Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

Özet

Burada, hücre dışı veziküllerde (EV'ler) otofagozom belirteç LC3-II seviyelerini immünoblotlama ile özlü bir şekilde değerlendirmek için metodolojiyi sunuyoruz. EV'lerde, otolizozom oluşumunda ve omegazom oluşumunda LC3-II seviyeleri için analiz, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II-pozitif EV'lerin salınmasında STX6'nın yeni rolünü göstermektedir.

Özet

(Makro) otofaji, temel bir hücresel bozunma yolunu temsil eder. Bu süreçte, otofagozomlar olarak bilinen çift zarlı veziküller sitoplazmik içerikleri yutar ve daha sonra bozunma için lizozomlarla birleşir. Kanonik rolün ötesinde, otofaji ile ilgili genler ayrıca enflamatuar moleküllerin, doku onarım faktörlerinin ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) salınmasını içeren bir salgı yolunu da modüle eder. Özellikle, özellikle beyin ve omuriliği etkileyen nörodejeneratif hastalıklarda, hücreler arasında patolojik proteinlerin yayılması süreci, bu fenomeni anlamanın önemini vurgulamaktadır. Son araştırmalar, amyotrofik lateral skleroz ve frontotemporal lober dejenerasyonda önemli bir oyuncu olan transaktif yanıt DNA bağlayıcı protein 43 kDa'nın (TDP-43), otofagozom işaretleyici mikrotübül ile ilişkili proteinler 1A/1B hafif zincir 3B-II (LC3-II) ile zenginleştirilmiş EV'ler aracılığıyla, özellikle otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde, otofajiye bağlı bir şekilde salındığını göstermektedir.

LC3-II-pozitif EV'lerin oluşumu ve salınımının altında yatan mekanizmayı aydınlatmak için, hem hücre içi hem de hücre dışı LC3-II-pozitif vezikülleri değerlendirmek için erişilebilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak zorunludur. Bu çalışma, diferansiyel santrifüjleme yoluyla elde edilen hücresel ve EV fraksiyonlarında immünoblotlama yoluyla LC3-II seviyelerinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Otofagozom-lizozom füzyonunun bir inhibitörü olan Bafilomisin A1 (Baf), hücre içi ve hücre dışı LC3-II pozitif veziküllerin seviyelerini arttırmak için pozitif bir kontrol görevi görür. Tümör duyarlılık geni 101 (TSG101), multiveziküler cisimler için bir belirteç olarak kullanılır. Bu protokol uygulandığında, sporadik Creutzfeldt-Jakob hastalığı için genetik bir risk faktörü olan siRNA aracılı syntaxin-6'nın (STX6) yıkılmasının, TSG101 seviyeleri üzerinde önemli bir etki göstermezken, Baf ile tedavi edilen hücrelerin EV fraksiyonundaki LC3-II seviyelerini arttırdığı gösterilmiştir. Bu bulgular, STX6'nın, özellikle otofagozom-lizozom füzyonunun bozulduğu koşullar altında, EV'ler yoluyla LC3-II'nin hücre dışı salınımını negatif olarak düzenleyebileceğini düşündürmektedir. Otofajiyi değerlendirmek için yerleşik yöntemlerle birleştirildiğinde, bu protokol, LC3-II-pozitif EV'lerin oluşumu ve salınımında spesifik moleküllerin rolü hakkında değerli bilgiler sağlar.

Giriş

Transaktivasyon yanıtı DNA bağlayıcı protein 43 (TDP-43), tümü hücre sağkalımı^için hayati önem taşıyan, ekzon ekleme, gen transkripsiyonu ve mRNA stabilitesinin düzenlenmesinde rol oynayan, yaygın olarak eksprese edilen heterojen bir nükleer ribonükleoproteindir ^1,2. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve frontotemporal lober dejenerasyon (FTLD) gibi nörodejeneratif durumlarda, sitoplazmada anormal bir şekilde bir nükleer protein TDP-43 birikir. Bu kayma, çekirdekte TDP-43 fonksiyon kaybı ve sitoplazmada toksik bir fonksiyon kazancı ile sonuçlanır. TDP-43'ün patolojik birikimi, beynin ve omuriliğin belirli bölgelerinde başlar ve bu bölgelere prion benzeri bir şekilde yayılır, bu süreç hastalığın ilerlemesi ile yakından ilişkilidir³. Bununla birlikte, TDP-43 patolojisinin beyin ve omurilik yoluyla yayıldığı kesin mekanizma bilinmemektedir.

TDP-43, hücre dışı veziküller (EV'ler) yoluyla salgılanır ve ALS ve FTLD-TDP hastalarının plazma ve beyin omurilik sıvısında (BOS) yüksek TDP-43 seviyeleri tespit edilir ^4,5,6. ALS ve FTLD teşhisi konan hastalardan elde edilen BOS, insan glioma hücrelerinde hücre içi yanlış lokalizasyona ve endojen TDP-43'ün agregasyonuna^{neden olur 7}. Bu nedenle, EV'ler yoluyla hücre dışı olarak salınan TDP-43, TDP-43 patolojisinin hücreden hücreye yayılmasına aracılık edebilir.

Otofaji, istenmeyen maddelerin LC3 ile işaretlenen otofagozomlar olarak bilinen çift zarlı veziküller içinde muhafazasını içeren iyi korunmuş bir hücresel bozunma mekanizmasıdır. Bu otofagozomlar, lizozomal ilişkili zar proteini 1 (LAMP1) pozitif lizozomlarla birleşerek otolizozomlar (LC3 ^{+ /} LAMP1 ⁺) oluşturur ve içeriklerinin^bozulmasına yol açar 8. Histolojik analizler, inklüzyonları yutan otofagozomların sporadik ALS hastalarının^{nöronlarında} biriktiğini göstermektedir 9. Ailesel ALS ve FTLD-TDP'nin bazı nedensel genleri, otofajinin düzenlenmesi ile bağlantılıdır 10,11,12. Bu bulgular ALS ve FTLD-TDP hastalarında otofajinin baskılandığını göstermektedir.

Önceki çalışma, TDP-43'ün, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde otofagozom belirteci LC3-II için pozitif EV'ler yoluyla salgılandığını göstermiştir¹³. Otofaji-lizozom yolunun düzensizliği sadece TDP-43'ün hücre içi birikimine değil, aynı zamanda TDP-43'ün EV'ler¹⁴ yoluyla hücre dışı salınmasına da neden olabilir. Bununla birlikte, LC3-II pozitif EV'lerin nasıl salındığı ve bunun TDP-43 patolojisinin yayılmasında ne kadar önemli olduğu bilinmemektedir.

EV'ler, hücre yüzeyi tomurcuklanmasından üretilen büyük EV'ler (100 ila 1000 nm çapında) ve endozomal zarların endozomun iç kısmına doğru tomurcuklanmasından üretilen küçük EV'ler (50 ila 150 nm çapında) (eksozomlar olarak bilinir) ve Golgi aygıtı. Büyük ve küçük EV'leri ayrı ayrı toplamak için sıralı santrifüjleme gerçekleştiriyor ve peletleri sırasıyla 20.000 × g ve 110.000 × g'da santrifüjleme ile topluyoruz. P1 EV fraksiyonu (20.000 × g peletler) büyük EV'leri toplamak için hazırlanır ve P2 EV fraksiyonu (110.000 × g peletler) küçük EV'leri toplamak için hazırlanır¹⁵. İmmünoblotlama ile ardışık santrifüjlemeden türetilen büyük ve küçük EV'lerde LC3-II seviyelerini değerlendirme metodolojisi stabil ve tekrarlanabilirdir¹⁶. EV'lerde LC3-II seviyelerini analiz etmenin yanı sıra, otolizozom ve omegazom oluşumunu analiz etmek, otofajinin düzensizliğinin LC3-II pozitif EV'lerin salınmasına nasıl yol açtığının anlaşılmasını geliştirir. Burada, bu çalışma, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II pozitif EV'lerin salınmasında, taşıma veziküllerinin hedef membran^17'ye hareketini destekleyen bir SNARE proteini olan syntaxin 6'nın (STX6) baskılayıcı rolünü göstermektedir.

Protokol

1. HeLa hücrelerinin kültürlenmiş ortamından hücre, P1 ve P2 EV fraksiyonunun hazırlanması

1. HeLa hücrelerinin kültürlenmiş ortamından P1 ve P2 EV fraksiyonunun hazırlanması
   1. 1. Gün
      1. Hücreleri bir hücre sayacı kullanarak sayın ve DMEM Yüksek Glikoz,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin'den oluşan bir kültür ortamı içeren 6 cm'lik bir plaka üzerine 1 × 10^{6 hücre} tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
   2. 2. Gün (isteğe bağlı)
      1. 20 μM siRNA çözeltisi hazırlayın.
      2. Çözelti A'yı hazırlamak için 100 μL indirgenmiş serum ortamını ve 3 μL siRNA'yı düşük retansiyonlu bir tüpte karıştırın.
      3. Çözelti B'yi hazırlamak için 100 μL indirgenmiş serum ortamı ve 5 μL transfeksiyon reaktifini düşük retansiyonlu bir tüpte karıştırın.
      4. Çözelti A ve çözelti B'yi karıştırın, ardından karışımı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
      5. HeLa hücrelerini kültürlemek için kullanılan ortama A ve B çözeltilerinin karışımını ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
   3. 3. Gün
      1. Hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 5 dakika boyunca kontrollü nem ile 500 μL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın.
      2. Hücrelere 2,5 mL kültür ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için 200 μL'lik bir pipet ucu takılı bir Pasteur transfer pipeti kullanın.
      3. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve 10 cm'lik bir plakaya 1 ×^{10 6} hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
         NOT: İmmünoblotlama analizi için gerekli kültür ortamından EV'leri toplamak için en az 1 × 10⁶ hücre hazırlamak gerekir.
   4. 4. Gün
      1. Araç (DMSO) veya 100 nM Bafilomisin A1 (Baf) içeren kültür ortamını (bkz. adım 1.1.1.1) hazırlayın.
      2. Hücreleri araç veya 100 nM Baf içeren ortama maruz bırakın ve bunları 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
   5. 5. Gün
      1. Tüm kültür ortamını 10 cm'lik plakadan toplayın, 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını gidermek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin.
         NOT: 10 cm'lik plakada kalan hücreler bölüm 1.2.1'de kullanılacaktır.
      2. P1 EV fraksiyonunun izolasyonu için, 3.000 × g'da santrifüjlemeden sonra süpernatanı bir santrifüj tüpüne aktarın ve ardından 1 saat boyunca 4 ° C'de 20.000 × g'da santrifüjleyin.
      3. P2 EV fraksiyonunun izolasyonu için, 20.000 × g'da santrifüjlemeden sonra süpernatanı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve ardından 1 saat boyunca 4 ° C'de 110.000 × g'da santrifüjleyin.
      4. Tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendili ile sildikten sonra, santrifüjleme tüpünde kalan peletleri 50 μL 2x numune tamponunda [% 2.5 SDS, 125mM Tris-HCl tamponu (pH 6.8)% 30 gliserol,% 10 2-merkaptoetanol,% 0.4 Bromofenol Mavisi] P1 EV fraksiyonunu hazırlamak için.
      5. Süpernatanı boşaltarak çıkarın, tüpün içindeki fazla nemi bir laboratuvar mendiliyle silin ve ardından P2 EV fraksiyonunu hazırlamak için ultrasantrifüj tüpünde kalan peletleri 50 μL 2x numune tamponunda yeniden süspanse edin.
      6. P1 ve P2 EV fraksiyonlarını 100 °C'de bir ısı bloğu üzerinde 10 dakika inkübe edin.
         NOT: Santrifüjlemeden sonra 20.000 × g ve 110.000 × g'da santrifüjlemeden sonra kalan peletlerin yanlışlıkla atılmasını önlemek için tüpleri sallamayın. Süpernatanı aktarmak için tüpü eğdikten sonra, peletin kalan süpernatanın tekrar daldırılmasını önlemek için tüpün konumunu koruyun.
2. Kültürlenmiş HeLa hücrelerinden hücre fraksiyonunun hazırlanması
   1. 5. Gün
      1. Kültür ortamının 10 cm'lik plakadan 15 mL'lik bir tüpe aktarılmasından sonra, 10 cm'lik tabaktaki hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ve kontrollü nem ile 2 mL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın.
      2. Hücrelere 8 mL büyüme ortamı ekleyin, ardından hücreleri pipetlemek ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için 200 μL pipet uçlu bir Pasteur transfer pipeti kullanın.
      3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
      4. Süpernatanı bir aspiratör ile çıkarın, hücre peletine PBS ekleyin ve ardından 1.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      5. Bir aspiratör kullanarak PBS'yi çıkarın ve hücre peletini 1 mL A68 tamponunda [10 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.5, 0.8 M NaCl, 1 mM etilen glikol bis (β-aminoetil eter) -N, N, N, N-tetraasetik asit (EGTA)] % 1 sarkosil içerir.
      6. Bir BCA protein tahlil kiti kullanarak hücre lizatının protein konsantrasyonunu ölçün.
      7. 300 μL hücre lizatını 100 μL 4x numune tamponu ile karıştırın ve hücre fraksiyonunu hazırlamak için karışımı 100 °C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin.

2. İmmünoblotlama analizi

1. Numunelerdeki eşdeğer miktarda proteini SDS-PAGE¹⁸ ile ayırın.
2. Ayrılan proteinleri poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
3. Transferden sonra, membranları 20 dakika boyunca bloke edici ajan ile bloke edin.
4. RT'de %10 (h/h) buzağı serumu içeren Tris tamponunda belirtilen primer antikor ile tıkalı membranı gece boyunca inkübe edin.
5. Membranı Tris tamponu ile 5 saniye yıkayın ve ardından RT'de 2 saat boyunca biyotin konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.
6. Membranı Tris tamponu ile 5 saniye yıkayın ve ardından RT'deki kitten %0.4 (h/h) çözelti A ve çözelti B'yi içeren Tris tamponu ile 1 saat inkübe edin.
7. Membranı PBS ile yıkayın ve ardından bantların kolorimetrik tespiti için% 0.04 (a / h) diaminobenzidin,% 0.8 (a / h) NiCl₂ · 6H₂O ve% 0.3 (h / h) H₂O₂ içeren PBS ile inkübe edin.
   NOT: Sinyallerin tespiti için bir kemilüminesans yöntemi de kabul edilebilir.
8. Zarın görüntüsünü bir tarayıcı ile sayısallaştırın ve Fiji kullanarak dansitometri analizine tabi tutun.
   1. Fiji kullanarak sayısallaştırılmış görüntüyü açın ve RGB renkli görüntüyü Görüntü | Türü | 8 bit.
   2. Dikdörtgen aracına tıklayın ve şeritleri çevrelemek için sürükleyerek dikdörtgenin boyutunu ayarlayın. Analiz Et | Jeller | İlk şerit'i seçin.
   3. Dikdörtgeni ikinci ve sonraki bantların üzerine yerleştirin ve Analiz Et | Jeller | Sonraki Şerit'i seçin.
   4. Son bandı tanıdıktan sonra, Analiz Et | Jeller | Şeritleri çizin.
   5. Bandın sinyal alanını düz bir çizgi ile çevreleyin, değnek aracına tıklayın ve bandın sinyal yoğunluğunu hesaplamak için alana tıklayın.

3. Otofagozom ve otolizozom sayısının analizi

1. 1. Gün
   1. Bir hücre sayacı kullanarak HeLa hücrelerinin sayısını sayın ve 3,5 cm'lik bir tabakta LAMP1-GFP ve mCherry-LC3 eksprese eden 1 ×^{10 5} HeLa hücresi tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
2. 2. Gün (isteğe bağlı)
   1. 3,5 cm'lik tabaklarda bölüm 1.1.2'de açıklanan adımları gerçekleştirin.
3. 3. Gün
   1. Kültür ortamını 3,5 cm'lik tabaklardan atın.
   2. Hücreleri PBS ile yıkayın, 400 μL% 0.25 tripsin ve 1 mM EDTA çözeltisine maruz bırakın ve% 5 CO₂ ve kontrollü nem ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   3. Hücrelere 1.6 mL büyüme ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için bunları bir Pasteur transfer pipeti ile pipetleyin.
   4. Hücre sayacını kullanarak hücre sayısını sayın ve 8 odacıklı bir lamel üzerine 1 × 10⁴ hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
      NOT: Odacıklı lamel iki kuyusu, bölüm 3.4.2'de açıklandığı gibi DMSO veya Baf muamelesini takiben sırasıyla kontrol ve STX6 knockdown hücreleri için hazırlanır.
4. 4. Gün
   1. Fenol kırmızısı içermeyen büyüme ortamını hazırlayın (Fenol Kırmızısı içermeyen DMEM,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin), her iki araç (DMSO) veya DMSO'da çözünmüş 100 nM Baf içerir.
   2. Kültür ortamını, araç veya 100 nM Baf içeren fenol kırmızısı içermeyen ortamla değiştirin ve 4 saat inkübe edin.
      NOT: Baf'ın otofagozom ve otolizozom sayıları üzerindeki etkisini değerlendirmek için, araçla tedavi edilen hücreleri kontrol olarak hazırlayın.
   3. Gözlemden önce çekirdekleri 30 dakika boyunca 0.33 μg / mL Hoechst 33342 ile boyayın.
   4. Konfokal lazer mikroskobunda 60x objektif lens kullanarak Canlı hücre görüntüleme yapın ve on farklı kare yakalayın.
      1. RGB birleştirilmiş görüntüyü Fiji'de açın ve Görüntü | Renk | Kanalları Böl.
      2. Her görüntüdeki kırmızı ve yeşil sinyaller için sabit bir eşik ayarlayın tıklayarak Görüntü | Ayarla | Her deney için eşik .
      3. Analiz Et | Parçacıkları analiz edin. Özet kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın. Otofagozom ve lizozomla ilişkili vezikülleri tanımlamak için Sayım'daki değerleri kaydedin.
      4. Yeşil görüntüyü kırmızı görüntünün üzerine bindirmek için, Düzenle | Yapıştırma Kontrolü. Yeşil görüntüyü kopyalayın ve ardından hem kırmızı hem de yeşil sinyaller için pozitif olan alanları vurgulayarak birleştirmek için kırmızı görüntünün üzerine yapıştırın.
      5. Otolizozom sayılarını tanımlamak için, Analiz Et | Parçacıkları analiz edin. Özet kutusunu işaretleyin, Tamam'a tıklayın ve otofagozomlar ve lizozomlarla ilişkili vezikülleri tanımlamak için Sayı bölümündeki değerleri kaydedin.
   5. Hücre başına otolizozom ve otofagozom sayısını hesaplamak için toplam otolizozom ve otofagozom sayısını toplam hücre sayısına bölün.
      NOT: Üç bağımsız deneyin her birinde en az 35 hücre sayın.

4. Omegazom oluşumu için analiz

1. 1. Gün
   1. Bir hücre sayacı kullanarak HeLa hücrelerinin sayısını sayın ve 3,5 cm'lik bir tabağa 1 ×^{10 5} hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
2. 2. Gün (isteğe bağlı)
   1. Bölüm 1.1.2'de açıklanan adımları gerçekleştirin.
3. 3. Gün
   1. Adım 3.3.1-3.3.2'de açıklandığı gibi tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
   2. Hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve 3,5 cm'lik bir tabakta 1 × 10⁵ hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
4. 4. Gün
   1. Düşük retansiyonlu bir tüpte 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL DNA transfeksiyon reaktifi ve 100 μL indirgenmiş serum ortamını karıştırın. Karışımı 20 dakika inkübe edin, ardından kültürlenmiş ortama ekleyin.
   2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
5. 5. Gün
   1. Hücreleri adım 3.3.1-3.3.2'de açıklandığı gibi tripsinize edin.
   2. Hücrelere 2.5 mL büyüme ortamı ekleyin. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için karışımı bir Pasteur transfer pipeti kullanarak pipetleyin.
   3. Hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve 8 odacıklı bir lamel üzerine 1 × 10⁴ hücre tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 24 saat boyunca kontrollü nem ile inkübe edin.
6. 6. Gün
   1. Konfokal lazer mikroskobu kullanarak adım 4.5.3'ten itibaren hücrelerin canlı hücre görüntülemesini yapmak için 3.4.1-3.4.4 adımlarını izleyin. On farklı görüntü karesi yakalayın.
      1. RGB birleştirilmiş görüntüleri ilgili kırmızı, yeşil ve mavi görüntü bileşenlerine bölmek, her görüntüdeki yeşil sinyaller için sabit bir eşik ayarlamak ve GFP sinyal yoğunluğunu belirlemek için 3.4.4.1-3.4.4.3 adımlarını izleyin. GFP-ATG13'ün sinyal yoğunluğunu belirlemek için Toplam Alan bölümündeki değerleri kaydedin.
      2. Hücre başına sinyal yoğunluğunu hesaplamak için toplam sinyal yoğunluğunu incelenen hücre sayısına bölün.
         NOT: Üç bağımsız deneyin her birinde en az 34 hücre sayın.

Sonuçlar

Önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, Baf tedavisi TSG101 (P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, EZR^19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) ve LC3-II (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR^19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) EV açısından zengin fraksiyonda. Özellikle, Baf tedavisi ayrıca EV fraksiyonundaki STX6 seviyelerini de arttırdı (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR^19'da iki yönlü ANOVA ile beli...

Tartışmalar

İmmünoblotlama çalışmasında hücresel fraksiyonda LC3-II ve TSG101 seviyeleri, mikrovezikülden zengin P1 EV fraksiyonu ve eksozomdan zengin P2 EV fraksiyonu ortaya çıktı. Otofagozomları, otolizozomları ve omegazomları incelemek için canlı hücre görüntüleme kullanıldı ve STX6 yıkımının otofajiyi etkileyip etkilemediğine dair fikir verdi. Bu birleşik sonuçlar, STX6 yıkımının, potansiyel olarak otofaji yolunun düzensizliği ile bağlantıl?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	a material for sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	a material for DAB solution
3.5 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Dish	TrueLine	TR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	inhaling solution
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	2nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	2nd antibody for immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	a material for immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	a material for sample buffer solution
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	cell counting
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	vehicle
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	culture medium
DMEM without Phenol Red	Nacalai Tesque	08489-45	culture medium
EGTA	Dojindo	348-01311	a material for A68 solution
Excel	Microsoft	version 16.16.27	satistical analysis
EZR	Reference No. 24	version 1.68	satistical analysis
FBS	Sigma	173012	Culture medium
Fiji	NIH		Image analysis tool
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	a material for sample buffer solution
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hydrogen Peroxide	Fujifilm Wako	080-0186	a material for DAB solution
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	cleaning wipe
Low Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser Microscope	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody	MBL	M186-3	1st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate	Fujifilm Wako	149-01041	a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Culture medium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody	BioAcademia	70-080	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody	ProteinTech	10841-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody	ProteinTech	28283-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody	ProteinTech	20986-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Milliore	IPVH00010	a material for immunoblotting
R	R development core team	version 4.4.1	satistical analysis
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfection reagent
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA for transfection
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	a material for Tris buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	a material for sample buffer solution
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer	Bio-Rad	1450109J1	cell counting
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfection reagent
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
Wash Bottle	As One	1-4640-02	washing membrane
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806