la postura della testa del mouse in una posizione a faccia in su. Inclinare moderatamente la testa della telecamera verso l'alto per allinearla con la regione retinica superiore. Regolare nuovamente la messa a fuoco secondo necessità e procedere con l'imaging.
   11. Al termine dell'imaging, tutte le regioni retiniche desiderate escono dalla finestra di acquisizione e le immagini vengono salvate automaticamente. Applicare un lubrificante topico sull'occhio dell'immagine per mantenere l'idratazione corneale.
   12. Per iniziare l'esame dell'occhio controlaterale, riposizionare l'animale sul lato opposto della piattaforma e ripetere i passaggi 2.3.1-2.3.11.

5. Elaborazione e analisi delle immagini

1. Esportazione e preparazione delle immagini
   1. Aprire il software Heidelberg Eye Explorer e selezionare la sessione di imaging CSLO desiderata con una buona qualità. Scegli immagini singole o consecutive della stessa posizione retinica con impostazioni di sensibilità coerenti nel tempo.
   2. Escludete le immagini sfocate con scarsa messa a fuoco o chiarezza corneale, assicurandovi che per l'analisi vengano utilizzate solo immagini con una chiara visualizzazione delle strutture retiniche. Esporta queste immagini in formato TIFF per un'ulteriore elaborazione.
2. Allineamento e ritaglio dell'immagine
   1. Raggruppa le immagini per occhio di topo in base alla stessa regione retinica.
      NOTA: Le immagini originali acquisite dal sistema CSLO vengono salvate nel seguente formato: TIFF, con una dimensione di 1536 x 1536 pixel, una risoluzione di 5,69 um/pixel e un valore ART di ≥15.
   2. Per gli esami di follow-up, importare le immagini in un software di elaborazione delle immagini adatto. Ruotare e allineare le immagini in base alle esigenze in modo che corrispondano all'orientamento dell'immagine di base. Quando salvate o esportate le immagini elaborate, utilizzate impostazioni che mantengano la massima qualità possibile dell'immagine per ridurre al minimo i potenziali artefatti di compressione.
   3. Allineare le immagini CSLO da una serie temporale dello stesso occhio ruotandole in modo che corrispondano alla rispettiva immagine di base utilizzando il sistema vascolare e il disco ottico come punti di riferimento.
      NOTA: Esamina attentamente ogni immagine allineata e, prima di procedere al ritaglio, assicurati che soddisfi i seguenti criteri: (1) Acquisizione completa della regione retinica: l'immagine deve comprendere completamente la regione retinica di interesse prevista, inclusi i punti di riferimento chiave come il disco ottico e i principali vasi sanguigni; (2) Assenza di artefatti da movimento: l'immagine deve essere priva di sfocature, striature o duplicazioni di strutture causate dal movimento degli occhi durante l'imaging; (3) Distorsione minima: l'immagine deve rappresentare accuratamente la struttura retinica senza deformazioni, stiramenti o artefatti di compressione che potrebbero derivare dagli angoli di imaging o dagli effetti dell'obiettivo. (4) Bilanciamento delle metriche di qualità dell'immagine: valutazioni dei livelli di rumore di fondo (deviazione standard delle intensità dei pixel in aree prive di struttura < 5 (scala 0-255)); rapporto segnale/rumore (SNR >20), coerenza dell'illuminazione (coefficiente di variazione tra sei quadranti dell'immagine <10%) e uniformità dell'immagine (coefficiente di variazione in regioni omogenee <15%).
   4. Seleziona l'immagine ruotata ed esportala in formato TIFF. Per ogni punto temporale, utilizzare lo strumento di ritaglio per selezionare e ritagliare in modo casuale 5-10 aree (300 x 300 pixel ciascuna) contenenti celle GFP positive dalle immagini di qualità approvata. Esporta ogni immagine ritagliata singolarmente in formato TIFF per ulteriori analisi.
3. Misurazione dell'intensità della fluorescenza
   1. Aprite le immagini CSLO ritagliate (scala di grigi a 8 bit, 300 x 300 pixel) in ImageJ/Fiji.
   2. Per esaminare le variazioni complessive dei segnali fluorescenti, misurare l'intensità totale della fluorescenza per immagine ritagliata utilizzando Analizza > Misura (o Ctrl + M). Registra il valore "Media", che rappresenta l'intensità media di fluorescenza GFP dell'intera immagine ritagliata.
4. Quantificazione RGC
   1. In ImageJ/Fiji, regolare la soglia di intensità delle immagini CSLO ritagliate utilizzando Image > Adjust > Brightness/Contrast (Regolazione luminosità/contrasto) per ottenere una visualizzazione ottimale dei singoli corpi di soma bianchi sullo sfondo nero.
      NOTA: Determinare una soglia personalizzata dopo aver esaminato il batch di immagini ritagliate o applicare un algoritmo di soglia coerente (ad esempio, il metodo⁵ di Huang in ImageJ/Fiji). Per il metodo di Huang: (1) Converti le immagini in scala di grigi a 8 bit (Tipo di > immagine > 8 bit). (2) Accedere allo strumento di soglia (Immagine > Regola > soglia). (3) Selezionare Huang come metodo di soglia. (4) Visualizza l'anteprima della segmentazione e fai clic su Applica. La soglia verrà calcolata automaticamente e visualizzata sull'istogramma dell'immagine.
   2. Attiva il plug-in Cell Counter e fai clic su ciascun soma RGC positivo per il conteggio. Registra il numero totale di celle contrassegnate nella regione analizzata. Ripetere questa procedura per tutte le immagini ritagliate da ciascun punto temporale di follow-up.
5. Analisi dei dati
   1. Esporta i dati sulla conta delle cellule e sull'intensità della fluorescenza in un foglio di calcolo o in un software statistico (ad esempio, GraphPad Prism).
   2. Eseguire test statistici appropriati sulla base del disegno sperimentale e delle ipotesi corrispondenti. Interpreta i risultati e concludi.

Risultati

Seguendo il protocollo presentato, diverse cellule retiniche sono state visualizzate e tracciate con successo in vivo utilizzando una combinazione di consegna genica mediata da AAV e CSLO. AAV2-hSyn-eGFP ha trasdotto efficacemente le RGC, determinando una robusta espressione di eGFP in tutta la retina, come confermato da CSLO e dalla colocalizzazione con il marcatore specifico per RGC, la proteina legante l'RNA con splicing multiplo (RBPMS), che si trova specificamente nello str...

Discussione

Il protocollo presentato descrive in dettaglio un metodo robusto e accessibile per la sorveglianza in vivo di specifiche popolazioni di cellule retiniche, sfruttando la potenza sia della consegna genica mediata da AAV che dell'imaging CSLO. Questo approccio offre diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali, facilitando gli studi longitudinali della dinamica delle cellule retiniche e delle loro risposte a lesioni o malattie in condizioni fisiologiche o patologiche.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 Gauge Needle	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	For intravitreal injection
0.5% proparacaine	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.		Topical Aneasthetics
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., China		Virus titer: 2.7 x 1012 viral genomes (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., China		Virus titer: 4.5 x 1012 viral genomes (vg)/mL
Betadine	Healthy medical company	001651	Topical Antiseptics
Corneal scelar forceps (toothed)	Mingren Eye Instruments, China	MR-F301A	For eyelid secure during intravitreal injection
Dumont 05# forceps	FST	51-AGT5385	For optic nerve crush
Graphpad prism	GraphPad Prism, USA		Graph drawing and statistical analysis
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany		"IR" and "FA" mode for CSLO imaging
Image J/Fiji	National Institutes of Health, USA		Image processing
Maxitrol antibiotic ointment	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	Topical antibiotics
Microliter Syringe	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	For intravitreal injection
Mydrin-P Ophthalmic solution	Santen Pharmaceutical Co.,Ltd, Japan		Pupil dilation
Ophthalmic surgical microscope	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M220	For surgical operations
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		Image alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Germany		Topical lubricant