Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מיקרו-בועות שומן ושיטת תיוג רדיו מיקרו-בועות תואמת בסיר אחד עם יעילות תיוג של >95% ללא טיהור המשמרת תכונות פיזיקוכימיות של מיקרו-בועות. שיטה זו יעילה על פני ניסוחים מגוונים של מיקרו-בועות שומנים וניתן להתאים אותה ליצירת מיקרו-בועות רדיואקטיביות ו/או פלואורסצנטיות.

Abstract

מיקרו-בועות הן חלקיקים בעלי מעטפת שומנים ומלאי גז שהתפתחו מחומרי ניגוד אולטרסאונד כלי דם לפלטפורמות מהפכניות לטיפול בסרטן. בשילוב עם אולטרסאונד ממוקד טיפולי (FUS), הם יכולים להתגבר בבטחה ובאופן מקומי על מחסומים פיזיולוגיים (למשל, מחסום דם-מוח), לספק תרופות לסרטן בלתי נגיש אחרת (למשל, גליובלסטומה וסרטן הלבלב), ולטפל במחלות ניווניות. הארסנל הטיפולי של מיקרו-בועות-FUS מתקדם לכיוונים חדשים, כולל רדיותרפיה משולבת סינרגטית, הדמיה רב-מודאלית וטעינה ואספקה של תרופות הכל-באחד מקליפות מיקרו-בועות.

תיוג מיקרו-בועות עם רדיו-טרסרים הוא המפתח לביסוס יכולות תרנוסטיות מורחבות אלה. עם זאת, אסטרטגיות תיוג רדיו קיימות של מיקרו-בועות מסתמכות על מתודולוגיות טיהור הידועות כמשבשות את התכונות הפיזיקוכימיות של מיקרו-בועות, משתמשות ברדיואיזוטופים קצרי מועד ולא תמיד מניבות כלציה יציבה. באופן קולקטיבי, זה יוצר אי בהירות סביב הדיוק של הדמיית רדיו מיקרו-בועות ויעילות העברת רדיואיזוטופים של גידול.

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית תיוג מיקרו-בועות חדשה בסיר אחד וללא טיהור השומרת על תכונות פיזיקוכימיות של מיקרו-בועות תוך השגת יעילות כלציה רדיואיזוטופית של >95%. הוא רב תכליתי וניתן ליישם אותו בהצלחה על פני פורמולציות מיקרו-בועות מותאמות אישית ומסחריות עם אורך שרשרת שומני אציל שונה, מטען והרכב כלטור/בדיקה (פורפירין, DTPA, DiI). ניתן ליישם אותו באופן אדפטיבי במהלך ייצור מיקרו-בועות טחון ועל ניסוחי מיקרו-בועות מוכנים מראש עם התאמה אישית מודולרית של פלואורסצנציה ותכונות פלואורסצנטיות/רדיואקטיביות רב-מודאליות. בהתאם לכך, שיטה גמישה זו מאפשרת ייצור של מיקרו-בועות רב-מודאליות מותאמות אישית וניתנות למעקב (רדיו, פלואורסצנט או רדיו/פלואורסצנטי פעיל) שימושיות לקידום יישומים מכניסטיים, הדמיה וטיפוליים של מיקרו-בועות FUS.

Introduction

מיקרו-בועות הן חומרים תרנוסטיים סופרמולקולריים בגודל מיקרוני עם ליבת גז המיוצבת על ידי חלבון, פולימר, או, ברוב המקרים, מעטפת ליפידים (איור 1A). כאשר מוזרקים לזרם הדם, מיקרו-בועות שומרות על ממשקי גז/נוזל הניתנים לזיהוי על ידי אולטרסאונד למשך מסגרות זמן של דקות לפני פירוק ליבות הגז שלהן 1,2. כתוצאה מכך, השימוש הקליני הראשון במיקרו-בועות היה כחומרי ניגוד הדמיית אולטרסאונד בזמן אמת3. המצאת האולטרסאונד הממוקד הטיפולי (FUS) הרחיבה את השירותים הקליניים של מיקרו-בועות. כאשר מגורים על ידי FUS בתדר נמוך, מיקרו-בועות מתנדנדות ויוצרות כוחות מכניים ממוקדים וניתנים לכוונון החל מחדירות כלי דם חולפת ועד אבלציה של רקמות מוקד 4,5. כתוצאה מכך, במהלך 20 השנים האחרונות, מיקרו-בועות FUS נחקרו לפתיחת מחסום דם-מוח (BBB), גידול (למשל, סרטן גרורתי בלבלב, מוח וכבד) מתן תרופות ובדיקות הדמיה, טיפול במחלות ניווניות ואבלציה של סרטן 6,7,8,9,10,11.

הארסנל התרנוסטי של מיקרו-בועות ממשיך להתקדם לכיוונים חדשים ומרגשים. יישומי אספקת מיקרו-בועות FUS קונבנציונליים מסתמכים על ניהול משותף של מטען טיפולי או הדמיה לצד מיקרו-בועות מסחריות. יש עניין הולך וגובר בשיפור יכולות האספקה של מיקרו-בועות-FUS על ידי הבנת אינטראקציות של מעטפת מיקרו-בועות/ביולוגיות, חקר ניסוחים של מיקרו-בועות לא מסחריות בהתאמה אישית, ויצירת מיקרו-בועות תרנוסטיות הכל-באחד עם מטען טעון ישירות על מעטפת המיקרו-בועות 12,13,14. למעשה, כ-40% ממחקרי אספקת תרופות מיקרו-בועות שומנים עושים שימוש במיקרו-בועות כאלה15. מעבר להדמיה ואספקת תרופות, מיקרו-בועות-FUS הראה גם הבטחה בשיפור הרדיותרפיה לסרטן16, והפעלת השפעות אנטי-ניאופלסטיות של חומרים שפירים טעונים במעטפת באמצעות טיפול סונודינמי 17,18.

ניתן לקדם את הכיוונים הקונבנציונליים והמורחבים הללו ביישומי סרטן מיקרו-בועות מבחינה אסטרטגית על ידי תיוג פגזי מיקרו-בועות עם עוקבים רדיואקטיביים. בתחום המיקרו-בועות העמוסות במטען הכל-באחד, תיוג רדיו כזה 1) מאפשר הערכה כמותית בתקן זהב של ההפצה הביולוגית על המטרה ומחוצה לה של קליפות המיקרו-בועות הטעונות הללו, 2) גוזר קשרי מבנה-פעילות פרמקוקינטיים המודיעים על בחירה אופטימלית של קומפוזיציות מיקרו-בועות כדי למקסם את האספקה על המטרה, ו-3) מנחה יישום אסטרטגי ומתאים מונחה תמונה ותכנון טיפול (למשל, סוגי מטרות רקמות, דוזימטריה, בחירת תרופות להפחתת חששות בטיחות מחוץ למטרה, תועלת בהשוואה לפרדיגמות קונבנציונליות של טיפול משותף) של מערכות עמוסות מטען הכל באחד15,19. בשלב פרה-קליני, הבנה כזו של גורל מעטפת מיקרו-בועות יכולה גם להאיר מנגנוני פעולה רחבים יותר של מיקרו-בועות-FUS. לדוגמה, הוכח כי העברת שומנים מקליפות מיקרו-בועות לתאי מטרה משפיעה על סונופורציה התומכת ב-FUS12,20. הבנה ואופטימיזציה של העברה כזו יכולה אפוא ליידע טיפולים פרה-קליניים וקליניים במיקרו-בועות FUS בהם מעורב סונופורציה (טרנספקציה במבחנה, מתן תרופות, אבלציה של גידול, רגישות לקרינה וטיפול סונודינמי 20,21,22,23,24,25 ). מתקני אולטרסאונד והדמיית רדיו כפולים יאפשרו גם פתיחת כלי דם FUS וניטור טיפול (למשל, קינטיקה של פתיחת BBB) מסוכן יחיד ולא מעיצובים קונבנציונליים של סוכן כפול26. באותו אופן, תיוג רדיו של מיקרו-בועות ליפידים יכול לשמש כחלופה הכל-באחד של מיקרו-בועות-FUS/רדיותרפיה לפלטפורמות אספקה משותפת של מיקרו-בועות-FUS + רדיו-פרמצבטיקה27.

השבריריות של מיקרו-בועות היא אתגר לא טריוויאלי לתיוג כזה. כל אסטרטגיות תיוג הרדיו הקיימות מוגבלות על ידי מתודולוגיות טיהור הידועות כמפריעות ליציבות וגודל המיקרו-בועות, בעוד שחלקן כוללות גם תיוג רדיו לא יעיל ולא יציב 28,29,30,31,32. דרישות הטיהור מובילות גם לפרוטוקולים ארוכים יותר. בשילוב עם השימוש ברדיואיזוטופים קצרי חיים (למשל, 18F t1/2 1.8 שעות, 28,29 99mTct 1/2 6 שעות, 3268Ga t1/2 1 h31), זה יוצר חוסר יעילות הקשור לדעיכה רדיואיזוטופית ומגביל את הדמיית הרדיו ותכנון הטיפול. באופן קולקטיבי, מגבלות אלה מסתכנות ברכישת הדמיה רדיואקטיבית מקוצרת ולא מייצגת, נתונים פרמקוקינטיים לא מדויקים ואספקה רדיואיזוטופית לא יעילה של גידול.  

בדוח זה, מגבלות אלו מתגברות על ידי מינוף יכולות הקלציה המתכתיות החזקות והיציבות של פורפירין. פורפירינים הם מקרומולקולות אורגניות, הטרוציקליות עם טבעת מישורית מצומדת מאוד ואתר תיאום מרכזי שיכול להכיל מגוון מתכות. זה כולל רדיואיזוטופים בעלי חיים ארוכים יותר כגון נחושת-64 (t1/2 12.7 שעות), רדיו-פרמצבטיקה עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), ויכולת ספירת γ33. כאשר הם מצומדים לעמוד שדרה של שומנים, ניתן לשלב פורפירינים בקלות במבנים סופרמולקולריים ולאחר מכן לתייג אותם בנחושת-64 במהירות, יעילות כלציה גבוהה ויציבות סרום, תוך שמירה על תכונות החלקיקים הלא מסומנים33,34. יתר על כן, פורפירינים פעילים באופן פלואורסצנטי עם כיבוי עצמי מודולרי בננו ומיקרו-חלקיקים המשוחזר עם שיבוש חלקיקים; קריאה משלימה ל-PET וספירת γ המאפשרת ניתוח גורל מעטפת בתפזורת ומיקרוסקופית (איור 1A)15.

על ידי שימוש בפורפירין-ליפיד ככלטור, תכונות אלה נוצלו ליצירת מתודולוגיית תיוג רדיו חדשה של מיקרו-בועות בסיר אחד וללא טיהור (איור 1B,C) המתגברת על מגבלות הקשורות לשיטות תיוג רדיו קיימות של מיקרו-בועות. פרוטוקול זה משיג יעילות כלציה של >95% נחושת-64, אינו דורש טיהור לאחר התיוג ושומר על תכונות פיזיקוכימיות של מיקרו-בועות. ניתן לשלב אותו בקלות בייצור "טחון" של מיקרו-בועות שומן לפני הפעלתן (איור 1B). הוא רב תכליתי וניתן ליישם אותו בהצלחה על פני פורמולציות מיקרו-בועות מותאמות אישית ומסחריות עם אורך שרשרת שומני אציל שונה (C16 עד C22), מטען (ניטרלי ואניוני) והרכבי פורפירין-ליפידים (1 מול%, 10 מול%, 30 מול%), ויוצר מיקרו-בועות עם פעילות רדיו ופלואורסצנטיות כאחד. יכולת ההסתגלות שלו יכולה להתרחב גם מעבר לפורפירין. ניתן לשנות את פרוטוקול הסיר האחד כך שישתמש בכלאטורים חלופיים הזמינים מסחרית (למשל, דיאתילאנטריאמין פנטאצטט (DTPA)-ליפיד) ופלואורופורים (למשל, DiI). ניתן גם לשנות אותו כדי לתייג פורמולציות מיקרו-בועות מוכנות מראש באמצעות גישת "זינוק". בהתאם לכך, שיטה זו מאפשרת ייצור של מיקרו-בועות מותאמות אישית (רדיו, פלואורסצנט או רדיו/פלואורסצנטי כפול פעיל) שימושיות לקידום יישומים מכניסטיים, הדמיה וטיפוליים של מיקרו-בועות-FUS. הפרוטוקול שלהלן מתאר את הייצור של מיקרו-בועות שומנים, יישום פרוטוקול תיוג הרדיו בסיר אחד, תיוג רדיו נדרש ואפיון תכונות פיזיקוכימיות, ושינויים פוטנציאליים.

figure-introduction-7403
איור 1: פרוטוקול ייצור מיקרו-בועות ותיוג רדיו. (A) פורפירין-ליפיד, בצורה של pyropheophorbide-a-lipid, משמש ככלאטור רב-מודאלי בתוך פרוטוקול זה. כמונומר כלאט לנחושת-64 (i), יש לו יכולות PET והדמיה. הקרינה שלו מרווה בצורת חלקיקים (מיקרו-בועות (ii) וננו-צאצאיהם לאחר הפירוק (iii)) ואינה נכבית עם שיבוש חלקיקים (iv). (ב) פרוטוקול הידרציה/הפעלה של סרט שומנים המתואר בדוח זה ליצירת מיקרו-בועות שומן מהקרקע ו-(ג) שילוב של תיוג רדיו בסיר אחד בין היווצרות תרחיף שומנים להפעלת מיקרו-בועות. נתון זה הותאם באישור של Rajora et al.15. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. הכנות של ריאגנטים

  1. הכן מאגר אמוניום אצטט (0.1 M, pH 5.5)
    1. בעזרת איזון אנליטי, שקלו 770.8 מ"ג אמוניום אצטט על נייר משקל. מעבירים את הכמות השקולה לכוס זכוכית נקייה של 250 מ"ל.
    2. הוסף לכוס 90 מ"ל מים מזוקקים כפולים (ddH2O), הנמדדים באמצעות פיפטה מדורגת. הוסיפו מוט ערבוב והניחו את הכוס על צלחת ערבוב מגנטית כדי להמיס את האמוניום אצטט. מערבבים במהירות שיוצרת מערבולת קלה אך ללא התזת תמיסה.
    3. כיול מד pH על פי הוראות המכשיר תוך שימוש בתקנים של pH 4 ו-7. לאחר הכיול, הכנס את בדיקת ה-pH למאגר האמוניום אצטט.
    4. מוסיפים לתמיסה 104 מיקרוליטר של חומצה אצטית, מערבבים להמסה ומודדים את ה-pH.
      הערה: ה-pH צריך להיות קרוב ל-5.5 בשלב זה.
    5. התאם את ה-pH של המאגר על ידי הוספת 10 N נתרן הידרוקסיד (או חומצה הידרוכלורית אם המאגר הופך בסיסי מדי) במרווחים של 5-10 מיקרוליטר באמצעות מיקרופיפטה. מערבבים, מודדים את ה-pH וחוזרים על הפעולה לפי הצורך. רשום את נפח הבסיס/חומצה שנוספה.
    6. הוסף מספיק נפח של ddH2O כדי ליצור סך של 100 מ"ל של מאגר.
      הערה: לדוגמה, אם נעשה שימוש ב-45 מיקרוליטר של 10 N נתרן הידרוקסיד במהלך התאמת ה-pH, 9.851 מ"ל של ddH2O יתווספו לכוס (100 מ"ל [נפח יעד] - 90 מ"ל [שלב 1.1.2] - 0.104 מ"ל [שלב 1.1.4] - 0.045 מ"ל [שלב 1.1.5] = 9.851 מ"ל).
    7. מערבבים היטב את המאגר פעם אחרונה לפני העברתו למיכל אחסון עם מכסה.
    8. נקה את מד ה-pH לפי הוראות המכשיר.
      זהירות: נתרן הידרוקסיד מימי מרוכז וחומצה הידרוכלורית עלולים לגרום לתגובות עור ויש לטפל בהם באמצעות כפפות.
  2. הכן מאגר הידרציה (PGG)
    1. שאפו מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) למזרק וציידו את הקצה במסנן מזרק פוליאתרסולפון בגודל נקבוביות 0.2 מיקרומטר. מסננים את ה-PBS לצינור צנטריפוגה מפלסטיק נקי עם מכסה.
      הערה: ניתן להשתמש במסנני מזרק נקבוביות של 0.2 מיקרומטר של חומרי ממברנה חלופיים (למשלample, פוליווינילידן פלואוריד) כל עוד הממברנה תואמת ל-PBS ואמוניום אצטט.
    2. שלב PBS מסונן, פרופילן גליקול וגליצרול באמצעות מיקרופיפטה ביחס נפחי של 8:1:1 כדי ליצור את מאגר ההידרציה (המכונה גם PGG). בעת הוספת פרופילן גליקול וגליצרול, שאפו ונגבו את כל הטיפות הנותרות של פרופילן גליקול או גליצרול מפני השטח של קצה הפיפטה לפני הזרמת המגיב לאט לתוך ה-PBS. עכירות צמיגה ברורה דמוית חוט תיראה ב-PBS.
      הערה: מומלץ להשתמש במיקרופיפטה p1000 כדי להוסיף תחילה PBS לצינור צנטריפוגה, ואחריו פרופילן גליקול וגליצרול, מכיוון ששני הריאגנטים האחרונים צמיגים. ככאלה, יש לשאוב אותם לאט דרך המיקרופיפטה עד שלא נראית עוד תנועת נוזל בקצה הפיפטה וכך שלא ייספג אוויר כאשר קצה הפיפטה מוסר מהמגיב . באופן אידיאלי יש להשתמש בקצות מיקרופיפטה עם סימונים נפחיים לבחירת נפחי ריאגנטים המתאימים לסימונים כאלה (לדוגמה, ביצוע 1 מ"ל או 5 מ"ל PGG, ובהתאמה שימוש בסימון של 0.1 מ"ל או 0.5 מ"ל על קצה המיקרופיפטה כדי לדמיין שאיפה מלאה של פרופילן גליקול וגליצרול). בעת ניגוב פני השטח של קצה המיקרופיפטה, אין לנגב בפתח הקצה, אלא רק בצדדים.
    3. פיפטה למעלה ולמטה עם קצה הפיפטה בתמיסה עד שהריאגנטים מומסים בצורה הומוגנית. היזהר לא להכניס בועות אוויר לתמיסה.
    4. כדי להבטיח עוד יותר תערובת שלמה של מאגר ההידרציה, יש לכסות את צינור הצנטריפוגה ולסובב למעלה ולמטה לאט. אין מערבולת.
    5. סובב את הצינור בפחות מ-1000 x גרם למשך 20-30 שניות (טמפרטורה מינימלית 4 מעלות צלזיוס, מקסימום RT) כדי להסיר בועות אוויר בלתי ניתנות לצפייה.
  3. הכן מאגר הידרציה/תיוג רדיו (AA-PGG)
    1. מסנן מזרק 0.1 M, מאגר אמוניום אצטט pH 5.5 (משלב 1.1), ו-PBS לצינורות נפרדים לפי שלב 1.2.1.
    2. שלב מאגר אמוניום אצטט מסונן, PBS מסונן, פרופילן גליקול וגליצרול באמצעות מיקרופיפטה p1000 לתוך צינור צנטריפוגה במאגר אמוניום אצטט 5:3:1:1: PBS: פרופילן גליקול: יחס נפחי גליצרול בסדר הרשום. עקוב אחר הוראות השאיפה, הערבוב והצנטריפוגה לפי שלבים 1.2.2-1.2.5 להכנת AA-PGG.
  4. חומר כרומטוגרפיה מיידי בשכבה דקה (iTLC)
    1. שוקלים עד 0.1 גרם של חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ומעבירים לבקבוקון מכוסה. יש להמיס ב-ddH2O כך שתיווצר תמיסה של 2% w/v של EDTA (לדוגמה, עבור 50 מ"ג של EDTA, הוסף 2.5 מ"ל של ddH2O).
    2. שלב את תמיסת ה-EDTA של 2% w/v עם מאגר האמוניום אצטט משלב 1.1 ביחס של 9:1 v/v (90% תמיסת EDTA, 10% מאגר אמוניום אצטט). מכסה ואחסן את חומר ה-iTLC המתקבל.

2. היווצרות סרטי שומנים

הערה: הליך זה מתאר את היווצרות סרט השומנים עם קומפוזיציות המחקות את המיקרו-בועה המסחרית, Definity®, כאשר פורפירין-ליפיד מחליף את השומן המארח ומהווה 30 מול% מכלל השומנים. עם זאת, ניתן ליישם את פרוטוקול תיוג הרדיו על פורמולציות שומנים מגוונות (אורכי שרשרת C16, C18, C22, מטען ניטרלי או אניוני, קומפוזיציות טוחנות פורפירין-ליפידים משתנות). מצורף גיליון אלקטרוני משלים (קובץ משלים 1) המספק חישובים, הרכבים, מסות ונפחי מלאי עבור הניסוחים המתוארים ואחרים. כל השומנים זמינים מסחרית למעט הפורפירין-ליפיד, פירופופורביד-א-ליפיד (פירו-ליפיד), שהסינתזה שלו תוארה בעבר בפירוט35,36.

  1. באמצעות קובץ משלים 1, קבע את המסה הכוללת הדרושה לכל ליפיד על סמך מספר הסרטים הנדרשים.
  2. שקלו בקבוקון זכוכית ריק של 0.5 דראם על איזון אנליטי.
    הערה: אבק מפריע להיווצרות מיקרו-בועות מוצלחת. לפיכך, נשפו אוויר בלחץ לתוך הבקבוקון כדי להסיר אבק/חלקיקים אם הם מאוחסנים ללא מכסה.
  3. שקלו 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) על נייר משקל.
    הערה: יש לקבל את המסה שנשקלה משלב 2.1 בתוספת 0.5-1 מ"ג נוספים כדי להסביר כל אובדן במהלך הטיפול בדגימה בשלבים מאוחרים יותר.
  4. העבירו את ה-DPPC לבקבוקון הזכוכית השקול ושקלו אותו מחדש כדי לקבוע את מסת השומנים בבקבוקון. תהליך זה מאפשר העברת שומנים קלה יותר לבקבוקון הזכוכית, הפחתת אובדן/שפיכת אבקת שומנים ומדידה מדויקת יותר של מסת השומנים.
  5. חזור על שלבים 2.2 עד 2.4 עם השומנים האחרים: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(פוליאתילן גליקול)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (DPPA) ו-C16 pyro-lipid.
    הערה: אם פירו-ליפיד אינו זמין בצורת אבקה הניתנת לשקילה אלא כסרט או אליקוט בכמות לא ידועה, ניתן להמיס אותו בכלורופורם ליצירת מלאי שניתן לחשב את ריכוזו באמצעות מדידות ספיגת UV-Vis במתנול באמצעות חוק באר-למברט כפי שתואר קודם לכן35.
  6. הכן את הממיסים והתמיסות האורגניים הבאים במבחנות זכוכית באמצעות מיקרופיפטות או מזרקי זכוכית: 1) כלורופורם, 2) 9:1 v/v כלורופורם: מתנול, ו-3) 65:35:8 כלורופורם: מתנול: ddH2O. לאחרון, פיפטה את הרכיבים וערבב אותם בסדר הבא: ddH2O, מתנול ואז כלורופורם.
    זהירות: מתנול וכלורופורם הם סכנות בריאותיות, דליקים ונדיפים. ללבוש מגן עיניים, כפפות וחלוק מעבדה, ולהשתמש במכסה אדים.
  7. השתמש בקובץ המשלים 1 כדי לחשב את נפח הממס/תמיסה האורגנית הדרושה לייצור מלאי שומנים ולבחור מזרקי זכוכית בנפחים מתאימים.
    הערה: נפח זה אמור להניב ריכוזי מלאי התואמים לנפחי מלאי של 15-100 מיקרוליטר לסרט הניתנים למדידה בקלות באמצעות מזרקי מיקרוליטר זכוכית של 25-100 מיקרוליטר.
  8. שוטפים את מזרקי הזכוכית שלוש פעמים עם כלורופורם. שאבו את הבוכנה קדימה ואחורה כדי לייבש את המזרק.
  9. מדוד והוסף את הממס/תמיסות האורגניות באמצעות מזרק הזכוכית הנקייה לבקבוקוני השומנים הבודדים לפי חישובי הגיליון האלקטרוני בשלב 2.7 ליצירת מלאי שומנים. ממיסים פירו-ליפיד בכלורופורם (אלא אם כן כבר מומס לפי הערת שלב 2.5), DPPC ו-DPPE-mPEG בכלורופורם 9:1 v/v: מתנול ו-DPPA ב-65:35:8 כלורופורם:מתנול:ddH2O. אם משתמשים באותו מזרק זכוכית לכל התוספות, יש לשטוף ולייבש בין כל שמן.
    הערה: אם הפורמולה הנבחרת אינה מכילה DPPA או גרסת אורך שרשרת C18 שלה, ניתן להמיס פירו-ליפיד, ליפיד PC מארח ושומן PEG בכלורופורם.
  10. מכסים את הבקבוקונים והמערבולת.
  11. הוסף כמויות מחושבות של תמיסות ליפידים במלאי לבקבוקון זכוכית חדש של 0.5 דראם (בקבוקון פילם) באמצעות מזרק מיקרוליטר זכוכית. עבור ציר השומנים הראשון, הכנס את קצה המחט למרכז התחתון של הבקבוקון וצלול לאט כדי למנוע התזת דפנות הבקבוקון. לתוספות הבאות, הנח את קצה המחט ישירות מעל מפלס הנוזל וגע בצד הבקבוקון כדי להסיר טיפות אחרונות באופן שלא יחשוף את המחט לנוזל שמתחת.
    הערה: יש לשטוף ולייבש את מזרק הזכוכית בין תוספות שומנים כאשר מתרחש זיהום. אם מייצרים מספר סרטים, כסו גם את הסרט וגם את בקבוקוני המלאי בין התוספות כדי למזער את אידוי הממס.
  12. סובב בעדינות את הבקבוקון באופן ידני במצב זקוף כדי לערבב את התכולה. הימנע מלהתיז כל תמיסה על דפנות הבקבוקון.
  13. הסר את המכסה (אחסן את המכסה) והכנס קו חנקן לחלל הראש של הבקבוקון. התאם את זרימת החנקן כך שתגרום להפרעה גלויה קלה על פני הנוזל אך ללא כל משפך או התזה.
  14. מערבולת את הבקבוקון מיד לאחר החדרת קו החנקן. התחל במהירות נמוכה המספיקה ליצירת משפך עם ממס העולה לא יותר מ -1 ס"מ מתחתית הבקבוקון. הימנע מהתזת ממסים. כאשר הממס מתאדה, הגדל את מהירות המערבולת לאט וללא הפסקה, תוך שמירה על גובה הממס עד שכל הנוזלים מתאדים. התוצאה תהיה סרט דק המצופה על פני השליש התחתון של הבקבוקון.
  15. הנח את הבקבוקון בחומר ייבוש המצויד בוואקום והמשיך לייבש את הסרט בוואקום למשך 8-72 שעות. מכסים את הבקבוקון (למעט הפתח) או את המייבש בנייר אלומיניום.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. את השלבים הבאים ניתן לבצע לאחר ייבוש הסרט, או לאחסן את הסרטים מתחת לארגון, אטומים בפרפילם, במקפיא של -20 מעלות צלזיוס עד חודש, ויותר אם הם נשמרים יבשים.

3. הידרציה של סרט שומנים

הערה: אם משתמשים במיקרו-בועות במבחנה או ב-vivo, השתמש בקצות מיקרופיפטות סטריליות, צינורות, מזרקים ומחטים עבור שלבים 3.3 עד 5.4 אלא אם כן צוין אחרת.

  1. הסר את הסרט מהוואקום או, אם הוא מאוחסן במקפיא, אפשר לו להתחמם ל-RT.
  2. ממלאים של 250 מ"ל במים ומחממים את המים ל-70-80 מעלות צלזיוס.
  3. מחממים סוניקטור אמבט מים ל-69 מעלות צלזיוס.
  4. מיקרופיפטה 1 מ"ל של AA-PGG (שלב 1.3) במורד הקצוות של בקבוקון סרט השומנים כדי למנוע יצירת בועות.
    הערה: בעת ייצור בקרה לא כלאטית או מיקרו-בועות פלואורסצנטיות בלבד, השתמש ב-PGG (שלב 1.2) במקום AA-PGG.
  5. כסה חלקית את פתח הבקבוקון במכסה, והשאיר מספיק מקום להכנסת קו פרפלואורופרופאן (PFP). הזרמת PFP לתוך מרווח הבקבוקון למשך 20 שניות מעל הנוזל, כך שהנוזל מופרע באופן גלוי אך אינו ניתז. אין להזרים PFP ישירות לתוך המתלה. מכסים את הבקבוקון.
    הערה: אם הזרימה מספקת בעוצמה ובזמן, הבקבוקון יתחיל להתקרר למגע.
  6. טבלו את החצי התחתון של הבקבוקון באמבט המים של 70-80 מעלות צלזיוס למשך דקה. לאחר מכן, סוניקט למשך 30 שניות לפחות בסוניקטור האמבטיה של 69 מעלות צלזיוס או עד שסרט השומנים מתפזר בצורה הומוגנית לתוך AA-PGG. הימנע מיצירת בועות או הפעלה מוקדמת של היווצרות מיקרו-בועות (הפעלה מוקדמת תופיע כאזורים חלביים/עכורים בתרחיף השומנים). נגב את משטח הבקבוקון בעת הצורך כדי להבחין טוב יותר אם נותרו שומנים לא תלויים.
    הערה: אם סרט השומנים אינו מלחלח תוך דקה אחת מרגע הסוניקציה, יש לחמם מחדש באמבטיה של 70-80 מעלות צלזיוס, ולבצע סוניקציה מחדש.
  7. לאחר שהסרט השומני מושעה בצורה הומוגנית, יש לחמם פעם אחרונה למשך דקה אחת ולבצע סוניקט למשך 30 שניות נוספות.
  8. נגב את הבקבוקון ואפשר לו להתקרר באופן פסיבי ל-RT (~5-10 דקות).
  9. מלא מחדש את מרווח הבקבוקון ב-PFP לפי שלב 3.5, מכסה ואטום את קצוות המכסה עם Parafilm.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולחדש אותו לאחר לא יאוחר מ-8 שעות.

4. תיוג רדיו

הערה: לבקרה ללא כלאט או מיקרו-בועות פלואורסצנטיות בלבד, דלג לפרוטוקול סעיף 5.

התראה: בצע את שלבים 4.4-4.6 של פרוטוקול זה במעבדה רדיואקטיבית, אלא אם צוין אחרת. 64CuCl2 הוא סכנה רדיולוגית עם סיכון לרעילות רב-מערכתית באמצעות חשיפה לעור, שאיפה או בליעה. במידת האפשר, טפל בו במכסה אדים בעקיפין באמצעות מלקחיים עם קצה גומי. ללבוש מעיל מעבדה מגן, מד מינון טבעת ותג אישי וכפפה כפולה בעת הטיפול. ודא ש-64CuCl2 מטופל על פני מיגון עופרת בגודל 2 אינץ'. במידת הצורך, העבירו אותו במיכל עטוף עופרת. מגן על מיכלי פסולת ובצע סקר תפעולי לזיהום לאחר השימוש.

  1. מכינים אמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס בכוס זכוכית או בכלי התגבשות גדול המכיל מוט ערבוב מגנטי. השתמש בצלחת חמה/ערבוב מבוקרת טמפרטורה המצוידת בבדיקה תרמית המוחדרת למים, מכוונת לערבב בקצב המייצר משפך חלש אך גלוי.
  2. העבירו בקבוקון אטום המכיל 64CuCl2 ב-0.1 N HCl לכיול מינון באמצעות מלקחיים עם קצה גומי.
    הערה: בעת הזמנת 64CuCl2, בקש להמיס אותו ב-5-20 מיקרוליטר של 0.1 N HCl. נפח נמוך יותר הוא קריטי לשימור תפוקת המיקרו-בועה.
  3. שימו לב לפעילות הנחושת-64 הנמדדת בכיול המינון ולשעה. הסר את הבקבוקון בעזרת מלקחיים והניח אותו בכלי עם עופרת.
  4. חלקו את הפעילות שצוינה בנפח המדווח עבור 64CuCl2 כדי לקבל ערך MBq·mL-1 .
  5. הסר את מתלה השומנים משלב 3.9 ואבטח אותו במחזיק בקבוקון.
  6. הסר את המכסה של בקבוקון 64CuCl2 ואבטח אותו בעזרת מלקחיים.
  7. מיקרופיפטה נפח של תמיסת 64CuCl2 המתאימה לפעילות של 40-250 מגה-בייט והעברה לתרחיף השומנים. ודא שקצה הפיפטה שקוע במתלה. צלול ואז פיפטה למעלה ולמטה כדי להעביר לחלוטין את 64CuCl2.
    הערה: הכמות של 64CuCl2 שנוספה תהיה תלויה ביישום המיועד עבור המיקרו-בועות המסומנות ברדיו וברגישות של כיול המינון. לדגימת PET אורכית (עד 48 שעות לאחר ההזרקה) ודגימת דם in vivo בעכברים, מומלץ מינימום של 220 MBq ו-50 MBq, בהתאמה.
  8. מכסים גם את תרחיף השומנים וגם 64בקבוקוני CuCl2 .
  9. בעזרת מלקחיים שטוחים עם קצה גומי, סובב ידנית את מתלה השומנים הרדיואקטיבי למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים כדי לערבב בעדינות את 64CuCl2 דרך המתלה. הימנע מטלטול או הפלת הבקבוקון, והימנע מהיווצרות בועות.
  10. כאשר צד ימין כלפי מעלה, החלק בעדינות את מכסה הבקבוקון תוך שמירה על המתלה יציב. זה יעזור לכל נוזל שנלכד במכסה להימשך לתחתית הבקבוקון. פתח בזהירות חלקית את הבקבוקון והכנס קו PFP מצויד במחט 18 G. מלא את חלל הבקבוקון ב-PFP למשך 20 שניות לפי שלב 3.5. מכסים את הבקבוקון וחותמים עם Parafilm.
  11. מדוד את פעילות הבקבוקון בכיול מינון ושים לב לשעה.
    הערה: אם לא הועברה פעילות מספקת לבקבוקון, חזור על שלבים 4.5-4.11, והוסף נפח נוסף מתאים של 64CuCl2.
  12. הנח את הבקבוקון במחזיק בקבוקון קצף ודחף דרכו כך שהחצי התחתון של הבקבוקון יהיה חשוף לחום. מניחים את המחזיק באמבט המים המערבב של 60 מעלות צלזיוס ומחממים למשך שעה.
  13. בזמן שתגובת הקלציה מתרחשת, הכינו צלחות iTLC. תוך כדי לבישת כפפות טריות, חותכים נייר כרומטוגרפיה מיקרופייבר מזכוכית לרצועות בגודל 1 ס"מ על 8 ס"מ. מחממים את הרצועות בתנור לייבוש זכוכית בטמפרטורה של 80 מעלות.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה במעבדה שאינה רדיואקטיבית.
  14. לאחר שעה, הסר את הבקבוקון בשלב 4.12 מהאש ונגב את הקצוות ברקמה.
  15. סובב את הבקבוקון למעלה ולמטה באופן ידני בעזרת מלקחיים עם קצה גומי כדי לעבות מחדש כל עיבוי על דפנות הבקבוקון לתוך מתלה השומנים.
  16. כשהבקבוקון במצב זקוף, החלק את הפקק תוך כדי ייצוב הצינור. יש להסיר את הפרפילם ולנגב סביב הפקק כדי להסיר מי אמבטיה כלואים.
  17. פתח בזהירות את הבקבוקון ושאף 1-2 מיקרוליטר של מתלה השומנים. זהו את המתלה במרחק של 1 ס"מ מהמרכז התחתון של רצועת iTLC וכסו מחדש את הבקבוקון. הניחו למקום להתייבש.
    הערה: באופן אידיאלי, יש לזהות מינימום של 2 iTLCs לכל תערובת תגובה ולפתח לכל תרחיף שומנים עם תווית רדיו לוודאות.
  18. מיקרופיפטה 200 מיקרוליטר של חומר הניקוי iTLC (הוכן בשלב 1.4) לתחתית מבחנה של 10 מ"ל. שכן את המבחנה במיכל עופרת. הוסף את ה-iTLC המנומר לצינור ואפשר לרצועה להתפתח עד שהחומר המנומר נמצא במרחק של כ-1 ס"מ מהקצה העליון של הרצועה.
  19. הסר את רצועות ה-iTLC המפותחות באמצעות מלקחיים. החזק את הרצועה אנכית וחתוך לשליש מעל צינורות פלסטיק עגולים מבוססי γ מ"ל ותואמי מכסה דחיפה של 5 מ"ל כך שכל שליש רצועה נופל ישירות לשליש בודד. הכנס מכסי דחיפה לשלושת הצינורות.
  20. מדוד את הצינורות המכילים רצועה וצינור בקרה ריק/מכוסה על מונה γ לפעילות נחושת-64 ורשום את הספירה לדקה (cpm) המשויכת. הפחיתו את פעילות צינור הבקרה מהקריאות האחרות כדי לתקן את פעילות הרקע.
    הערה: הקריאות המתוקנות עבור השליש התחתון של הרצועה (חתיכה 1) קשורות לחלקיקי תרחיף נחושת-64 כלאט לשומנים. החלק האמצעי (חתיכה 2) מכיל פס של כלאטים חופשיים של נחושת-64 ו-64Cu-פירו-ליפידים בצורה לא על-מולקולרית. החלק העליון (חלק 3) מכיל בעיקר נחושת חופשית-64.
  21. חישוב טוהר רדיוכי באמצעות משוואה 1.
    figure-protocol-15816(משוואה 1)
    הערה: אם העלות לאלף עבור חלק 1 נראית נמוכה באופן בלתי סביר (למשלample, נמוכה או שווה ערך לחלקים 2 או 3) או אם קריאות כלשהן הן מעל סף ה-γ הלא-ליניארי/רוויה, אתר נפח נמוך יותר או עוצמה מדוללת (1-2 מיקרוליטר) של המתלה המסומן ברדיו עבור iTLC.
  22. ודא שהטוהר הרדיוכימי המתקבל משתי רצועות ה-iTLC לכל תרחיף שומנים הוא ≥-94% להמשיך. אם לא, המשך לחמם את תרחיף השומנים ב-60 מעלות צלזיוס ולפקח על הקלציה במרווחים של 30 דקות באמצעות iTLC.
  23. הסר את המכסה של בקבוקון מתלה השומנים המסומן ברדיו ואת המיקרופיפטה 8.89 מיקרוליטר של 1 N NaOH לתוך המתלה, צנרת למעלה ולמטה כדי להעביר לחלוטין את הבסיס ולנטרל את המתלה. כסו את הבקבוקון, סובבו ידנית עם מלקחיים כדי להפוך/להחזיר לאחור, ולאחר מכן הקישו בעדינות על מכסה הבקבוקון.
  24. מלא את חלל הראש ב-PFP לפי שלב 4.10, מכסה ואטם עם Parafilm.

5. הפעלה ובידוד של מיקרו-בועות

  1. הפעל את מתלה השומנים באמצעות שייקר בקבוקון מכני למשך 45 שניות ב-4530 סל"ד כדי ליצור מתלה מיקרו-בועות חלבי. הניחו לבקבוקון להתקרר באופן פסיבי ל-RT למשך כ-10 דקות. המתלה החלבי שנוצר ייפרד לשתי שכבות לאורך זמן.
    הערה: תכולת הבקבוקון צריכה להיראות חלבית לאחר ההפעלה. השעיה ברורה יותר לאחר ההפעלה מעידה על הפעלה לא מוצלחת, שתורמיה יידונו בסעיפים מאוחרים יותר.
  2. לאחר ה-RT, הפוך / הפוך בעדינות את הבקבוקון כדי להשעות מחדש את מתלה המיקרו-בועה. הנח את הבקבוקון על משטח ישר והמתן 2 דקות לפני הסילוק כדי להשיג את אוכלוסיית המיקרו-בועות הרצויה באופן הבא:
    1. הצטיידו במזרק פלסטיק של 1 מ"ל במחט של 18 גרם ואווררו את המזרק/מחט על ידי שאיבה וצלילה של אוויר פנימה/החוצה. לאחר 2 דקות, פתח במהירות את מכסה הבקבוקון, ושבר את חותם ה-Parafilm בתנועה אחת.
    2. צייר 400-550 מיקרוליטר מתחתית הבקבוקון (אוכלוסיית מיקרו-בועות יעד), הימנע משאיבת השכבה המוקצפת העליונה של אוכלוסיות מיקרו-בועות גדולות יותר לא רצויות.
      הערה: במידת הצורך, הטה את הבקבוקון לצד אחד כדי לאסוף את נפחי הקצה לתוך המזרק כדי למנוע שאיבת השכבה המוקצפת/קלה יותר.
  3. נגב את שולי המחט בזהירות כדי להסיר מזהמים מוקצפים ולהעביר את מתלה המיקרו-בועות המבודד לצינור מיקרו-צנטריפוגה. יש לסגור בעדינות (אין לפתוח או לסגור את המכסה בפתאומיות). זוהי השעיית העבודה הסופית של מיקרו-בועות עם תווית רדיו.
  4. מדוד את הפעילות של מוצר המיקרו-בועות הסופי על כיול המינון ושים לב לשעה. חלקו ערך זה בנפח ההשעיה שהוסר בשלב 5.2 כדי לקבל ערך MBq·mL-1 לחישוב נפחי ההזרקה בהתאם ליישום העניין.
    הערה: המיקרו-בועות המסומנות ברדיו מוכנות כעת לשימוש. ניתן לבצע את סעיף 6 עד 24 שעות מאוחר יותר. למידע על האופן שבו ניתן להזריק ולעקוב אחר המיקרו-בועות הללו in vivo באמצעות הדמיה מולטי-מודאלית (אולטרסאונד, PET, פלואורסצנטית), עיין ב-Rajora et al.15.

6. אימות יעילות תיוג הרדיו

  1. השעו מחדש את מתלה המיקרו-בועות באמצעות פיפטינג עדין או היפוך בקבוקון.
    הערה: לעולם אל תערבב מוצר עובד מיקרו-בועות. מערבולת מערערת את יציבות מתלי המיקרו-בועות.
  2. הוסף 10-200 מיקרוליטר של המתלה עם תווית הרדיו ליחידת מסנן צנטריפוגה של 0.5 מ"ל 30,000 חיתוך משקל מולקולרי (MWCO). אם אתה משתמש בנפחים <200 מיקרוליטר, הוסף ddH2O ליחידת המסנן כדי להוות נפח כולל של 200 מיקרוליטר. אחסן את יחידת המסנן בצינור מיקרוצנטריפוגה ומכסה תואמים.
    הערה: מומלץ לבצע בדיקת תיוג רדיו לפני ובנפרד מכל שימוש במבחנה או in vivo במיקרו-בועות עם תווית רדיו כדי להבטיח השלמה מוצלחת של הפרוטוקול. במקרה זה, ניתן להשתמש בנפח גדול יותר (למשל, 200 מיקרוליטר) בשלב זה. כאשר הפרוטוקול משמש לאחר מכן לפגישת טיפול, הכינו תחילה נפחי טיפול/זריקות, ולאחר מכן ערכו את קטע 6 עם תרחיף המיקרו-בועות הנותר מוקדם ככל האפשר.
  3. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-12,000 x גרם ב-RT.
    הערה: המיקרו-צנטריפוגה צריכה להיות מוקפת במיגון עופרת.
  4. חותכים את החיבור בין צינור המיקרו-צנטריפוגה לכובעו במספריים.
    1. הנח את הפקק בבקבוקון נצנוץ של 20 מ"ל שכותרתו "כובעים". העבר את יחידת המסנן לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש (צינור 2).
    2. הנח את צינור המיקרו-צנטריפוגה הראשון עם אינפרנטנטנט לתוך בקבוקון נצנוץ של 20 מ"ל שכותרתו "צינור 1". הוסף 200 מיקרוליטר ddH2O ליחידת המסנן בצינור 2.
  5. צנטריפוגה את יחידת המסנן בצינור 2 ב-12,000 x גרם ב-RT.
  6. חזור על שלבים 6.4 ו- 6.5. הוסף את מכסה הצינור 2 לבקבוקון הנצנוץ "מכסים" המכיל את מכסה הצינור 1. הנח את צינור 2 בבקבוקון נצנוץ חדש של 20 מ"ל.
  7. חותכים את המכסה של צינור המיקרו-צנטריפוגה השלישי ומניחים בבקבוקון "הכובעים" לפי שלב 6.4. העבר את יחידת המסנן לבקבוקון נצנוץ חדש של 20 מ"ל שכותרתו "יחידה", וודא שהאינפרנטל נשאר בצינור 3 ולא מועבר לבקבוקון "היחידה". אם נראות טיפות בשולי יחידת המסנן, החזר אותה לצינור 3, מכסה וסובב כלפי מטה למשך 10 שניות. הנח את צינור 3 בבקבוקון זכוכית חדש של 20 מ"ל.
  8. יש לכסות את 5 בקבוקוני הנצנוץ (שפופרת 1, שפופרת 2, שפופרת 3, מכסים ויחידה). הכן בקבוקון נצנוץ ריק ומכוסה של 20 מ"ל כבקרה ריקה.
  9. מדוד את ששת בקבוקוני הנצנוץ על מונה γ לפעילות נחושת-64. הפחיתו את פעילות הבקבוקון הריק מזו של בקבוקונים אחרים. חשב את יעילות תיוג הרדיו/כלציה באמצעות משוואה 2.
    figure-protocol-20864(משוואה 2)
    הערה: אם ה-cpm של היחידה נמוך באופן בלתי סביר (למשל, נמוך יותר או שווה ערך לצינורות) או אם קריאות כלשהן הן מעל הסף הלא ליניארי/רווי של γ-counter, אחסן את בקבוקוני הנצנוץ במיכלי עופרת עד 4 ימים כדי לאפשר לפעילות להתפרק עד שהערכים יהיו מתחת לסף ולמדוד מחדש.

7. אפיון פיזיקוכימי של מיקרו-בועות

הערה: אלא אם כן למעבדה יש ציוד ייעודי לעיבוד דגימות רדיואקטיביות, יש לבצע אפיון פיזיקוכימי של מיקרו-בועות באמצעות דגימות נחושת "קרות" שאינן רדיואקטיביות. תיוג "קר" זה מקל על הערכת תפוקת המיקרו-בועות, שהיא חיונית להערכת מינון המיקרו-בועות המשמשות ליישום המיועד. בנוסף, הוא מאפשר השוואה עם מיקרו-בועות בקרה כדי להבטיח שתהליך תיוג הרדיו אינו מפריע לתכונות של מיקרו-בועות. תיוג "קר" זה ואפיון פיזיקוכימי נלווה צריכים להתרחש לפני יישום מיקרו-בועות רדיו ויכולים לשמש כמשוב אם נדרשים שינויים בתיוג הרדיו (ראה דיון).

  1. תיוג מיקרו-בועות נחושת "קר"
    1. באמצעות הנפח של תמיסת 64CuCl2 שנוספה לתרחיף השומנים בשלב 4.7, הרכב האחוז הטוחנת של פורפירין בתוך שכבות השומנים והפעילות הספציפית שנמצאת בגיליון המוצר 64CuCl2 , מחשבים את היחס המולרי המשוער של מתכת: פורפירין שהושג במהלך תיוג רדיו. חישובים לדוגמה ניתן למצוא בקובץ משלים 1.
    2. בצע את סעיפים 1-3 של הפרוטוקול הנוכחי.
    3. הכן תמיסת CuCl2 של 0.1 מ"ג·מ"ל-1 ב-0.1 N HCl.
    4. מיקרופיפטה את הנפח המתאים של תמיסת CuCl2 זו לתוך תרחיף השומנים המחושב משלב 7.1.1 ומכסה את הבקבוקון.
    5. סובב את הבקבוקון כדי לערבב את ה-CuCl2 לתוך מתלה השומנים, מלא את חלל הראש ב-PFP, איטום וחום לפי שלבים 4.9, 4.10 ו-4.12. אין צורך במלקחיים מגומי לטיפול בבקבוקון.
    6. לאחר שעה, הסר את הבקבוקון מהאש ונגב את החלק החיצוני לייבוש. הניחו לבקבוקון להתקרר ל-RT.
    7. נטרל את מתלה השומנים, ערבב, מלא את חלל הראש ב-PFP ואטום לפי שלבים 4.23 ו-4.24.
    8. הפעל את מתלה המיקרו-בועות והשפכים כדי לקבל מוצר עובד לפי שלבים 5.1-5.3.
  2. גודל מיקרו-בועות
    הערה: יש לבצע את גודל המיקרו-בועות מיד לאחר ההפעלה. אם מעריכים את יציבות מתלה העבודה, חזור על הכנת הדגימה והמדידות במרווחים של 30 דקות. בדרך כלל, חלון של 1-2 שעות מייצג את מסגרת הזמן שבה ישתמש/יינתן מתלה העבודה של המיקרו-בועה לאחר ההפעלה. מטרת מדידות היציבות היא להבטיח שגודל המיקרו-בועות והתפוקה יישמרו לאורך מסגרת זמן זו, כך שכל הטיפולים הניתנים מתמיסת העבודה יכילו אוכלוסיות מיקרו-בועות דומות.
    1. הפעל את מונה קולטר (CC) והגדר את הפרמטרים הבאים באמצעות הכלי Edit SOP : צמצם 30 מיקרומטר, טווח גדלים של 0.6-18 מיקרומטר, זרם צמצם 400-600 μA, קדם amp רווח 4-8, 400 פחים, שטיפה לפני ואחרי כל ריצה, ניתוח נפחי, נפח דגימה של 5 μL.
    2. סנן אלקטרוליט CC דרך יחידת סינון ואקום מדיה של 0.2 מיקרומטר. מלאו את מיכל האלקטרוליטים ומיכל נפרד להכנת דגימה.
    3. מדידת רקע: מלאו קובטה חד פעמית של 10 מ"ל באלקטרוליט מסונן של 10 מ"ל והריצו מדידה בסיסית. ודא שהספירה נמוכה מ-400. אם לא, שטוף את המכשיר.
    4. מדידה לדוגמא
      1. הוסף 10 מ"ל אלקטרוליט מסונן לקובט חדש. השעו מחדש את מתלי המיקרו-בועות על ידי היפוך/היפוך ידני. מיקרופיפטה 5 מיקרוליטר מהמרכז התחתון של הבקבוקון. נגב את שולי קצה הפיפטה (למעט הפתח) וצלול את הדגימה ישירות לתוך האלקטרוליט המוכן.
      2. פיפטה למעלה ולמטה כדי להעביר לחלוטין את המתלים. השתמש בקצה הפיפטה כדי לסובב בעדינות את האלקטרוליט עד שה"חוטים" של תרחיף המיקרו-בועות מתפזרים.
    5. מדוד את המדגם ב-CC (שתי ריצות לכל אנליט).
      הערה: נפח דגימת מיקרו-בועות של 5 מיקרוליטר מתאים בדרך כלל לדגימות המכילות ריכוזי 1-5 x 109 מיקרו-בועות·מ"ל-1 . ייתכן שיהיה צורך להתאים את נפח הדגימה הזה בהתאם להגדרת מכשיר ה-CC הספציפי ואם תפוקות המיקרו-בועות של הדגימה נופלות מחוץ לטווח הנ"ל.
  3. הדמיה קונפוקלית
    הערה: בצע הדמיה קונפוקלית מיד לאחר גודל המיקרו-בועות ובמסגרת הזמן של יציבות המיקרו-בועות שנשמרה לפי ההערה בשלב 7.2.
    1. השעו מחדש את מתלה המיקרו-בועות והעבירו 1-5 מיקרוליטר למרכז שקופית מיקרוסקופ זכוכית. הנח החלקת כיסוי בזהירות מעל טיפת המתלה של המיקרו-בועה, הימנע מכל לכידה של בועות אוויר. המתלה יתפשט מתחת לתלוש הכיסוי.
    2. דמיין את המיקרו-בועות בהגדלה של פי 60 עם יעד טבילה בשמן. השג תמונות בשדה בהיר ומתחת לעירור של 633 ננומטר/פליטה של 640-765 ננומטר. שכב-על של תמונות השדה הבהיר והפלואורסצנטי.
      הערה: אות הקרינה צריך לחפוף על פני המעטפת של כל החלקיקים הנראים כאשר הגשושית משולבת באופן הומוגני בתוך מעטפת המיקרו-בועות.
  4. ספקטרופלואורומטריה
    הערה: ניתן לבצע מדידות ספקטרופלואורומטריה תוך 24 שעות מהפעלת המיקרו-בועות.
    1. הכן 1% טריטון X-100 כפי שתואר קודם לכן35.
    2. הפעל את הספקטרופלואורומטר 15-30 דקות לפני המדידה הראשונה.
    3. מדוד את ספקטרום הקרינה של 1% Triton X-100 באמצעות עירור של 410 ננומטר וטווח פליטה של 600-800 ננומטר בקובט קוורץ. בחר באפשרות לנרמל את האות על ידי אות גלאי הייחוס (המכונה לעתים קרובות S1/R1).
      הערה: Triton X-100 מבעבע בקלות כאשר הוא מבעבע. ככזה, בעת העברה לקובטה, צלול רק לעצירת המיקרופיפטה הראשונה.
    4. שוטפים את הקובט במתנול ומייבשים באוויר בלחץ בין הדגימות.
    5. העבירו 6 מ"ל של 1% Triton X-100 לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. השעו מחדש את מתלה המיקרו-בועות ושאבו 1 מיקרוליטר באמצעות מיקרופיפטה. נגב את שולי קצה הפיפטה למעט הפתח והעביר את הדגימה לטריטון X-100 המוכן 1%, פיפטינג למעלה ולמטה כדי להשלים את ההעברה. מערבל את התמיסה ומעביר אותה לקובט קוורץ.
      הערה: התאם את יחס המדגם: 1% Triton X-100 בהתאם לרגישות המכשיר וסף הרוויה הלא ליניארי.
    6. מדוד דוגמה זו באמצעות הפרמטרים בשלב 7.4.3. מדידה זו מתאימה לחלקיקים "משובשים".
    7. חזור על שלבים 7.4.3-7.4.6 באמצעות PBS. מדידה זו מתאימה לחלקיקים "שלמים".
    8. תקן את ספקטרום הדגימה המשובש והשלם באמצעות מדידות 1% Triton X-100 ו-PBS, בהתאמה.
    9. חשב את יעילות המרווה (QE) באמצעות משוואה 3 באמצעות אות פלואורסצנטי משולב מתוקן בסיס של הדגימה השלמה ב-PBS (FPBS) וב-1% Triton X-100 (FTx):
      figure-protocol-26808(משוואה 3)
  5. ספקטרוסקופיה UV-Vis
    הערה: ניתן לבצע מדידות ספקטרוסקופיה עד 72 שעות לאחר הפעלת מיקרו-בועה.
    1. סוניקציה של תרחיף המיקרו-בועות בצינור מיקרו-צנטריפוגה באמצעות סוניקטור אמבטיה ב-RT עד שהמתלה שקוף. פעולה זו מפחיתה את אפקטי הפיזור במהלך ספקטרוסקופיה.
    2. הפעל את הספקטרופוטומטר 10 דקות לפני המדידה הראשונה. בחר מרווח סריקה של 0.25 ננומטר וטווח רכישה של 200-800 ננומטר. הפעל חיסור בסיסי.
    3. השתמש בקובט קוורץ באורך 1 ס"מ למדידות. שוטפים את הקובט עם מתנול בין המדידות ומייבשים באוויר בלחץ.
    4. השג מדידה בסיסית של מתנול.
    5. מערבל את מתלה המיקרו-בועות הסוניקטיבי והשקוף ומעביר 10-50 מיקרוליטר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 200-1000 מיקרוליטר מתנול. ודא שנפח המתנול נמדד ומתווסף לצינור באמצעות מזרק מיקרוליטר זכוכית נקי. מערבולת את הפתרון לקבלת דגימה "משובשת".
      הערה: דילול הדגימה יהיה תלוי ביעילות העמסת הפורפירין ובהרכב האחוז הטוחן. דילול פי 20 מתאים להרכב מיקרו-בועות פירו-ליפידים של 30% מול.
    6. אסוף ספקטרום UV-Vis.
    7. חזור על שלבים 7.5.4 עד 7.5.6 באמצעות PBS במקום מתנול.
      הערה: ניתן להשתמש במיקרופיפטה למדידת נפחי PBS במקום מזרק מיקרוליטר זכוכית.

8. שינויים בפרוטוקול

  1. כלאטור אלטרנטיבי
    1. הכן סרטי ליפידים לפי סעיף 2, והחלף את הפירו-ליפיד בכלאטור נחושת מצומד שומנים חלופי (לדוגמה, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid (מלח אמוניום), המכונה מעתה DTPA-ליפיד). השתמש בקובץ המשלים 1 כדי לחשב את נפחי המסה והמלאי הנדרשים.
      הערה: סביר להניח שיהיה צורך בבדיקת הרכבים טוחנים שונים של כלאטור חלופי כדי לקבוע את הגבול העליון שמעבר לו לא ניתן ליצור מיקרו-בועות יציבות עם תשואות גבוהות.
    2. עקוב אחר סעיפים 3 עד 6 כדי ליצור ולאפיין מיקרו-בועות עם תווית רדיו.
    3. בצע את שלבים 7.1 עד 7.3 כדי לאפיין מיקרו-בועות נחושת "קרות". נדרשת רק רכישת תמונה של מיקרוסקופיה קונפוקלית של שדה בהיר כדי להעריך את מורפולוגיה של חלקיקים. אם הקלאטור החלופי הוא פלואורסצנטי, בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית עם אורכי גל עירור ופליטה נלווים בנוסף לשלבים 7.4 ו-7.5.
  2. פלואורופור חלופי
    1. הכן סרטי שומנים לפי סעיף 2, והחלף את הפירו-ליפיד בפלואורופור חלופי מצומד ליפידים או משולב (למשל, DiI). השתמש בקובץ משלים 1 כדי לחשב את נפחי המסה והמלאי הנדרשים.
      הערה: סביר להניח שיהיה צורך בבדיקת הרכבים טוחנים שונים של פלואורופור חלופי כדי לקבוע את הגבול העליון שמעבר לו לא ניתן ליצור מיקרו-בועות יציבות עם תשואות גבוהות.
    2. עקוב אחר סעיף 3 באמצעות PGG במקום AA-PGG.
    3. השלם את שלבים 5.1 עד 5.3 ואת שלבים 7.2 עד 7.5.
  3. גישת "זינוק": תיוג תרחיפי שומנים מיקרו-בועות שנוצרו מראש
    1. צור סרט פורפירין-ליפיד לפי סעיף 2, תוך שימוש רק בפירו-ליפיד ללא מרכיבי שומנים אחרים. עיין בקובץ המשלים 1 לכמויות פירו-ליפיד.
    2. לחות את סרט הפירו-ליפידים לפי סעיף 3 באמצעות 100-200 מיקרוליטר של AA-PGG (או PGG אם אין צורך בתיוג רדיו) במקום 1 מ"ל של מאגר הידרציה.
    3. העבירו את כל תרחיף הפירו-ליפידים לתרחיף מיקרו-בועות שומן מוכן מראש.
    4. מלא את חלל הראש ב-PFP, חום וסוניקציה של המתלים והאיטום מתחת ל-PFP לפי שלבים 3.4 עד 3.9. עקוב אחר פיזור תרחיף הפירו-ליפידים לתוך תרחיף המיקרו-בועות השומני המוכן מראש והנהל מחזורי חום/סוניקציה עד לפיזור מלא.
      הערה: אם משתמשים בבקבוקון מיקרו-בועות מסחרי אטום למחיצה, ניתן להכניס את תרחיף הפירו-ליפידים לבקבוקון דרך מזרק/מחט מבלי למלא מחדש את חלל הבקבוקון ב-PFP.
    5. ביצוע תיוג רדיו (ראה שלב 8.3.5.1 להלן), הפעלה, בידוד (ראה הערה להלן) ואפיון נלווה לפי סעיפים 4 עד 7.
      1. גישה חלופית היא תחילה לתייג את תרחיף הפירו-ליפידים המיובש, לפקח על טוהר רדיוכימי של >94%, לנטרל עם 1 N NaOH (לשנות את הנפח בהתאם לנפח AA-PGG המשמש להרטבת סרט הפירו-ליפיד), ולאחר מכן להכניס את תרחיף הפירו-ליפידים המסומן ברדיו לתוך תרחיף השומנים המיקרו-בועות המוכן מראש לפי שלב 8.3.3.
        הערה: יש להשתמש בגישה שונה זו רק ליצירת מיקרו-בועות פלואורסצנטיות או רב-מודאליות עם תווית רדיו אם אחריה תהליך בידוד המסיר שלפוחיות רב-שכבתיות תת-מיקרוניות שנוצרו במהלך הידרציה של שומנים אך אינן משולבות במיקרו-בועות. ראה דיון לפרטים נוספים.

תוצאות

התוצאות העיקריות הניתנות לכימות בעת ייצור מיקרו-בועות עם תוויות רדיו הן טוהר רדיוכימי ויעילות תיוג רדיו. פרוטוקול זה משתמש ב-iTLC ובהליך צנטריפוגלי מאומת, בהתאמה, כדי לאפיין כל אחד מהם. איור 2A מראה כי טוהר רדיוכימי ממוצע ויעילות של ≥95% הושגו על פני פורמולצי...

Discussion

פרוטוקול תיוג הרדיו הנוכחי של מיקרו-בועות שומן משיג >95% טוהר רדיוכימי, יעילות כלציה של >95% ושמירה על תכונות פיזיקוכימיות של מיקרו-בועות מבלי לדרוש כל טיהור לאחר התיוג. הישגים אלה מייצגים התקדמות שלא הושגה בעבר עבור פרוטוקולי תיוג קיימים. היעדר שלבי טיהור מאפשר שימוש מהיר ?...

Disclosures

המחברים לא מדווחים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

אנו מודים לדבורה סקולרד וטישה קומל (תוכנית מיקוד והגברה מרחבית-זמנית של תגובת קרינה (STTARR) של רשת הבריאות האוניברסיטאית, טורונטו, אונטריו) על השירותים הטכניים וההדרכה שלהם. אנו מודים גם למארק ז'נג ולד"ר אלכס דאליוואל על הסיוע הטכני שלהם במהלך מיקרוסקופיה קונפוקלית ולמתקן המיקרוסקופיה האופטית המתקדם (טורונטו, אונטריו) על אספקת הציוד הנלווה. אנו מכירים במקורות המימון שלנו: המכונים הקנדיים לחקר הבריאות, מכון המחקר טרי פוקס, מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה, קרן קנדה לחדשנות, קרן הסרטן של הנסיכה מרגרט, תוכנית כיסאות המחקר של קנדה, מרכז מקלפלין, תוכנית המלגות של ואנייר, תוכנית המלגות לסטודנטים לתארים מתקדמים באונטריו, סרטן הערמונית קנדה וקרן הצדקה של פיטרבורו ק.מ. האנטר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
64CuCl2Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of RadiologyN/AOrder in small volume (<10 µL) dissolved in 0.1 N HCl
Acetic acid Any company≥ 95% purity
Aluminum foilAny company
Ammonium acetateAny companyPurity: ≥ 98%
Balance - analyticalAny companyAble to measure down to 0.1 mg
Bath sonicatorAny companyCan be heated to 69 oC
CC aperture - 30 micronBeckman CoulterA36391Particle diameter range: 0.6-18 um
CC electrolyteBeckman Coulter8546719Isoton II diluent
CC SoftwareBeckman CoulterMultisizer 4e
Centrifuge filter units (0.5 mL 30,000 MWCO) with compatible microcentrifuge tubesMilliporeSigmaUFC503096Amicon Ultra - 0.5 mL
Centrifuge tubes - 15 mL with capsAny company
ChloroformAny companyPurity: ≥ 99.8% 
Coulter counterBeckman CoulterB43905Multisizer 4e Coulter Counter
Cover slipsVWR48393081VWR micro cover glass
CuCl2Any companyEnsure not oxidized
CuCl2
Cuvette- quarts, 1 cm path lengthAny company
Cuvettes - 10 mL plastic for CC measurementsBeckman CoulterA35471Coulter Counter Accuvette ST
ddH2OAny companyCan be obtained through an ultrapure water purification system
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)Any companyPowder form
Dose calibratorAny companyAble to read copper-64
DPPA (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt))Avanti Polar Lipids830855PPowder form
DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850355PPowder form
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt))Avanti Polar Lipids880200PPowder form
DTPA-lipid (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid (ammonium salt))Avanti Polar Lipids790106PPowder form
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)Any company
Gamma counterAny companyAble to read copper-64
Gamma counting tube push capsGlobe Scientific22-171-665Flanged plug caps for 12 mm tubes
Gamma counting tubesSarstedt55.15795 mL, 75 x 12 mm, PS
Glass beaker - 250 mLAny companyAble to withstand temperatures up to 100 oC
Glass drying ovenAny companyCan be heated to 80 oC
Glass microliter syringes - 25, 50, 100, 1000 µLAny companyCompatible with organic solvents
Glass scintillation vials - 20 mLVWR66022-081VWR® Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Caps, With pulp foil liner
Glass vials - 0.5 dramVWR66011-020VWR Vial 1/2 dram, with black phenolic screw cap and polyvinyl-faced pulp liner
GlycerolSigma AldrichG7757-1LPurity:  ≥ 99.0% 
Graduated pipette/gunAny company
Hot/stir plateEquipped with temperature prob for automatic tempearture control
Hydrochloric acid - 0.1 NAny company
iTLC platesAgilentA120B12 iTLC-SA chromatography paper
Laboratory tissuesAny company
Media vaccuum filtration unitAny company0.22 micron pore size, PES membrane, 500 mL funnel capacity
MethanolAny companyPurity:  ≥ 99.8%, HPLC grade, meets ACS specifications
Microcentrifuge tubes non sterile - 1.5 mLAny company
Microcentrifuge tubes sterile - 1.5 mLAny company
Micropipetes - p1000, p200, p20, p10Any companyEnsure are calibrated
Microscope slidesFisher Scientific12-550-15Superfrost Plus Microscope Slides Precleaned
Needles - 18 GSterile
ParafilmAny company
PBSSigma AldrichD8537-500MLDPBS, modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
PFPFluoroMedAPF-N40HPPurity:  ≥ 99.8%
PFP lineAny company1/4 inch diameter plastic hose cut about 50 cm in length
PFP regulatorSwagelokSS-1RF4 and SS-4HC-1-4
pH meterAny company
pH standards 4 and 7Any company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - non sterileAny company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - sterileAny company
Plastic syringe - 1 mLAny companySterile
Propylene glycolBioShopPRO888.500Purity:  ≥ 99.5%
Pyro-lipidN/AMade in-house
Rubber tipped forcepsAny companyMix of fine-tipped and flat/square edges recommended
ScissorsAny company
Sodium hydroxide - 1 NAny company
Sodium hydroxide - 10 NAny company
SpectrofluorometerAny companyCapable of 410 nm excitation and 600-850 nm emission
Spectrofluorometry softwareHoribaFluorEssence
SpectrometerAny company
Syringe - 1 mLAny companyDisposible, plastic, sterile
Syringe filters - 0.2 micron pore sizeAny companyMembrane material: PES or other compatible with ammonium acetate/acetic acid and PBS
Test tube - 10 mL
Triton X-100Any company
Vacuum desicator/vacuumAny company
VialmixLantheus Medical Imaging515030-0508Referred to in protocol as a mechanical vial shaker
Weigh paperAny companyTo avoid losing product, cutting weigh paper into 3x3 cm squares is recommended

References

  1. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Mol Imaging Biol. 14 (1), 40-46 (2012).
  2. Kong, W. T., Wang, W. P., Huang, B. J., Ding, H., Mao, F. Value of wash-in and wash-out time in the diagnosis between hepatocellular carcinoma and other hepatic nodules with similar vascular pattern on contrast-enhanced ultrasound. J Gastroenterol Hepatol. 29 (3), 576-580 (2014).
  3. Wilson, S. R., Burns, P. N. Microbubble-enhanced us in body imaging: What role. Radiology. 257 (1), 24-39 (2010).
  4. Hynynen, K., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. Noninvasive mr imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier bbb in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  5. He, W., et al. Enhanced ablation of high intensity focused ultrasound with microbubbles: An experimental study on rabbit hepatic vx2 tumors. Cardiovasc Intervent Radiol. 34 (5), 1050-1057 (2011).
  6. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in alzheimer's disease using mr-guided focused ultrasound. Nat Commun. 9 (1), 2336 (2018).
  7. Burke, C. W., Klibanov, A. L., Sheehan, J. P., Price, R. J. Inhibition of glioma growth by microbubble activation in a subcutaneous model using low duty cycle ultrasound without significant heating. J Neurosurg. 114 (6), 1654-1661 (2011).
  8. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. J Control Release. 243, 172-181 (2016).
  9. Haram, M., Hansen, R., Bouget, D., Myhre, O. F., Davies, C. L., Hofsli, E. Treatment of liver metastases with focused ultrasound and microbubbles in patients with colorectal cancer receiving chemotherapy. Ultrasound Med Biol. 49 (9), 2081-2088 (2023).
  10. Mainprize, T., et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 9 (1), 321 (2019).
  11. Karakatsani, M. E., et al. Focused ultrasound mitigates pathology and improves spatial memory in alzheimer's mice and patients. Theranostics. 13 (12), 4102-4120 (2023).
  12. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the role of lipid transfer in microbubble-mediated drug delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  13. Wang, S., Samiotaki, G., Olumolade, O., Feshitan, J. A., Konofagou, E. E. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  14. Huynh, E., Rajora, M. A., Zheng, G. Multimodal micro, nano, and size conversion ultrasound agents for imaging and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8 (6), 796-813 (2016).
  15. Rajora, M. A., et al. Quantitative pharmacokinetics reveal impact of lipid composition on microbubble and nanoprogeny shell fate. Adv Sci. 11 (4), 2304453 (2024).
  16. Leong, K. X., Sharma, D., Czarnota, G. J. Focused ultrasound and ultrasound stimulated microbubbles in radiotherapy enhancement for cancer treatment. Technol Cancer Res Treat. 22, 1-9 (2023).
  17. Li, Y., et al. Ultrasound-triggered release of sinoporphyrin sodium from liposome-microbubble complexes and its enhanced sonodynamic toxicity in breast cancer. Nano Research. 11, 1038-1056 (2017).
  18. Nomikou, N., Fowley, C., Byrne, N. M., Mccaughan, B., Mchale, A. P., Callan, J. F. Microbubble-sonosensitiser conjugates as therapeutics in sonodynamic therapy. Chem Commun. 48 (67), 8332-8334 (2012).
  19. Chakravarty, R., Hong, H., Cai, W. Positron emission tomography image-guided drug delivery: Current status and future perspectives. Mol Pharm. 11 (11), 3777-3797 (2014).
  20. Delalande, A., Leduc, C., Midoux, P., Postema, M., Pichon, C. Efficient gene delivery by sonoporation is associated with microbubble entry into cells and the clathrin-dependent endocytosis pathway. Ultrasound Med Biol. 41 (7), 1913-1926 (2015).
  21. Sheikov, N., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med Biol. 30 (7), 979-989 (2004).
  22. Conway, G. E., Paranjape, A. N., Chen, X., Villanueva, F. S. Development of an in vitro model to study mechanisms of ultrasound-targeted microbubble cavitation-mediated blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 50 (3), 425-433 (2024).
  23. Hu, S., Zhang, X., Unger, M., Patties, I., Melzer, A., Landgraf, L. Focused ultrasound-induced cavitation sensitizes cancer cells to radiation therapy and hyperthermia. Cells. 9 (12), 2595 (2020).
  24. Zhao, C., et al. Synergistically augmenting cancer immunotherapy by physical manipulation of pyroptosis induction. Phenomics. , (2024).
  25. Tachibana, K., Uchida, T., Ogawa, K., Yamashita, N., Tamura, K. Induction of cell-membrane porosity by ultrasound. Lancet. 353 (9162), 1409 (1999).
  26. Arif, W. M., et al. Focused ultrasound for opening blood-brain barrier and drug delivery monitored with positron emission tomography. J Control Release. 324, 303-316 (2020).
  27. Da Ros, V., et al. PVA-microbubbles as a radioembolization platform: Formulation and the in vitro proof of concept. Pharmaceutics. 15 (1), 217 (2023).
  28. Tartis, M. S., et al. Dynamic micropet imaging of ultrasound contrast agents and lipid delivery. J Control Release. 131 (3), 160-166 (2008).
  29. Willmann, J. K., et al. Targeted microbubbles for imaging tumor angiogenesis: Assessment of whole-body biodistribution with dynamic micro-pet in mice. Radiology. 249 (1), 212-219 (2008).
  30. Ingram, N., et al. Ultrasound-triggered therapeutic microbubbles enhance the efficacy of cytotoxic drugs by increasing circulation and tumor drug accumulation and limiting bioavailability and toxicity in normal tissues. Theranostics. 10 (24), 10973-10992 (2020).
  31. Hernández-Gil, J., et al. Development of 68ga-labelled ultrasound microbubbles for whole-body pet imaging. Chem Sci. 10 (215), 5603-5615 (2019).
  32. Warram, J. M., et al. Biodistribution of p-selectin targeted microbubbles. J Drug Target. 22 (5), 387-394 (2014).
  33. Liu, T. W., Macdonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically copper-64-labeled organic nanoparticles as radiotracers. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (52), 13128-13131 (2012).
  34. Rajora, M. A., et al. Tailored theranostic apolipoprotein e3 porphyrin-lipid nanoparticles target glioblastoma. Chem Sci. 8 (8), 5371-5384 (2017).
  35. Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets. J Vis Exp. 176, e62665 (2021).
  36. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  37. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjug Chem. 25 (4), 796-801 (2014).
  38. Mcmahon, D., Hynynen, K. Acute inflammatory response following increased blood-brain barrier permeability induced by focused ultrasound is dependent on microbubble dose. Theranostics. 7 (16), 3989-4000 (2017).
  39. Bismuth, M., Katz, S., Rosenblatt, H., Twito, M., Aronovich, R., Ilovitsh, T. Acoustically detonated microbubbles coupled with low frequency insonation: Multiparameter evaluation of low energy mechanical ablation. Bioconjug Chem. 33 (6), 1069-1079 (2022).
  40. Kutscher, H. L., et al. Threshold size for optimal passive pulmonary targeting and retention of rigid microparticles in rats. J Control Release. 143 (1), 31-37 (2010).
  41. You, Y., et al. Porphyrin-grafted lipid microbubbles for the enhanced efficacy of photodynamic therapy in prostate cancer through ultrasound-controlled in situ accumulation. Theranostics. 8 (6), 1665-1677 (2018).
  42. Chen, X., Qin, B., Whitehurst, D., Helfield, B., Lavery, L., Villanueva, F. S. Sonodynamic therapy using protoporphyrin ix encapsulated microbubbles inhibits tumor growth. 2017 IEEE International Ultrasonics Symposium. , 1-4 (2017).
  43. Cheng, M. H. Y., et al. Targeted theranostic 111in/lu-nanotexaphyrin for spect imaging and photodynamic therapy. Mol Pharm. 19 (6), 1803-1813 (2022).
  44. Cheng, M. H. Y., Cevallos, A., Rajora, M. A., Zheng, G. Fast, facile, base-free microwave-assisted metallation of bacteriochlorophylls and corresponding high yield synthesis of tookad. J Porphyrins Phthalocyanines. 25 (07n08), 703-713 (2021).
  45. Macdonald, T. D., Liu, T. W., Zheng, G. An MRI-sensitive, non-photobleachable porphysome photothermal agent. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (27), 6956-6959 (2014).
  46. Shao, S., et al. Functionalization of cobalt porphyrin-phospholipid bilayers with his-tagged ligands and antigens. Nat Chem. 7 (5), 438-446 (2015).
  47. Teh, J. H., et al. A kit-based aluminium-[(18)f]fluoride approach to radiolabelled microbubbles. Chem Commun (Camb). 57 (88), 11677-11680 (2021).
  48. Rajora, M. A. . Supramolecular Structure-Enabled Delivery of Porphyrin to Glioblastomas Beyond the Blood-Brain Barrier [Doctor of Philosophy thesis]. , (2024).
  49. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  50. Dhaliwal, A. . Utilizing Porphyrin to Improve Ultrasound-Activated Supramolecular Agent Design for Solid Tumor Delivery [Doctor of Philosophy thesis]. , (2023).
  51. Kilroy, J. P., Klibanov, A. L., Wamhoff, B. R., Bowles, D. K., Hossack, J. A. Localized in vivo model drug delivery with intravascular ultrasound and microbubbles. Ultrasound Med Biol. 40 (10), 2458-2467 (2014).
  52. Dhaliwal, A., et al. Deep learning for automatic organ and tumor segmentation in nanomedicine pharmacokinetics. Theranostics. 14 (3), 973-987 (2024).
  53. Shakya, G., Cattaneo, M., Guerriero, G., Prasanna, A., Fiorini, S., Supponen, O. Ultrasound-responsive microbubbles and nanodroplets: A pathway to targeted drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 206, 115178 (2024).
  54. Honari, A., Merillat, D. A., Bellary, A., Ghaderi, M., Sirsi, S. R. Improving release of liposome-encapsulated drugs with focused ultrasound and vaporizable droplet-liposome nanoclusters. Pharmaceutics. 13 (5), 609 (2021).
  55. Barmin, R. A., et al. Polymeric materials for ultrasound imaging and therapy. Chem Sci. 14 (43), 11941-11954 (2023).
  56. Chen, Y., Liang, Y., Jiang, P., Li, F., Yu, B., Yan, F. Lipid/PLGA hybrid microbubbles as a versatile platform for noninvasive image-guided targeted drug delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (45), 41842-41852 (2019).
  57. Barmin, R. A., et al. Engineering the acoustic response and drug loading capacity of pbca-based polymeric microbubbles with surfactants. Mol Pharm. 19 (9), 3256-3266 (2022).
  58. Barrefelt, A. A., et al. Multimodality imaging using SPECT/CT and MRI and ligand functionalized 99mTc-labeled magnetic microbubbles. EJNMMI Res. 3 (1), 12 (2013).
  59. Song, R., Hu, D., Chung, H. Y., Sheng, Z., Yao, S. Lipid-polymer bilaminar oxygen nanobubbles for enhanced photodynamic therapy of cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (43), 36805-36813 (2018).
  60. Böhmer, M. R., Chlon, C. H. T., Raju, B. I., Chin, C. T., Shevchenko, T., Klibanov, A. L. Focused ultrasound and microbubbles for enhanced extravasation. J Control Release. 148 (1), 18-24 (2010).
  61. Zhang, S., et al. Compare ultrasound-mediated heating and cavitation between flowing polymer- and lipid-shelled microbubbles during focused ultrasound exposures. J Acoust Soc Am. 131 (6), 4845-4855 (2012).
  62. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  63. Krasnovskaya, O. O., et al. Recent advances in (64)cu/(67)cu-based radiopharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (11), 9154 (2023).
  64. Navarro-Becerra, J. A., Borden, M. A. Targeted microbubbles for drug, gene, and cell delivery in therapy and immunotherapy. Pharmaceutics. 15 (6), 1625 (2023).
  65. Fan, C. -. H., et al. Antiangiogenic-targeting drug-loaded microbubbles combined with focused ultrasound for glioma treatment. Biomaterials. 34 (8), 2142-2155 (2013).
  66. Luo, T., et al. Ultrasound-mediated destruction of oxygen and paclitaxel loaded dual-targeting microbubbles for intraperitoneal treatment of ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 391, 1-11 (2017).
  67. Fix, S. M., et al. Oxygen microbubbles improve radiotherapy tumor control in a rat fibrosarcoma model - a preliminary study. PLoS One. 13 (4), e0195667 (2018).
  68. Eisenbrey, J. R., et al. Sensitization of hypoxic tumors to radiation therapy using ultrasound-sensitive oxygen microbubbles. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (1), 88-96 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved