הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

Summary

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

Abstract

אוטופגיה (מאקרו) מייצגת מסלול פירוק תאי בסיסי. בתהליך זה, שלפוחיות בעלות קרום כפול הידועות בשם אוטופגוזומים בולעות תוכן ציטופלזמי, ולאחר מכן מתמזגות עם ליזוזומים לצורך פירוק. מעבר לתפקיד הקנוני, גנים הקשורים לאוטופגיה מווסתים גם מסלול הפרשה הכולל שחרור של מולקולות דלקתיות, גורמי תיקון רקמות ובועיות חוץ-תאיות (EV). יש לציין כי תהליך הפצת חלבונים פתולוגיים בין תאים, במיוחד במחלות נוירודגנרטיביות הפוגעות במוח ובחוט השדרה, מדגיש את חשיבות הבנת התופעה. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שהחלבון קושר הדנ"א 43 kDa (TDP-43), שחקן מפתח בטרשת אמיוטרופית צידית וניוון האונה הקדמית-טמפורלית, משתחרר באופן תלוי אוטופגיה באמצעות כלי רכב חשמליים המועשרים בסמן האוטופגוזום חלבונים הקשורים למיקרוטובולים 1A/1B שרשרת אור 3B-II (LC3-II), במיוחד כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

כדי להבהיר את המנגנון העומד בבסיס היווצרותם ושחרורם של כלי רכב חשמליים חיוביים ל-LC3-II, הכרחי לבסס שיטה נגישה וניתנת לשחזור להערכת שלפוחיות חיוביות LC3-II תוך-תאיות וחוץ-תאיות. מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט להערכת רמות LC3-II באמצעות אימונובלוטינג בשברים תאיים וחשמליים המתקבלים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. Bafilomycin A1 (Baf), מעכב של איחוי אוטופגוזום-ליזוזום, משמש כבקרה חיובית לשיפור רמות השלפוחיות החיוביות LC3-II תוך תאיות וחוץ-תאיות. הגן 101 (TSG101) משמש כסמן לגופים רב-שלפוחיתיים. ביישום פרוטוקול זה, הוכח כי הפלה בתיווך siRNA של תחביר-6 (STX6), גורם סיכון גנטי למחלת קרויצפלד-יעקב ספורדית, מעלה את רמות LC3-II בחלק EV של תאים שטופלו ב- Baf מבלי להראות השפעה משמעותית על רמות TSG101. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-STX6 עשוי לווסת באופן שלילי את השחרור החוץ-תאי של LC3-II באמצעות כלי רכב חשמליים, במיוחד בתנאים שבהם איחוי אוטופגוזום-ליזוזום נפגע. בשילוב עם שיטות מבוססות להערכת אוטופגיה, פרוטוקול זה מספק תובנות חשובות לגבי תפקידן של מולקולות ספציפיות בהיווצרות ושחרור של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II.

Introduction

תגובת טרנסאקטיבציה חלבון קושר DNA 43 (TDP-43) הוא ריבונוקלפרוטאין גרעיני הטרוגני בעל ביטוי נרחב המעורב בוויסות שחבור אקסון, שעתוק גנים ויציבות mRNA, כולם חיוניים להישרדות התא ^1,2. במצבים נוירודגנרטיביים כמו טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) וניוון אונה פרונטו-טמפורלית (FTLD), חלבון גרעיני TDP-43 מצטבר באופן חריג בציטופלסמה. שינוי זה גורם לאובדן תפקוד TDP-43 בגרעין ולעלייה רעילה בתפקוד הציטופלסמה. הצטברות פתולוגית של TDP-43 מתחילה באזורים ספציפיים של המוח וחוט השדרה, ומתפשטת באזורים אלה באופן דמוי פריון, תהליך הקשור קשר הדוק עם התקדמות המחלה³. עם זאת, המנגנון המדויק שבו פתולוגיה TDP-43 מתפשטת דרך המוח וחוט השדרה נותר לא ידוע.

TDP-43 מופרש באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), ורמות גבוהות של TDP-43 מזוהות בפלזמה ובנוזל השדרה (CSF) של חולי ALS ו-FTLD-TDP ^4,5,6. CSF מחולים שאובחנו עם ALS ו- FTLD גורם למיקום שגוי תוך תאי וצבירה של TDP-43 אנדוגני בתאי גליומה אנושיים⁷. לפיכך, TDP-43 המשתחרר מחוץ לתא באמצעות כלי רכב חשמליים עשוי לתווך את התפשטות התא לתא של פתולוגיית TDP-43.

אוטופגיה היא מנגנון פירוק תאי שמור היטב הכולל סגירה של חומרים לא רצויים בתוך שלפוחיות קרום כפול, הידועות בשם אוטופגוזומים, המסומנות על ידי LC3. אוטופגוזומים אלה מתמזגים עם ליזוזומים חיוביים לחלבון הממברנה הקשור לליזוזומלים 1 (LAMP1) ליצירת אוטוליזוזומים (LC3⁺/LAMP1⁺), מה שמוביל לפירוק תכולתם⁸. ניתוחים היסטולוגיים מצביעים על כך שאוטופגוזומים הבולעים תכלילים מצטברים בנוירונים של חולי ALS ספורדיים⁹. חלק מהגנים הסיבתיים של ALS משפחתי ו- FTLD-TDP קשורים לוויסות אוטופגיה 10,11,12. ממצאים אלה מצביעים על כך שאוטופגיה מדוכאת בחולי ALS ו-FTLD-TDP.

המחקר הקודם הצביע על כך ש-TDP-43 מופרש באמצעות כלי רכב חשמליים חיוביים לסמן האוטופגוזום LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב¹³. חוסר ויסות של מסלול אוטופגיה-ליזוזום עלול לגרום לא רק להצטברות תוך-תאית של TDP-43 אלא גם לשחרור חוץ-תאי של TDP-43 באמצעות EVs¹⁴. עם זאת, עדיין לא ידוע כיצד משוחררים כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II ועד כמה זה משמעותי בהתפשטות הפתולוגיה של TDP-43.

כלי רכב חשמליים מסווגים לכלי רכב חשמליים גדולים (בקוטר 100 עד 1000 ננומטר), המיוצרים מניצני פני השטח של התא, ולכלי רכב חשמליים קטנים (בקוטר 50 עד 150 ננומטר), המיוצרים מניצני קרומים אנדוזומליים לכיוון פנים האנדוזום (המכונים אקסוזומים) ומנגנון גולג'י. כדי לאסוף בנפרד כלי רכב חשמליים גדולים וקטנים, אנו מבצעים צנטריפוגות רציפות ואוספים כדוריות באמצעות צנטריפוגות ב-20,000 × גרם ו-110,000 × גרם, בהתאמה. מקטע P1 EV (20,000 × גרם כדורים) מוכן לאסוף כלי רכב חשמליים גדולים, ושבר P2 EV (110,000 × גרם כדורים) מוכן לאסוף כדורי EV קטנים¹⁵. המתודולוגיה להערכת רמות LC3-II בכלי רכב חשמליים גדולים וקטנים הנגזרים מצנטריפוגה רציפה על ידי אימונובלוטינג היא יציבה וניתנת לשחזור¹⁶. בנוסף לניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, ניתוח היווצרות אוטוליזוזום ואומגה משפר את ההבנה כיצד חוסר ויסות של אוטופגיה מוביל לשחרור של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II. כאן, המחקר הנוכחי מראה את התפקיד המדכא של תחביר 6 (STX6), חלבון SNARE, אשר מקדם את התנועה של בועיות הובלה כדי להתמקד בממברנות¹⁷, בשחרור של EV חיובי LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

Protocol

1. הכנת חלק התא, P1 ו-P2 EV מהתווך התרבית של תאי HeLa

1. הכנת חלק P1 ו- P2 EV מהמדיום התרבית של תאי HeLa
   1. יום 1
      1. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים וזרעו 1 × 10⁶ תאים על צלחת בגודל 6 ס"מ המכילה מדיום תרבית המורכב מגלוקוז גבוה DMEM, 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
   2. יום 2 (אופציונלי)
      1. הכינו תמיסת siRNA של 20 מיקרומטר.
      2. יש לערבב 100 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של siRNA בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה A.
      3. יש לערבב 100 μL של מדיום סרום מופחת ו-5 μL של מגיב טרנספקציה בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה B.
      4. ערבבו תמיסה A ותמיסה B, ולאחר מכן דגרו על התערובת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
      5. הוסף את תערובת התמיסות A ו - B למדיום המשמש לגידול תאי HeLa. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
   3. יום 3
      1. שטפו את התאים עם PBS וחשפו אותם ל-500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת 1 mM EDTA ב-37°C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
      2. הוסיפו 2.5 מ"ל של מדיום התרבית לתאים, והשתמשו בפיפטת העברת פסטר עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר מחובר להכנת תרחיף חד תאי.
      3. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 10⁶ תאים על צלחת של 10 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
         הערה: יש צורך להכין לפחות 1 × 10⁶ תאים כדי לאסוף EVs ממדיום התרבית הדרוש לניתוח immunoblotting.
   4. יום 4
      1. הכן מדיום תרבית (ראה שלב 1.1.1.1) המכיל רכב (DMSO) או 100 ננומטר Bafilomycin A1 (Baf).
      2. חשוף את התאים לתווך המכיל רכב או 100 ננומטר Baf ודגור עליהם ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
   5. יום 5
      1. אספו את כל אמצעי התרבית מהצלחת בקוטר 10 ס"מ, העבירו אותה לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגו אותה בטמפרטורה של 3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר פסולת תאים.
         הערה: התאים הנותרים בלוח בגודל 10 ס"מ ישמשו בסעיף 1.2.1.
      2. לבידוד של מקטע P1 EV, העבירו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-3,000 × גרם לתוך צינור צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה ב-20,000 × גרם ב-4°C למשך שעה אחת.
      3. לבידוד חלק P2 EV, העבירו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-20,000 × גרם לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה ב-110,000 × גרם ב-4°C למשך שעה אחת.
      4. לאחר ניגוב הלחות העודפת בתוך הצינור באמצעות מגבון מעבדה, יש להשהות מחדש את הכדורים הנותרים בצינור הצנטריפוגה ב-50 μL של חיץ דגימה פי 2 [2.5% SDS, 125mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 30% גליצרול, 10% 2-מרקפטואתנול, 0.4% Bromophenol Blue] כדי להכין את מקטע P1 EV.
      5. הסר את supernatant על ידי decanting, לנגב את הלחות העודפת בתוך הצינור עם מגבון מעבדה, ולאחר מכן להשעות מחדש את הכדורים הנותרים בצינור ultracentrifugation ב 50 μL של 2x חיץ דגימה כדי להכין את החלק P2 EV.
      6. יש לדגור על שברי P1 ו-P2 EV בטמפרטורה של 100°C על בלוק חום למשך 10 דקות.
         הערה: אין לנער את הצינורות לאחר הצנטריפוגה בעוצמה של 20,000 × גרם ו-110,000 × גרם כדי למנוע השלכה בטעות של הכדורים הנותרים. לאחר הטיית הצינור כדי להעביר את הסופרנאטנט, שמרו על מיקום הצינור כדי למנוע מהגלולה לשקוע שוב בסופרנאטנט שנותר.
2. הכנת מקטע התא מתאי HeLa בתרבית
   1. יום 5
      1. לאחר העברת מדיום התרבית מהצלחת בקוטר 10 ס"מ לצינור של 15 מ"ל, שטפו את התאים בצלחת של 10 ס"מ עם PBS וחשפו אותם ל-2 מ"ל של 0.25% טריפסין ותמיסת EDTA של 1 מ"מ ב-37°C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
      2. הוסף 8 מ"ל של מדיום גידול לתאים, ולאחר מכן השתמש פיפטה העברת פסטר עם קצה פיפטה 200 μL כדי פיפטה פיפטה את התאים ולהכין תרחיף תא יחיד.
      3. מעבירים את מתלה התא לצינור בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 1,000 × למשך 10 דקות ב-4°C.
      4. הסר את supernatant על ידי אספירטור, להוסיף PBS לגלולה התא, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
      5. הסר את PBS באמצעות שואב וסוניק את גלולת התא ב 1 מ"ל של חיץ A68 [10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0.8 M NaCl, 1 mM אתילן גליקול bis(β-aminoethyl אתר)-N,N,N,N,N-חומצה טטראצטית (EGTA)] המכיל 1% סרקוזיל.
      6. מדוד את ריכוז החלבון של התא ליזט באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.
      7. מערבבים 300 μL של ליזט התא עם 100 μL של מאגר דגימה 4x ודגרים על התערובת ב 100 ° C על בלוק חום במשך 10 דקות כדי להכין את חלק התא.

2. ניתוח אימונובלוטינג

1. הפרד כמויות שוות ערך של חלבונים בדגימות על ידי SDS-PAGE¹⁸.
2. העבירו את החלבונים המופרדים לקרומי פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF).
3. לאחר ההעברה, לחסום את הממברנות עם סוכן חוסם למשך 20 דקות.
4. יש לדגור על הקרום החסום למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני המצוין במאגר Tris המכיל 10% (v/v) נסיוב עגל ב-RT.
5. שטפו את הממברנה עם חיץ Tris במשך 5 שניות ולאחר מכן דגרו עליו עם נוגדן משני מצומד ביוטין ב- RT למשך שעתיים.
6. שטפו את הממברנה עם חיץ Tris למשך 5 שניות ולאחר מכן דגרו עליו עם חיץ Tris המכיל 0.4% (v/v) תמיסות A ותמיסה B מהערכה ב- RT למשך שעה אחת.
7. שטפו את הממברנה עם PBS, ולאחר מכן דגרו עליה עם PBS המכיל 0.04% (w/v) diaminobenzidine, 0.8% (w/v) NiCl₂·6H₂O, ו-0.3% (v/v) H₂O₂ לזיהוי קולורימטרי של פסים.
   הערה: לזיהוי אותות, מקובלת גם שיטת כימילומינסנציה.
8. דיגיטציה של תמונת הממברנה על ידי סורק והכפפתה לניתוח צפיפות באמצעות פיג'י.
   1. פתח את התמונה הדיגיטלית באמצעות פיג'י, והמר את תמונת הצבע RGB לתמונה של 8 סיביות על ידי לחיצה על תמונה | סוג | 8 סיביות.
   2. לחץ על כלי המלבן והתאם את גודל המלבן על ידי גרירתו כדי להקיף את הפסים. זהה את הרצועה לניתוח על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | בחר נתיב ראשון.
   3. מקם את המלבן על הפס השני ועל הפסים הבאים, וזהה את הפסים לניתוח על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | בחר הנתיב הבא.
   4. לאחר זיהוי הרצועה הסופית, מדוד את הצפיפות על פני המלבן על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | נתיבי עלילה.
   5. הקף את אזור האות של הרצועה בקו ישר, לחץ על הכלי שרביט ולחץ באזור כדי לחשב את עוצמת האות של הפס.

3. ניתוח מספר האוטופגוזומים והאוטוליזוזומים

1. יום 1
   1. ספרו את מספר תאי HeLa באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 10⁵ תאי HeLa המבטאים LAMP1-GFP ו- mCherry-LC3 על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
2. יום 2 (אופציונלי)
   1. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 1.1.2 בצלחות של 3.5 ס"מ.
3. יום 3
   1. השליכו את מדיום התרבית מהכלים בקוטר 3.5 ס"מ.
   2. יש לשטוף תאים עם PBS, לחשוף אותם ל-400 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת 1 mM EDTA, ולדגור ב-37°C עם 5%_CO2 ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
   3. מוסיפים 1.6 מ"ל ממדיום הגידול לתאים, ומפיפטים אותם עם פיפטה להעברת פסטר להכנת תרחיף חד תאי.
   4. ספור את מספר התאים באמצעות מונה התא, וזרע 1 × 10⁴ תאים על מכסה 8 תאים. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
      הערה: שתי בארות של הכיסוי התאי מוכנות לבקרה ולתאי הפלת STX6, בהתאמה, לאחר טיפול DMSO או Baf כמתואר בסעיף 3.4.2.
4. יום 4
   1. הכינו את מדיום הגידול ללא פנול אדום (DMEM ללא פנול אדום, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין), המכיל רכב (DMSO) או 100 ננומטר Baf מומס ב-DMSO.
   2. החליפו את מדיום התרבית בתווך ללא פנול אדום, המכיל רכב או 100 ננומטר באף, ודגרו במשך 4 שעות.
      הערה: כדי להעריך את ההשפעה של Baf על מספרים אוטופגוזום ואוטוליזוזומים, הכינו תאים שטופלו ברכב כבקרות.
   3. הכתימו את הגרעינים ב-0.33 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 למשך 30 דקות לפני התצפית.
   4. בצע הדמיה של תאים חיים באמצעות עדשה אובייקטיבית של 60x במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי וצלם עשרה פריימים שונים.
      1. פתח את התמונה הממוזגת RGB בפיג'י, ופצל אותה לרכיבי התמונה האדומים, הירוקים והכחולים המתאימים על ידי לחיצה על תמונה | צבע | ערוצים מפוצלים.
      2. הגדר סף קבוע עבור האותות האדומים והירוקים בכל תמונה על-ידי לחיצה על תמונה | התאמה | סף לכל ניסוי.
      3. ספור את מספר האזורים החיוביים לאותות אדומים או ירוקים על-ידי לחיצה על נתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סיכום ולאחר מכן לחץ על אישור. רשום את הערכים מהספירה כדי לזהות שלפוחיות הקשורות לאוטופגוזום וליזוזום.
      4. כדי לכסות את התמונה הירוקה על התמונה האדומה, הגדר את מצב ההעברה ל - AND על-ידי לחיצה על ערוך | פקד הדבקה. העתק את התמונה הירוקה ולאחר מכן הדבק אותה בתמונה האדומה כדי למזג אותה, תוך הדגשת אזורים חיוביים הן לאותות אדומים והן לאותות ירוקים.
      5. כדי לזהות מספרים אוטומטיזומים, ספור את מספר האזורים החיוביים לאותות אדומים וירוקים על-ידי לחיצה על נתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סיכום , לחץ על אישור ורשום את הערכים במקטע ספירה כדי לזהות שלפוחיות המשויכות לאוטופגוזומים וליזוזומים.
   5. חלק את המספר הכולל של אוטוליזוזומים ואוטופגוזומים במספר התאים הכולל כדי לחשב את מספר האוטוליזוזומים והאוטופגוזומים לכל תא.
      הערה: ספרו לפחות 35 תאים בכל אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים.

4. ניתוח היווצרות אומגה

1. יום 1
   1. ספרו את מספר תאי HeLa באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 10⁵ תאים על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
2. יום 2 (אופציונלי)
   1. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 1.1.2.
3. יום 3
   1. הכן תרחיף חד-תאי כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.2.
   2. ספרו את התאים באמצעות מונה התאים, וזרעו 1 × 10⁵ תאים על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
4. יום 4
   1. יש לערבב 1 מיקרוגרם של pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL של מגיב טרנספקציה של DNA, ו-100 μL של מדיום סרום מופחת בצינור בעל שימור נמוך. דוגרים על התערובת במשך 20 דקות, ואז מוסיפים אותה למדיום המתורבת.
   2. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
5. יום 5
   1. טריפסין את התאים כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.2.
   2. הוסף 2.5 מ"ל של מדיום הגידול לתאים. פיפטה את התערובת באמצעות פיפטה העברת פסטר להכנת תרחיף חד תא.
   3. ספור את התאים באמצעות מונה התא, וזרע 1 × 10⁴ תאים על מכסה 8 תאים. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
6. יום 6
   1. בצע את שלבים 3.4.1-3.4.4 כדי לבצע הדמיה של תאים חיים של התאים משלב 4.5.3 באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. צלם עשר מסגרות שונות של תמונות.
      1. בצעו את שלבים 3.4.4.1-3.4.4.3 כדי לפצל את התמונות הממוזגות RGB לרכיבי התמונה האדומים, הירוקים והכחולים המתאימים, לקבוע סף קבוע לאותות הירוקים בכל תמונה ולקבוע את עוצמת אות GFP. רשום את הערכים מהמקטע Total Area כדי לקבוע את עוצמת האות של GFP-ATG13.
      2. חלק את עוצמת האות הכוללת במספר התאים שנבדקו כדי לחשב את עוצמת האות לכל תא.
         הערה: ספרו לפחות 34 תאים בכל אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים.

תוצאות

כפי שהוכח במחקרים קודמים, טיפול Baf הגדיל את רמות TSG101 (P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR¹⁹) ו- LC3-II (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR¹⁹) בחלק העשיר ב- EV. יש לציין כי טיפול Baf גם הגביר את רמות STX6 (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, כפי שנקבע על...

Discussion

מחקר האימונובלוטינג חשף רמות LC3-II ו-TSG101 בחלק התאי, במקטע P1 EV העשיר במיקרו-שלפוחיות ובמקטע P2 EV העשיר באקסוזומים. דימות תאים חיים שימש לבחינת אוטופגוזומים, אוטוליזוזומים ואומגה, וסיפק תובנה האם STX6 משפיע על אוטופגיה. תוצאות משולבות אלה מצביעות על כך שהפלה של STX6 משפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	a material for sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	a material for DAB solution
3.5 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Dish	TrueLine	TR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	inhaling solution
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	2nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	2nd antibody for immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	a material for immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	a material for sample buffer solution
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	cell counting
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	vehicle
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	culture medium
DMEM without Phenol Red	Nacalai Tesque	08489-45	culture medium
EGTA	Dojindo	348-01311	a material for A68 solution
Excel	Microsoft	version 16.16.27	satistical analysis
EZR	Reference No. 24	version 1.68	satistical analysis
FBS	Sigma	173012	Culture medium
Fiji	NIH		Image analysis tool
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	a material for sample buffer solution
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hydrogen Peroxide	Fujifilm Wako	080-0186	a material for DAB solution
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	cleaning wipe
Low Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser Microscope	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody	MBL	M186-3	1st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate	Fujifilm Wako	149-01041	a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Culture medium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody	BioAcademia	70-080	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody	ProteinTech	10841-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody	ProteinTech	28283-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody	ProteinTech	20986-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Milliore	IPVH00010	a material for immunoblotting
R	R development core team	version 4.4.1	satistical analysis
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfection reagent
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA for transfection
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	a material for Tris buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	a material for sample buffer solution
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer	Bio-Rad	1450109J1	cell counting
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfection reagent
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
Wash Bottle	As One	1-4640-02	washing membrane
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806