컨포칼 스캐닝 레이저 검안경을 통한 맞춤형 아데노 관련 바이러스 혈청형을 이용한 망막 세포의 종단 생체 내 이미징

요약

이 프로토콜은 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경(CSLO)을 사용하여 세포 특이적 표지 및 생체 내 이미징을 위한 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 사용을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 다양한 망막 세포 유형과 망막 기능 및 질병에 대한 기여도를 조사할 수 있습니다.

초록

망막 세포 과정의 역동적인 특성으로 인해 안구 질환에 대한 이해와 치료를 강화하기 위해 유전자 전달 및 실시간 모니터링 기술의 발전이 필요합니다. 본 연구는 최적화된 아데노연관바이러스(AAV) 접근법을 소개하며, 특정 혈청형과 프로모터를 활용하여 망막신경절세포(RGC) 및 뮐러신경교세포를 포함한 표적 망막 세포에서 최적의 transfection 효율을 달성합니다. 컨포칼 주사 레이저 검안경(CSLO)의 정밀도를 활용하여 이 연구는 AAV 매개 녹색 형광 단백질(GFP)의 종적 발현을 캡처하는 생체 내 이미징을 위한 비침습적 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 최종 절차의 필요성을 제거하여 관찰의 연속성과 피험자의 안녕을 보존합니다. 또한, GFP 신호는 상구(superior colliculus, SC) 및 외측 외상핵(lateral geniculate nucleus, LGN)으로 가는 시각 경로를 따라 AAV에 감염된 망막 신경절(RGC)에서 추적될 수 있으며, 이를 통해 직접적인 시각 경로 매핑을 가능하게 할 수 있습니다. 이러한 발견은 상세한 프로토콜을 제공하고 망막 세포 행동, 질병 발병 기전 및 유전자 치료 중재의 효능에 대한 실시간 연구에 이 강력한 도구의 적용을 입증하여 살아있는 망막과 그 연결에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서문

망막은 중추신경계에서 유일하게 광학적으로 접근할 수 있는 부분으로, 신경과학 연구를 위한 귀중한 모델 역할을 합니다¹. 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 시각 정보를 뇌에 전달하는 망막의 출력 뉴런으로, 시각 기능에 중요한 역할을 합니다. 이들의 상실 또는 기능 장애는 시각 장애와 돌이킬 수 없는 실명으로 이어지는데, 이는 녹내장과 다른 시신경병증에서 볼 수 있다². 망막의 주요 신경교세포(glial cell)인 뮐러아교세포(Müller glia)는 망막의 항상성을 유지하고, 뉴런에 구조적, 신진대사적 지원을 제공하며, 신경전달물질 수치를 조절하고, 망막 복구 및 재생에 기여하는 데 필수적이다³. 이들의 기능 장애는 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy)⁴, 노화 관련 황반변성(age-related macular degeneration)⁵, 안구 허혈 증후군(ocular ischemic syndrome)⁶ 등 다양한 망막 질환과 관련이 있다. 망막 신경절세포와 뮐러 신경교세포는 밀접한 상호작용과 상호의존성을 보인다. 뮐러신경교세포(Müller glia)는 망막신경세포(Rrecc)에 필수적인 지원을 제공하는 반면, 망막신경세포(RGC) 활동은 뮐러(Müller) 신경교세포(Müller glia) 기능에 영향을 미칠 수 있다 ^3,7. 망막 신경절 세포와 뮐러 신경교세포를 모두 연구하는 것은 망막 기능을 이해하고 여러 망막 질환에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다.

현재 망막 연구의 평가는 주로 광간섭 단층촬영(Optical Coherence Tomography, OCT)과 같은 기술을 사용하여 망막 신경 섬유층의 두께나 축삭 다발의 궤적을 측정합니다 ^8,9. 이러한 방법은 망막 신경절 세포(RGC loss)를 검출하는 데 매우 중요하지만, 제한된 해상도로 인해 망막 신경절 세포(RGC morphology) 및 신경교세포(glial cell)에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, AO-SLO(Adaptive Optics scanning laser ophthalmoscopy)와 같은 고급 기술을 통해 살아있는 인간 망막¹⁰에서 망막 세포, 광수용체 및 신경교세포의 세포 수준 이미징이 가능하지만, 기술적 복잡성과 제한된 접근성으로 인해 주로 전문 연구 환경에서만 사용할 수 있습니다. 이러한 제약을 감안할 때, in vivo에서 특정 망막 세포 집단에 대한 심층적인 연구를 위해 보다 접근하기 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 개발해야 할 필요성이 지속적으로 있습니다.

따라서 이 프로토콜은 망막 세포의 연구 응용 분야에 적합한 대체 이미징 접근 방식을 도입하는 것을 목표로 합니다. AAV 매개 세포 유형 특이적 라벨링의 힘과 CSLO 이미징의 비침습적 특성을 결합합니다. 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 면역원성이 낮고 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포를 포함한 광범위한 세포 유형을 형질도입할 수 있는 능력으로 알려진 다재다능한 유전자 전달 벡터입니다¹¹. 따라서 복잡한 망막 환경 내에서 특정 세포 집단을 표적으로 삼는 데 이상적인 도구입니다. 엄선된 혈청형 및 promoter와 함께 AAV 벡터를 활용함으로써, 망막 신경절 세포(recc s) 및 Müller glia와 같은 여러 관심 세포 유형에서 형광 단백질의 선택적 발현을 달성할 수 있습니다. 예를 들어, AAV2는 망막 신경절^12,13에서 더 높은 형질도입 효율로 알려져 있는 반면, AAV8은 광수용체¹⁴를 표적으로 하는 데 현저하게 효과적이며, AAV9는 Müller 신경교세포¹⁵에서 강력한 형질주입 능력을 보여주어 다양한 망막 세포층에 걸쳐 광범위한 효율성을 보여줍니다. AAV의 효과는 혈청형의 선택뿐만 아니라 transgene 발현의 강도와 세포 특이성을 결정하는 promoter에 의존한다는 점에 유의하는 것이 중요하며, 이는 최적의 transduction을 달성하기 위한 신중한 선택의 중요성을 강조합니다.

망막 신경절 세포 라벨링을 위해 이 프로토콜은 인간 시냅신(hSyn) 프로모터와 함께 AAV2를 사용합니다. AAV2는 유리체강내 주사 후 망막 신경세포의 효율적인 형질도입을 나타내며(¹³), 유비쿼터스 뉴런 프로모터인 hSyn 프로모터는 이러한 세포 내에서 강력하고 특이적인 전이유전자 발현을 유도합니다¹⁶. Müller glia의 경우, 프로토콜은 GfaABC1D promoter¹⁷에 의해 구동되는 AAV9 벡터를 활용하며, 이는 이러한 세포¹⁵에서 강력한 transgene 발현을 보여줍니다. 이 표적 라벨링 접근 방식을 통해 연구원들은 이러한 세포를 주변 망막 조직과 구별하고 시간이 지남에 따라 추적할 수 있으며, 이는 망막 세포와 생물 환경 변화에 대한 반응에 대한 생체 내 감시를 위한 기초를 제공합니다.

컨포칼 주사 레이저 검안경(CSLO)은 살아있는 망막의 고해상도 이미지를 제공하는 비침습적 이미징 기술로, 형광 표지된 망막 세포 집단의 실시간 시각화를 가능하게 합니다 18,19,20. 집중된 레이저 빔이 망막을 스캔하여 핀홀을 통과하는 방출광을 포착하여 초점이 맞지 않는 신호를 제거함으로써 대비가 향상된 더 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 형질전환 표지된 망막 신경절 세포(transgenic labeled RGC^21,22) 및 미세아교세포(^{microglia) 23}을 시각화하는 연구를 포함하여 살아있는 동물의 망막 세포 이미징에 널리 사용되는 Heidelberg Spectralis CSLO 시스템을 활용합니다. 488nm 레이저와 적절한 필터를 갖춘 HRA CSLO 장치를 사용함으로써 연구자들은 형광 리포터 유전자를 운반하는 AAV 벡터의 유리체강내 주입 후 살아있는 동물에서 형광 표지된 망막 신경절 세포 또는 뮐러 신경교세포를 이미지화할 수 있습니다. 중추 망막과 말초 망막을 모두 다루는 주간 세션이 있는 종단 이미징 프로토콜은 시간 경과에 따른 변화를 추적합니다. 동물 복지를 우선시하기 위해 이 프로토콜은 HRA CSLO 장치의 자동 시선 추적 시스템(ART)을 활용하여 전신 마취나 콘택트렌즈 없이도 정밀한 이미지 획득을 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 AAV와 CSLO의 결합된 힘을 활용하여 생체 내에서 특정 망막 세포 유형의 종단 모니터링을 가능하게 합니다. AAV 매개 표지의 세포 유형 특이성과 CSLO의 비침습적 고해상도 이미징 기능을 결합함으로써 이 방법을 통해 연구자들은 다양한 자극 또는 중재에 대한 반응으로 망막 신경절 세포와 뮐러 신경교세포의 동적 변화를 연구할 수 있습니다. 이러한 통찰력은 망막 질환에 대한 새로운 진단 및 치료 전략의 개발에 정보를 제공하는 데 중요한 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 베이징 캐피탈 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 생후 4주 된 성인 수컷 C57BL/6J 마우스(체중 15-20g)를 모든 실험에 사용했으며 12/12시간 라이트/다크 주기로 온도 조절이 가능한 방에 보관했습니다. 표준 설치류 차우와 물은 자유자재로 사용할 수 있었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. AAV 매개 망막 세포 형질주입

참고: 망막 신경절 세포의 표적 형질도입을 위해 이 프로토콜은 hSyn 프로모터를 통합하여 향상된 GFP의 강력한 발현을 유도하는 AAV2-hSyn-eGFP를 사용합니다. Müller glia는 AAV9-GfaABC1D-eGFP를 사용하여 표적화됩니다. 최적의 transduction efficiency와 강력한 transgene 발현을 달성하기 위해 마우스¹³의 유리체강내 주사에 대해 1 x 10¹² 바이러스 게놈(vg)/mL의 최소 AAV 역가가 권장됩니다.

1. AAV 매개 망막 세포 형질 주입 절차를 수행할 때 우발적인 노출을 방지하고 안전한 작업 환경을 보장하기 위해 엄격한 안전 프로토콜을 준수합니다.
2. 인증된 생물안전성 작업대(BSC) 내에서 바이러스 벡터와 관련된 모든 절차를 수행합니다. 시술 기간 동안 실험실 가운, 장갑, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 직원에게 제공하십시오.
3. 규정 준수를 유지하고 모든 실험실 직원을 보호하기 위해 기관 안전 프로토콜에 따라 모든 날카로운 물건과 생물학적 위험 물질을 적절하게 폐기하십시오.

2. 바이러스 벡터 및 동물의 준비

1. -80°C에서 저장된 AAV2-hSyn-eGFP 또는 AAV9-GfaABC1D-eGFP 벡터를 얻습니다. 바이러스 무결성을 보존하기 위해 사용하기 직전에 얼음 위에서 벡터를 해동합니다.
2. 50 mg/kg의 복강내 펜토바르비탈 나트륨의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 추가 조치를 취하기 전에 뒷발 반사를 테스트하여 마취 깊이를 확인하십시오.
3. 시술 중 수술 부위에 방해가 되지 않도록 수염을 다듬습니다. 20% 포비돈 요오드 용액으로 안와를 2초 동안 소독한 다음 멸균 생리식염수로 철저히 헹굽니다.
4. 0.5% 프로파라카인 한 방울을 국소적으로 바르면 불편함을 최소화하고 불수의성 안구 운동을 방지할 수 있습니다.

3. 바이러스 벡터의 취급 및 유리체강내 주입

1. 선택된 AAV 용액(AAV2-hSyn-eGFP 또는 AAV9-GfaABC1D-eGFP) 1μL를 깨끗하고 사전 냉각된 파라핀 필름 조각으로 옮겨 바이러스 활성에 영향을 줄 수 있는 온도 변동을 방지합니다.
2. 안과 수술용 현미경 아래에서 33G 베벨 바늘이 있는 Hamilton 유리 주사기를 사용하여 AAV 용액을 흡입합니다.
3. 현미경 아래에 마우스를 복부 누운 상태로 놓습니다. 머리를 약간 기울여 주사를 위한 안구 쪽을 들어 올립니다. 현미경의 배율을 조정하고 최적화하여 마우스 궤도의 상위 영역을 명확하게 식별합니다.
4. 눈의 상공막 가장자리에 있는 윤부 뒤쪽 1-2mm 후방의 바늘을 유리체강에 삽입합니다. 역류 또는 압력으로 인한 손상을 방지하기 위해 AAV 용액을 천천히 주입합니다.
   참고: 주사 부위 위치: 윤부에서 약 1mm 뒤쪽에 있는 눈의 상측두사분면에 주사를 수행합니다. 주요 혈관을 피하고 렌즈 손상 위험을 최소화하려면 이 위치를 선택하십시오. 홍채 침투 또는 렌즈 마모를 방지하기 위해 가장자리에 너무 가까운 주사 부위를 피하십시오. 혈관 구조 피하기: 주사 전에 작동 현미경을 사용하여 계획된 주사 부위에 보이는 혈관이 있는지 주의 깊게 검사합니다. 선박이 있는 경우 진입점을 약간 조정하여 선박을 피하십시오. 바늘을 홍채와 평행한 얕은 각도로 삽입하면 혈관 손상의 위험을 더욱 줄일 수 있습니다. 망막하 출혈의 위험을 줄이기 위해 같은 부위에 반복적으로 주사하지 마십시오.
5. 바늘을 30초 동안 제자리에 유지하여 벡터가 유리체 챔버 내에서 분산되어 망막 표면에 정착할 수 있도록 함으로써 성공적인 transduction의 가능성을 극대화합니다.
6. 유리체 역류의 위험을 최소화하기 위해 바늘을 천천히 빼십시오.
7. 주사 직후 주사 부위에 국소 항생제 연고를 바르십시오. 연고가 안구 표면을 완전히 덮을 수 있도록 균일하게 도포되어 안구 감염 및 염증을 예방하십시오.
   참고: 항생제 연고에는 덱사메타손 1mg/g, 네오마이신 황산염 3500IU/g 및 폴리믹신 B 황산염 6000IU/g이 포함되어 있습니다.
8. 마취에서 회복하는 동안 체온을 유지하기 위해 마우스를 가열 패드에 올려 놓고 고통이나 이상의 징후가 있는지 면밀히 모니터링합니다. 완전히 회복되고 합병증이 나타나지 않으면 정상적인 음식과 물을 섭취할 수 있는 케이지로 되돌려 보냅니다.

4. CSLO를 사용한 생체 내 이미징

1. 동물 준비
   1. 유리체강내 주사 4주 후 AAV2-hSyn-eGFP 또는 AAV9-GfaABC1D-eGFP에 감염된 마우스를 선택합니다. 0.5% 트로피카마이드와 0.5% 페닐에프린이 함유된 눈 용액 한 방울을 눈 표면에 바르면 동공이 약 2mm 직경으로 확장됩니다²².
      참고: 유리체강내 주사 후 최적의 망막 세포 형광 표지를 위해 최소 4주의 AAV 형질 주입 시간 간격이 권장됩니다¹³. 또한, 우리의 시신경 파쇄(ONC) 실험에서 망막은 감염 후 4주와 파쇄 손상 후 7일과 14일에 영상화되었습니다. 이 시점은 초기 AAV 발현과 ONC 후 망막 변화의 진행을 모두 포착하기 위해 선택되었습니다.
   2. 작업 과정에서 동물 배설물이 오염될 수 있는 것을 방지하기 위해 이미징 플랫폼을 깨끗한 패드 조각으로 덮으십시오.
      참고: 맞춤형 이미징 플랫폼은 동물이 엎드려 눕을 수 있는 충분한 공간을 제공하여 안정성을 보장하고 수동 구속 시 움직임을 최소화하여 최적의 이미지 획득을 가능하게 합니다.
   3. 마우스를 이미징 플랫폼으로 조심스럽게 옮기고 이미징 전에 2-5분의 순응 기간을 허용하여 스트레스를 최소화하고 이미징 환경에 쉽게 적응할 수 있도록 합니다.
   4. 두 번째 기술자의 도움을 받아 시술 내내 의식 상태를 유지하면서 동물을 부드럽게 제지하십시오. 15초 촬영 후 10초의 휴식 간격을 제공하여 눈을 깜박이고 각막의 수분을 유지합니다.
      알림: 두피 피부를 부드럽게 문질러 눈꺼풀이 자연스럽게 들리도록 유도하고, 강제로 눈꺼풀을 고정하거나 클립과 같은 추가 장치의 사용을 피하여 눈 부상의 위험을 줄입니다. 전신 마취는 일시적인 렌즈 불투명도를 악화시킬 가능성이 있으므로 장시간 이미징 세션 동안 광학적 선명도를 유지하기 위해 사용되지 않습니다. 시술 전반에 걸쳐 고품질 이미지 획득과 동물의 편안함 및 안전의 균형을 유지합니다. 동물의 복지를 보장하고 영상 품질을 유지하기 위해 5분 이내에 전체 절차를 완료하십시오.
   5. 초점 노브(그림 1B)와 마이크로 매니퓰레이터(그림 1C)를 미세 조정하여 후속 생체 내 이미징을 위한 관심 영역(ROI)을 조준하여 머리 자세를 조정하고 카메라 렌즈를 정렬합니다.
2. 시스템 구성
   1. 카메라에 비접촉식 55° 광각 렌즈를 부착하여 안저 영역의 시야를 확장합니다.
   2. 필터 휠을 A (혈관 조영술) 위치로 설정하여 적외선(IR) 및 형광 혈관 조영술(FA) 이미징 모드를 획득할 수 있습니다(그림 1A). 레이저와 전원 공급 장치를 켜서 CSLO 이미징 시스템을 활성화합니다.
   3. Heidelberg Eye Explorer 소프트웨어를 열고 메뉴 표시줄 상단의 새 환자 아이콘을 클릭하여 새 검사를 만듭니다. 관련 동물 정보를 입력하고 팝업 창에서 기본 각막 곡률인 7.7mm를 수락합니다.
   4. 제어판 화면에서 노란색 시작 버튼(그림 1E)을 선택하여 라이브 이미징 모드를 시작합니다.
3. 생체 내 CSLO 이미징
   1. 제어판에서 820nm 여기 파장에서 자동 형광이 있는 IR 모드(그림 1G)를 선택합니다. 고해상도 이미징을 달성하기 위해 High Res. (HR) 모드는 창 인터페이스 또는 수동 제어판을 통해 활성화됩니다(그림 1F).
      참고: 적외선 반사(IR) 이미징은 일반적으로 CLSO 안과 이미징의 첫 번째 단계로, 플루오레세인 혈관 조영술(FA) 전에 획득하여 기준선 보기를 제공합니다. 조명, 최소한의 아티팩트, 주요 망막 혈관에 대한 선명한 초점조차도 z-plane focusing의 신뢰성과 고품질 IR 이미지를 달성하는 데 매우 중요합니다.
   2. 미세 조정을 위해 XYZ-micromanipulator가 있는 조이스틱을 사용하여 렌즈를 마우스 눈 쪽으로 이동합니다. 광학적 투명도를 검사하고 감도 노브(그림 1D)를 시계 반대 방향으로 돌려 안저 이미지의 밝기를 40%-60%로 줄여 안저의 과다 노출을 방지하고 망막 세부 사항의 시각화를 향상시킵니다.
   3. 시신경 디스크와 망막 혈관이 안저에서 명확하게 식별될 때까지 초점 손잡이와 미세 조작기를 조정합니다.
      참고: 최적 초점면의 기준: (1) 어두운 모서리가 없는 균일하게 조명된 안저 시야. (2) 초점 어두운 점이나 왜곡이 없는 광학 디스크 주변의 균일한 조명. (3) 혈류의 눈에 띄는 움직임과 함께 큰 망막 혈관의 명확한 내강 모양.
   4. 여기 파장이 488nm인 고체 청색 레이저와 500nm의 배리어 필터를 사용하여 FA 모드(그림 1H)로 전환합니다. 감도 노브(그림 1D)를 시계 방향으로 돌려 안저 이미지의 밝기를 50%-107%로 높여 대상 망막 영역을 비춥니다.
   5. ART 평균값(소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 하단에 있는 파란색 막대)을 15 이상으로 설정하여 신호 대 잡음 비율을 높입니다. 이 기능은 동일한 위치에서 획득한 일련의 B 스캔의 평균을 계산하여 이미지 품질을 향상시킵니다.
      참고: ART 평균 값이 높을수록 일반적으로 평균화를 통해 이미지 품질이 향상되지만 스캔 시간도 연장됩니다. 이렇게 오랜 시간이 길어지면 각막 탈수 및 동물 피로의 위험이 잠재적으로 증가할 수 있으며, 특히 깨어 있는 동물 이미징에서 신중하게 고려해야 하는 요인입니다.
   6. 망막의 내면에 재정렬하고, 특히 망막 신경절 세포(RGC) 또는 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)를 발현하는 GFP를 표적으로 합니다. 망막 신경절 세포체(RGC soma) 및 축삭돌기(axons) 또는 뮐러(Müller) 세포체와 같은 원하는 세포 집단의 선명한 조명을 보장하기 위해 미세 조정이 이루어집니다. 이미징 감도는 최적의 시각화를 달성하고 GFP 양성 세포의 과포화를 방지하기 위해 균형을 이룹니다.
      참고: GFP 신호의 비슷한 선명도와 밝기를 가진 이미지를 얻으려면 실험의 모든 마우스에 대해 감도 획득이 일정해야 합니다.
   7. 감도 노브(그림 1D)를 눌러 온라인에서 실시간 평균 이미지를 생성하는 ART 모드를 시작합니다. 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 하단에 있는 파란색 막대(ART 평균값을 나타냄)가 설정된 ART 값(≥ 20프레임)에 도달할 때까지 기다렸다가 제어 인터페이스에서 Acquire 버튼을 눌러 안저 이미지를 캡처합니다.
      참고: ART 모드의 경우 시선 추적이 통합되어 생체 내 이미징 중 사소한 안구 움직임을 자동으로 보정하여 선택한 망막 초점면에서 일관된 초점을 맞출 수 있습니다.
   8. 원하는 이미지를 획득하면 터치 패널의 감도 노브를 눌러 ART 모드를 종료합니다.
      참고: 각막의 건조를 방지하고 자발적인 눈 깜박임을 허용하기 위해 이미징 과정에서 15초마다 10초의 휴식을 취했습니다.
   9. 코 및 측두 망막 영역을 탐색하려면 카메라 헤드를 수평으로 움직이면서 화면의 라이브 이미지를 관찰합니다. 대상 영역에 도달하면 초점을 미세 조정하고 2.3.1-2.3.8 단계에 설명된 대로 이미징 프로세스를 시작합니다.
      참고: 느리고 통제된 카메라 움직임을 유지하면서 안저의 일관되고 밝은 조명을 보장합니다. 어두운 영역이 나타나면 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 카메라 위치를 수직으로 조정하고 망막의 중심을 다시 잡습니다.
   10. 상망막을 이미지화하려면 마우스 머리의 자세를 앞면이 위로 향하도록 부드럽게 조정합니다. 카메라 헤드를 위쪽으로 적당히 기울여 상망막 영역에 맞춥니다. 필요에 따라 초점을 다시 조정하고 이미징을 진행합니다.
   11. 이미징이 완료되면 원하는 모든 망막 영역이 획득 창을 종료하고 이미지가 자동으로 저장됩니다. 각막의 수분을 유지하기 위해 영상화된 눈에 국소 윤활제를 바르십시오.
   12. 반대쪽 눈의 검사를 시작하려면 동물을 플랫폼 반대편으로 재배치하고 2.3.1-2.3.11 단계를 반복합니다.

5. 이미지 처리 및 분석

1. 이미지 내보내기 및 준비
   1. Heidelberg Eye Explorer 소프트웨어를 열고 원하는 CSLO 이미징 세션을 좋은 품질로 선택합니다. 시간이 지남에 따라 일관된 감도 설정으로 동일한 망막 위치의 단일 또는 연속 이미지를 선택합니다.
   2. 초점이 좋지 않거나 각막의 선명도가 떨어지는 흐릿한 이미지를 제외하여 망막 구조가 선명하게 시각화된 이미지만 분석에 사용되도록 합니다. 추가 처리를 위해 이러한 이미지를 TIFF 형식으로 내보냅니다.
2. 이미지 정렬 및 자르기
   1. 동일한 망막 영역을 기준으로 마우스 눈당 이미지를 그룹화합니다.
      참고: CSLO 시스템에서 획득한 원본 이미지는 크기가 1536 x 1536 픽셀, 해상도가 5.69um/픽셀, ART 값이 ≥15인 TIFF 형식으로 저장됩니다.
   2. 후속 검사를 위해 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어로 가져옵니다. 기준선 이미지의 방향과 일치하도록 필요에 따라 이미지를 회전하고 정렬합니다. 처리된 이미지를 저장하거나 내보낼 때 가능한 최고의 이미지 품질을 유지하는 설정을 사용하여 잠재적인 압축 아티팩트를 최소화합니다.
   3. 혈관 구조와 광학 디스크를 랜드마크로 사용하여 해당 기준선 이미지와 일치하도록 회전하여 동일한 눈의 시계열의 CSLO 이미지를 정렬합니다.
      참고: 정렬된 각 이미지를 주의 깊게 검사하고 자르기를 진행하기 전에 다음 기준을 충족하는지 확인하십시오: (1) 전체 망막 영역 캡처: 이미지는 시신경 디스크 및 주요 혈관과 같은 주요 랜드마크를 포함하여 의도된 관심 망막 영역을 완전히 포함해야 합니다. (2) 모션 아티팩트 부재: 이미지는 이미징 중 안구 움직임으로 인한 구조의 흐림, 줄무늬 또는 중복이 없어야 합니다. (3) 왜곡 최소화: 이미지는 이미징 각도나 렌즈 효과로 인해 발생할 수 있는 뒤틀림, 늘어남 또는 압박 아티팩트 없이 망막 구조를 정확하게 표현해야 합니다. (4) 이미지 품질 메트릭의 균형: 배경 소음 수준 평가(구조가 없는 영역에서 픽셀 강도의 표준 편차 < 5(0-255 스케일)); 신호 대 잡음비(SNR>20), 조명 일관성(6개 이미지 사분면 간의 변동 계수<10%) 및 이미지 균일성(균질 영역의 변동 계수<15%)).
   4. 회전된 이미지를 선택하고 TIFF 형식으로 내보냅니다. 각 시점에 대해 자르기 도구를 사용하여 품질이 승인된 이미지에서 GFP 양성 세포가 포함된 5-10개 영역(각각 300 x 300픽셀)을 무작위로 선택하고 자릅니다. 추가 분석을 위해 자른 각 이미지를 TIFF 형식으로 개별적으로 내보냅니다.
3. 형광 강도 측정
   1. 자른 CSLO 이미지(8비트 그레이스케일, 300 x 300 픽셀)를 ImageJ/Fiji에서 엽니다.
   2. 형광 신호의 전반적인 변화를 검사하려면 Analyze > Measure (또는 Ctrl + M)를 사용하여 자른 이미지당 총 형광 강도를 측정합니다. 자른 전체 이미지의 평균 GFP 형광 강도를 나타내는 "Mean" 값을 기록합니다.
4. 망막 신경절 분석기(RGC) 정량화
   1. ImageJ/Fiji에서 Image > Adjust > Brightness/Contrast 를 사용하여 자른 CSLO 이미지의 강도 임계값을 조정하여 검은색 배경에 대해 개별 흰색 소마 바디를 최적으로 시각화합니다.
      참고: 잘린 이미지의 배치를 검토한 후 개별화된 임계값을 결정하거나 일관된 임계값 알고리즘을 적용합니다(예: ImageJ/Fiji의 Huang's method⁵ ). Huang의 방법 : (1) 이미지를 8 비트 그레이 스케일로 변환합니다 (이미지 > 유형 > 8 비트). (2) 임계값 설정 도구(이미지 > Adjust > Threshold)에 액세스합니다. (3) 임계값 방법으로 Huang 을 선택합니다. (4) 세분화를 미리 보고 적용을 클릭합니다. 임계값은 자동으로 계산되어 이미지 히스토그램에 표시됩니다.
   2. Cell Counter 플러그인을 활성화하고 각 GFP 양성 RGC soma를 클릭하여 계산합니다. 분석된 영역에 표시된 총 셀 수를 기록합니다. 각 후속 시점에서 자른 모든 이미지에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
5. 데이터 분석
   1. 세포 수 및 형광 강도 데이터를 스프레드시트 또는 통계 소프트웨어(예: GraphPad Prism)로 내보냅니다.
   2. 해당 실험 설계 및 가설을 기반으로 적절한 통계 테스트를 수행합니다. 결과를 해석하고 결론을 내립니다.

결과

제시된 프로토콜에 따라, AAV 매개 유전자 전달과 CSLO의 조합을 사용하여 다양한 망막 세포를 성공적으로 시각화하고 생체 내에서 추적했습니다. AAV2-hSyn-eGFP는 망막 신경절 세포를 효과적으로 형질전환하여 망막 전체에 걸쳐 강력한 eGFP 발현을 일으켰으며, 이는 CSLO에 의해 확인되었으며 신경절 세포층에서 특이적으로 발견되는 RGC 특이적 마커인 RNA 결합 단백질(RBPM...

토론

제시된 프로토콜은 AAV 매개 유전자 전달과 CSLO 이미징의 힘을 활용하여 특정 망막 세포 집단의 생체 내 감시를 위한 강력하고 접근 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공하여 생리학적 또는 병리학적 조건에서 망막 세포 역학 및 손상 또는 질병에 대한 반응에 대한 종단 연구를 용이하게 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 Gauge Needle	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	For intravitreal injection
0.5% proparacaine	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.		Topical Aneasthetics
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., China		Virus titer: 2.7 x 1012 viral genomes (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., China		Virus titer: 4.5 x 1012 viral genomes (vg)/mL
Betadine	Healthy medical company	001651	Topical Antiseptics
Corneal scelar forceps (toothed)	Mingren Eye Instruments, China	MR-F301A	For eyelid secure during intravitreal injection
Dumont 05# forceps	FST	51-AGT5385	For optic nerve crush
Graphpad prism	GraphPad Prism, USA		Graph drawing and statistical analysis
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany		"IR" and "FA" mode for CSLO imaging
Image J/Fiji	National Institutes of Health, USA		Image processing
Maxitrol antibiotic ointment	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	Topical antibiotics
Microliter Syringe	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	For intravitreal injection
Mydrin-P Ophthalmic solution	Santen Pharmaceutical Co.,Ltd, Japan		Pupil dilation
Ophthalmic surgical microscope	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M220	For surgical operations
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		Image alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Germany		Topical lubricant