Fabricação e Rotulagem de Microbolhas com Traçadores Fluorescentes e Radioativos

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de microbolhas lipídicas e um método de radiomarcação de microbolhas de um pote compatível com eficiência de marcação de >95% sem purificação que conserva as propriedades físico-químicas das microbolhas. Este método é eficaz em diversas formulações de microbolhas lipídicas e pode ser adaptado para gerar microbolhas radioativas e/ou fluorescentes.

Resumo

As microbolhas são partículas cheias de gás com casca lipídica que evoluíram de agentes de contraste de ultrassom vascular para plataformas revolucionárias de terapia contra o câncer. Quando combinados com ultrassom focalizado terapêutico (FUS), eles podem superar com segurança e localmente as barreiras fisiológicas (por exemplo, barreira hematoencefálica), administrar medicamentos para cânceres inacessíveis (por exemplo, glioblastoma e câncer de pâncreas) e tratar doenças neurodegenerativas. O arsenal terapêutico do microbubble-FUS está avançando em novas direções, incluindo radioterapia combinada sinérgica, imagem multimodal e carregamento e entrega de medicamentos tudo-em-um a partir de conchas de microbolhas.

A marcação de microbolhas com radiotraçadores é fundamental para estabelecer essas capacidades teranósticas expandidas. No entanto, as estratégias existentes de radiomarcação de microbolhas dependem de metodologias de purificação conhecidas por perturbar as propriedades físico-químicas das microbolhas, usam radioisótopos de vida curta e nem sempre produzem quelação estável. Coletivamente, isso cria ambigüidade em torno da precisão da radioimagem de microbolhas e da eficiência da entrega de radioisótopos tumorais.

Este protocolo descreve uma nova metodologia de marcação de microbolhas sem purificação que preserva as propriedades físico-químicas das microbolhas enquanto atinge >95% de eficiência de quelação de radioisótopos. É versátil e pode ser aplicado com sucesso em formulações de microbolhas personalizadas e comerciais com diferentes comprimentos de cadeia lipídica de acila, carga e composição de quelante/sonda (porfirina, DTPA, DiI). Pode ser aplicado de forma adaptativa durante a fabricação de microbolhas moídas e em formulações de microbolhas pré-fabricadas com personalização modular de fluorescência e propriedades multimodais de fluorescência/radioativas. Assim, este método flexível permite a produção de microbolhas multimodais personalizadas e rastreáveis (rádio, fluorescente ou rádio/fluorescente ativa) que são úteis para o avanço de aplicações mecanicistas, de imagem e terapêuticas de microbolhas-FUS.

Introdução

Microbolhas são agentes teranósticos supramoleculares de tamanho mícron com um núcleo de gás estabilizado por uma proteína, polímero ou, na maioria dos casos, uma casca lipídica (Figura 1A). Quando injetadas na corrente sanguínea, as microbolhas mantêm interfaces gás/líquido que são detectáveis por ultrassom por períodos de minutos antes da dissolução de seus núcleos de gás ^1,2. Consequentemente, o primeiro uso clínico das microbolhas foi como agentes de contraste de ultrassom em tempo real³. A invenção do ultrassom focalizado terapêutico (FUS) expandiu as utilidades clínicas de microbolhas. Quando estimuladas por FUS de baixa frequência, as microbolhas oscilam e geram forças mecânicas direcionadas e sintonizáveis que variam de permeabilização vascular transitória a ablação tecidual focal ^4,5. Como resultado, nos últimos 20 anos, o FUS de microbolhas foi explorado para abertura da barreira hematoencefálica (BBB), administração de drogas tumorais (por exemplo, câncer metastático pancreático, cerebral e hepático), administração de sondas de imagem, terapia de doenças neurodegenerativas e ablação do câncer 6,7,8,9,10,11.

O arsenal teranóstico de microbolhas continua a avançar em novas e excitantes direções. As aplicações convencionais de entrega de microbolhas-FUS dependem da coadministração de carga terapêutica ou de imagem ao lado de microbolhas comerciais. Há um interesse crescente em aprimorar os recursos de entrega de microbolhas-FUS, entendendo as interações biológicas/casca de microbolhas, explorando formulações de microbolhas não comerciais personalizadas e gerando microbolhas teranósticas tudo-em-um com carga carregada diretamente no invólucro da microbolha 12,13,14. De fato, aproximadamente 40% dos estudos de liberação de medicamentos com microbolhas lipídicas fazem uso dessas microbolhas carregadas de concha¹⁵. Além da imagem e da administração de medicamentos, o microbubble-FUS também se mostrou promissor no aprimoramento da radioterapia contra o câncer¹⁶ e na ativação dos efeitos antineoplásicos de agentes benignos por meio da terapia sonodinâmica^17,18.

Essas direções convencionais e expandidas em aplicações de câncer de microbolhas podem ser mais estrategicamente avançadas rotulando conchas de microbolhas com marcadores radioativos. No domínio das microbolhas carregadas de carga tudo-em-um, essa radiomarcação 1) facilita a avaliação quantitativa padrão-ouro da biodistribuição dentro e fora do alvo dessas conchas de microbolhas carregadas, 2) deriva relações farmacocinéticas de estrutura-atividade que informam a seleção ideal de composições de microbolhas para maximizar a entrega no alvo e 3) orienta a aplicação estratégica e apropriada guiada por imagem e o planejamento de tratamento (por exemplo, tipos de alvos de tecido, dosimetria, seleção de medicamentos para mitigar preocupações de segurança fora do alvo, utilidade em comparação com paradigmas convencionais de co-tratamento) de sistemas carregados de carga tudo-em-um^15,19. Em um estágio pré-clínico, essa compreensão do destino da casca das microbolhas também pode iluminar mecanismos de ação mais amplos do microbolhas-FUS. Por exemplo, a transferência de lipídios de conchas de microbolhas para células-alvo demonstrou influenciar a sonoporação habilitada por FUS^12,20. Compreender e otimizar essa transferência pode, portanto, informar as terapias pré-clínicas e clínicas de microbolhas-FUS nas quais a sonoporação está implicada (transfecção in vitro, administração de medicamentos, ablação de tumores, sensibilização à radiação e terapia sonodinâmica 20,21,22,23,24,25). As instalações duplas de ultrassom e radioimagem também permitiriam o monitoramento da abertura do vaso FUS e do tratamento (por exemplo, cinética de abertura da BHE) a partir de um único agente, em vez de projetos convencionais de agente duplo²⁶. Na mesma linha, a radiomarcação de microbolhas lipídicas pode servir como uma alternativa completa de microbolhas-FUS/radioterapia de agente único às plataformas de co-entrega de microbolhas-FUS + radiofármacos²⁷.

A fragilidade das microbolhas é um desafio não trivial para essa rotulagem. Todas as estratégias de radiomarcação existentes são limitadas por metodologias de purificação conhecidas por perturbar a estabilidade e o tamanho das microbolhas, enquanto algumas também apresentam radiomarcação ineficaz e instável 28,29,30,31,32. Os requisitos de purificação também levam a protocolos mais longos. Combinado com o uso de radioisótopos de vida curta (por exemplo, ¹⁸F t_1/2 1,8 ^{h,28,29 99m}Tc t_1/2 6 ^h,3268Ga t_1/2 1 h³¹), isso cria ineficiências relacionadas ao decaimento do radioisótopo e limita os prazos de radioimagem e planejamento de tratamento. Coletivamente, essas limitações correm o risco de aquisição de imagens de rádio encurtadas e não representativas, dados farmacocinéticos imprecisos e entrega ineficiente de radioisótopos tumorais.  

Neste relatório, essas limitações são superadas aproveitando as capacidades de quelação de metais fortes e estáveis da porfirina. As porfirinas são macromoléculas orgânicas e heterocíclicas com um anel planar altamente conjugado e um local de coordenação central que pode acomodar uma variedade de metais. Isso inclui radioisótopos de vida mais longa, como cobre-64 (t_1/2 12,7 h), um radiofármaco com tomografia por emissão de pósitrons (PET) e viabilidade de contagem de γ³³. Quando conjugadas a uma estrutura lipídica, as porfirinas podem ser prontamente incorporadas em estruturas supramoleculares e subsequentemente marcadas com cobre-64 com velocidade, alta eficiência de quelação e estabilidade sérica, mantendo as propriedades das partículas originais não marcadas^33,34. Além disso, as porfirinas são fluorescentemente ativas com auto-extinção modular em nano e micropartículas que é restaurada após a ruptura das partículas; uma leitura complementar ao PET e à contagem de γ que facilita a análise do destino da concha em massa e microscópica (Figura 1A)¹⁵.

Ao usar porfirina-lipídio como quelante, essas propriedades foram exploradas para gerar uma nova metodologia de radiomarcação de microbolhas sem purificação (Figura 1B, C) que supera as limitações associadas aos métodos de radiomarcação de microbolhas existentes. Este protocolo atinge >95% de eficiência de quelação de cobre-64, não requer purificação pós-rotulagem e preserva as propriedades físico-químicas das microbolhas. Ele pode ser facilmente integrado na fabricação "moída" de microbolhas lipídicas antes de sua ativação (Figura 1B). É versátil e pode ser aplicado com sucesso em formulações de microbolhas personalizadas e comerciais com diferentes comprimentos de cadeia lipídica de acila (C16 a C22), carga (neutra e aniônica) e composições lipídicas de porfirina (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%), gerando microbolhas com atividade de rádio e fluorescência. Sua adaptabilidade também pode se estender além da porfirina. O protocolo de um pote pode ser modificado para usar quelantes alternativos disponíveis comercialmente (por exemplo, dietilenotriamina pentaacetato (DTPA)-lipídio) e fluoróforos (por exemplo, DiI). Ele também pode ser modificado para rotular formulações de microbolhas pré-fabricadas por meio de uma abordagem de "pico". Assim, este método permite a produção de microbolhas personalizadas e rastreáveis (rádio, fluorescentes ou rádio / fluorescente ativas duplas) úteis para o avanço de aplicações mecanicistas, de imagem e terapêuticas de microbolhas-FUS. O protocolo abaixo descreve a fabricação de microbolhas lipídicas, aplicação do protocolo de radiomarcação de um pote, radiomarcação necessária e caracterização de propriedades físico-químicas e possíveis modificações.

Figura 1: Protocolo de fabricação e radiomarcação de microbolhas. (A) O lipídio porfirina, na forma de pirofeoforbida-a-lipídio, serve como um quelante multimodal dentro deste protocolo. Como um monômero quelatado a cobre-64 (i), possui recursos de PET e imagem. Sua fluorescência é extinta na forma de partícula (microbolhas (ii) e sua nanoprogênie pós-dissolução (iii)) e não extinta com ruptura de partículas (iv). (B) Protocolo de hidratação/ativação do filme lipídico descrito neste relatório para gerar microbolhas lipídicas a partir do solo e (C) integração da radiomarcação de um pote entre a formação da suspensão lipídica e a ativação das microbolhas. Essa figura foi adaptada com permissão de Rajora et ^al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Preparações de reagentes

1. Prepare tampão de acetato de amônio (0,1 M, pH 5,5)
   1. Usando uma balança analítica, pesar 770,8 mg de acetato de amônio em um papel de pesagem. Transfira a quantidade pesada para um copo de vidro limpo de 250 mL.
   2. Adicionar ao copo 90 ml de água bidestilada (ddH₂O), medida através de uma pipeta graduada. Adicione uma barra de agitação e coloque o copo em uma placa de agitação magnética para dissolver o acetato de amônio. Mexa a uma velocidade que crie um leve vórtice, mas sem respingos de solução.
   3. Calibre um medidor de pH de acordo com as instruções do instrumento usando os padrões de pH 4 e 7. Uma vez calibrado, insira a sonda de pH no tampão de acetato de amônio.
   4. Adicione 104 μL de ácido acético à solução, mexa para dissolver e meça o pH.
      NOTA: O pH deve estar próximo de 5,5 neste ponto.
   5. Ajuste o pH do tampão adicionando hidróxido de sódio 10 N (ou ácido clorídrico se o tampão se tornar muito básico) em incrementos de 5-10 μL usando uma micropipeta. Mexa, meça o pH e repita conforme necessário. Anote o volume de base/ácido adicionado.
   6. Adicione volume suficiente de ddH₂O para criar um total de 100 mL de tampão.
      NOTA: Por exemplo, se 45 μL de hidróxido de sódio 10 N foram usados durante o ajuste do pH, 9,851 mL de ddH₂O seriam adicionados ao béquer (100 mL [volume alvo] - 90 mL [etapa 1.1.2] - 0,104 mL [etapa 1.1.4] - 0,045 mL [etapa 1.1.5] = 9,851 mL).
   7. Mexa bem o tampão uma última vez antes de transferi-lo para um recipiente de armazenamento com tampa.
   8. Limpe o medidor de pH de acordo com as instruções do instrumento.
      CUIDADO: O hidróxido de sódio aquoso concentrado e o ácido clorídrico podem causar reações cutâneas e devem ser manuseados com luvas.
2. Prepare o tampão de hidratação (PGG)
   1. Aspire solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma seringa e equipe a extremidade com um filtro de seringa de polietersulfona de 0,2 μm de tamanho de poro. Filtre o PBS em um tubo de centrífuga com tampa de plástico limpo.
      NOTA: Filtros de seringa de poros de 0,2 μm de materiais alternativos de membrana (por exemplo, fluoreto de polivinilideno) podem ser usados desde que a membrana seja compatível com PBS e acetato de amônio.
   2. Combine PBS filtrado, propilenoglicol e glicerol via micropipeta em uma proporção volumétrica de 8:1:1 para fazer o tampão de hidratação (também conhecido como PGG). Ao adicionar propilenoglicol e glicerol, aspire e limpe quaisquer gotículas residuais de propilenoglicol ou glicerol da superfície da ponta da pipeta antes de pipetar lentamente o reagente no PBS. Uma turbidez viscosa clara em forma de corda será vista no PBS.
      NOTA: Recomenda-se usar uma micropipeta p1000 para adicionar primeiro PBS a um tubo de centrífuga, seguido de propilenoglicol e glicerol, pois os dois últimos reagentes são viscosos. Como tal, eles devem ser aspirados lentamente através da micropipeta até que o movimento do fluido não seja mais visto na ponta da pipeta e de modo que nenhum ar seja absorvido quando a ponta da pipeta for removida do reagente. Idealmente, as ponteiras de micropipeta com marcações volumétricas devem ser usadas para escolher volumes de reagentes que se alinhem com essas marcações (por exemplo, fazendo 1 mL ou 5 mL de PGG e, respectivamente, usando a marcação de 0,1 mL ou 0,5 mL na ponta da micropipeta para visualizar a aspiração completa de propilenoglicol e glicerol). Ao limpar a superfície da ponta da micropipeta, não limpe a abertura da ponteira, apenas nas laterais.
   3. Pipetar para cima e para baixo com a ponta da pipeta na solução até que os reagentes estejam homogeneamente dissolvidos. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
   4. Para garantir ainda mais uma mistura completa do tampão de hidratação, tampe o tubo da centrífuga e gire para cima e para baixo lentamente. Não vórtice.
   5. Girar o tubo a menos de 1000 x g durante 20-30 s (temperatura mínima de 4 °C, RT máximo) para remover bolhas de ar não observáveis.
3. Prepare tampão de hidratação/radiomarcação (AA-PGG)
   1. Filtro de seringa 0,1 M, tampão de acetato de amônio pH 5,5 (da etapa 1.1) e PBS em tubos separados conforme a etapa 1.2.1.
   2. Combine tampão de acetato de amônio filtrado, PBS filtrado, propilenoglicol e glicerol por meio de uma micropipeta p1000 em um tubo de centrífuga em um tampão de acetato de amônio 5:3:1:1: PBS: propilenoglicol: proporção volumétrica de glicerol na ordem listada. Siga as instruções de aspiração, mistura e centrifugação de acordo com as etapas 1.2.2-1.2.5 para fazer AA-PGG.
4. Eluente de cromatografia instantânea em camada delgada (iTLC)
   1. Pesar até 0,1 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e transferir para um frasco com tampa. Dissolva em ddH₂O de modo que uma solução a 2% p / v de EDTA seja feita (por exemplo, para 50 mg de EDTA, adicione 2,5 mL de ddH₂O).
   2. Combine a solução de EDTA a 2% p/v com o tampão de acetato de amônio da etapa 1.1 em uma proporção de 9:1 v/v (solução de EDTA a 90%, tampão de acetato de amônio a 10%). Tampe e armazene o eluente iTLC resultante.

2. Formação de filmes lipídicos

NOTA: Este procedimento descreve a formação de um filme lipídico com composições que imitam a microbolha comercial, Definity^®, com porfirina-lipídio substituindo o lipídio do hospedeiro e constituindo 30% molar do lipídio total. No entanto, o protocolo de radiomarcação pode ser aplicado a diversas formulações lipídicas (comprimentos de cadeia C16, C18, C22, carga neutra ou aniônica, composições molares variadas de porfirina-lipídio). Uma Planilha Suplementar (Arquivo Suplementar 1) está anexada que fornece cálculos, composições, massas e volumes de estoque para as formulações descritas e outras. Todos os lipídios estão disponíveis comercialmente, com exceção da porfirina-lipídio, pirofeoforbita-a-lipídio (piro-lipídio), cuja síntese foi previamente descrita em detalhes^35,36.

1. Usando o Arquivo Suplementar 1, determine a massa total necessária para cada lipídio com base no número de filmes necessários.
2. Pesar um frasco para injetáveis vazio de vidro de 0,5 dram numa balança analítica.
   NOTA: A poeira interfere na formação bem-sucedida de microbolhas. Assim, sopre ar pressurizado no frasco para remover qualquer poeira/partículas se armazenado sem tampa.
3. Pesar 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) em papel de pesagem.
   NOTA: A massa pesada deve ser obtida na etapa 2.1 mais 0,5-1 mg adicional para compensar qualquer perda durante o manuseio da amostra em etapas posteriores.
4. Transfira o DPPC para o frasco de vidro pesado e pese-o novamente para determinar a massa lipídica no frasco. Esse processo permite uma transferência mais fácil de lipídios para o frasco de vidro, redução da perda/derramamento de pó lipídico e medição mais precisa da massa lipídica.
5. Repita as etapas 2.2 a 2.4 com os outros lipídios: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (DPPA) e C16 pirolipídio.
   NOTA: Se o pirolipídio não estiver disponível na forma de pó pesável, mas sim como um filme ou alíquota de quantidade desconhecida, ele pode ser dissolvido em clorofórmio para formar um estoque cuja concentração pode ser calculada por meio de medições de absorbância UV-Vis em metanol usando a lei de Beer-Lambert, conforme descrito anteriormente³⁵.
6. Prepare os seguintes solventes orgânicos e soluções em tubos de ensaio de vidro usando micropipetas ou seringas de vidro: 1) clorofórmio, 2) clorofórmio 9:1 v/v: metanol e 3) clorofórmio 65:35:8: metanol: ddH₂O. Para o último, pipete os componentes e misture-os na seguinte ordem: ddH₂O, metanol e clorofórmio.
   CUIDADO: O metanol e o clorofórmio são perigosos para a saúde, inflamáveis e voláteis. Use proteção para os olhos, luvas e jaleco e use um exaustor.
7. Use o Arquivo Suplementar 1 para calcular o volume de solvente/solução orgânica necessário para fazer estoques de lipídios e selecionar seringas de vidro de volumes apropriados.
   NOTA: Este volume deve produzir concentrações de estoque que correspondam a volumes de alíquota de estoque de 15-100 μL por filme que podem ser facilmente medidos usando seringas de microlitros de vidro de 25-100 μL.
8. Enxágue as seringas de vidro três vezes com clorofórmio. Bombeie o êmbolo para frente e para trás para secar a seringa.
9. Meça e adicione o solvente/soluções orgânicas através da seringa de vidro limpa aos frascos lipídicos individuais de acordo com os cálculos da planilha na etapa 2.7 para formar estoques de lipídios. Dissolva o pirolipídio em clorofórmio (a menos que já esteja dissolvido de acordo com a nota da etapa 2.5), DPPC e DPPE-mPEG em 9:1 v/v clorofórmio: metanol e DPPA em 65:35:8 clorofórmio:metanol:ddH₂O. Se estiver usando a mesma seringa de vidro para todas as adições, enxágue e seque entre cada lipídio.
   NOTA: Se a formulação de escolha não contiver DPPA ou sua variante de comprimento de cadeia C18, então o pirolipídio, o lipídio do PC do hospedeiro e o lipídio PEG podem ser dissolvidos em clorofórmio.
10. Tampe os frascos e o vórtice.
11. Adicione volumes calculados de soluções lipídicas estoque a um novo frasco de vidro de 0,5 dram (frasco de filme) por meio de uma seringa de microlitro de vidro. Para o primeiro estoque de lipídios, insira a ponta da agulha no centro inferior do frasco e mergulhe lentamente para evitar respingos nas paredes do frasco. Para adições subsequentes, coloque a ponta da agulha diretamente acima do nível do líquido e toque na lateral do frasco para remover quaisquer gotas finais de uma maneira que não exponha a agulha ao líquido abaixo.
    NOTA: Enxágue e seque a seringa de vidro entre as adições de lipídios quando ocorrer contaminação. Se estiver fazendo vários filmes, tampe o filme e os frascos de estoque entre as adições para minimizar a evaporação do solvente.
12. Agite suavemente o frasco manualmente na posição vertical para misturar o conteúdo. Evite salpicar qualquer solução nas paredes do frasco para injetáveis.
13. Destampe (guarde a tampa) e insira uma linha de nitrogênio no espaço livre do frasco. Ajuste o fluxo de nitrogênio para causar uma leve perturbação visível na superfície do líquido, mas sem qualquer afunilamento ou respingos.
14. Vortex o frasco imediatamente após a inserção da linha de nitrogênio. Comece a uma velocidade baixa o suficiente para formar um funil com o solvente subindo não mais do que 1 cm do fundo do frasco. Evite respingos de solvente. À medida que o solvente evapora, aumente a velocidade do vórtice lentamente e sem pausa, mantendo a altura do solvente até que todo o líquido evapore. O resultado será uma película fina revestida no terço inferior do frasco.
15. Coloque o frasco para injetáveis num dessecador equipado com vácuo e continue a secar a película sob vácuo durante 8-72 h. Cubra o frasco (exceto a abertura) ou o dessecador com papel alumínio.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As próximas etapas podem ser realizadas após a secagem do filme, ou os filmes podem ser armazenados sob argônio, selados com Parafilm, em um freezer de -20 °C por até 1 mês e por mais tempo se mantidos secos.

3. Hidratação do filme lipídico

NOTA: Se as microbolhas forem usadas in vitro ou in vivo, use pontas, tubos, seringas e agulhas de micropipeta estéreis para as etapas 3.3 a 5.4, a menos que especificado de outra forma.

1. Remova o filme do vácuo ou, se armazenado no freezer, deixe-o aquecer até o RT.
2. Encha um copo de 250 ml com água e aqueça a água a 70-80 °C.
3. Aquecer um sonicador em banho-maria a 69 °C.
4. Micropipete 1 mL de AA-PGG (etapa 1.3) nas bordas do frasco para injetáveis de filme lipídico para evitar a formação de bolhas.
   NOTA: Ao fabricar microbolhas de controle não quelatadas ou somente fluorescentes, use PGG (etapa 1.2) em vez de AA-PGG.
5. Cubra parcialmente a abertura do frasco com uma tampa, deixando espaço suficiente para inserir uma linha de perfluoropropano (PFP). Flua o PFP para o headspace do frasco por 20 s acima do líquido, de modo que o líquido seja visivelmente perturbado, mas não respingue. Não flua PFP diretamente para a suspensão. Tampe o frasco.
   NOTA: Se o fluxo for adequado em força e tempo, o frasco começará a esfriar ao toque.
6. Mergulhe a metade inferior do frasco para injetáveis no banho-maria a 70-80 °C durante 1 min. Em seguida, sonicar durante pelo menos 30 s no sonicador de banho a 69 °C ou até que a película lipídica se disperse homogeneamente no AA-PGG. Evite criar bolhas ou ativar prematuramente a formação de microbolhas (a ativação prematura aparecerá como áreas leitosas/turvas na suspensão lipídica). Limpe a superfície do frasco quando necessário para discernir melhor se ainda restam lipídios não suspensos.
   NOTA: Se o filme lipídico não hidratar dentro de 1 minuto após a sonicação, reaqueça no banho de 70-80 ° C e re-sonicate.
7. Assim que o filme lipídico estiver homogeneamente suspenso, aqueça uma última vez por 1 min e sonice por mais 30 s.
8. Limpe o frasco para injetáveis e deixe-o arrefecer passivamente até à RT (~5-10 min).
9. Reabasteça o headspace do frasco com PFP de acordo com a etapa 3.5, tampe e sele as bordas da tampa com Parafilm.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e retomado após o mais tardar 8 h.

4. Radiomarcação

NOTA: Para controle não quelado ou microbolhas somente fluorescentes, pule para a Seção 5 do protocolo.

CUIDADO: Execute as etapas 4.4-4.6 deste protocolo em um laboratório radioativo, a menos que especificado de outra forma. ⁶⁴CuCl₂ é um risco radiológico com risco de toxicidade multissistêmica por exposição, inalação ou ingestão da pele. Sempre que possível, manuseie-o em uma hotte indiretamente usando uma pinça com ponta de borracha. Use um jaleco protetor, um dosímetro pessoal de anel e crachá e luva dupla ao manusear. Certifique-se de que ⁶⁴CuCl₂ seja manuseado em blindagem de chumbo de 2 polegadas. Quando necessário, transporte-o em um recipiente com bainha de chumbo. Proteja os recipientes de resíduos e realize uma pesquisa operacional quanto à contaminação após o uso.

1. Preparar um banho-maria a 60 °C num copo de vidro ou numa grande cápsula de cristalização contendo uma barra de agitação magnética. Use uma placa quente/agitadora com temperatura controlada equipada com uma sonda térmica inserida na água, configurada para mexer a uma taxa que produza um funil fraco, mas visível.
2. Transfira um frasco selado contendo ⁶⁴CuCl₂ em HCl 0,1 N para um calibrador de dose por meio de uma pinça com ponta de borracha.
   NOTA: Ao solicitar ⁶⁴CuCl₂, solicite que seja dissolvido em 5-20 μL de HCl 0.1 N. Um volume menor é fundamental para preservar o rendimento das microbolhas.
3. Observe a atividade do cobre-64 medida no calibrador de dose e o tempo. Remova o frasco com uma pinça e coloque-o em um recipiente com chumbo.
4. Divida a atividade observada pelo volume relatado para o ⁶⁴CuCl₂ para obter um valor MBq·^mL-1 .
5. Destampe a suspensão lipídica da etapa 3.9 e prenda-a em um suporte para frascos.
6. Destampe o frasco para injetáveis ⁶⁴CuCl₂ e prenda-o com uma pinça.
7. Micropipetar um volume da solução ^{de 64}CuCl₂ correspondente a 40-250 MBq de atividade e transferir para a suspensão lipídica. Certifique-se de que a ponta da pipeta esteja submersa na suspensão. Mergulhe e depois pipete para cima e para baixo para transferir completamente o ⁶⁴CuCl₂.
   NOTA: A quantidade de ⁶⁴CuCl₂ adicionada dependerá da aplicação pretendida para as microbolhas radiomarcadas e da sensibilidade do calibrador de dose. Para PET longitudinal (até 48 h após a injeção) e amostragem de sangue in vivo em camundongos, recomenda-se um mínimo de 220 MBq e 50 MBq, respectivamente.
8. Tampe a suspensão lipídica e ⁶⁴frascos para injetáveis de CuCl₂ .
9. Usando uma pinça plana com ponta de borracha, gire manualmente a suspensão lipídica radioativa para cima e para baixo pelo menos 5 vezes para misturar suavemente o ⁶⁴CuCl₂ através da suspensão. Evite agitar ou deixar cair o frasco para injetáveis e evite a formação de bolhas.
10. Quando estiver com o lado direito para cima, sacuda suavemente a tampa do frasco para injetáveis, mantendo a suspensão estabilizada. Isso ajudará qualquer líquido preso na tampa a gravitar para o fundo do frasco. Destampar parcialmente o frasco para injetáveis com cuidado e inserir uma linha PFP equipada com agulha de 18 G. Encha o headspace do frasco com PFP por 20 s de acordo com a etapa 3.5. Tampe o frasco e feche com Parafilm.
11. Meça a atividade do frasco em um calibrador de dose e anote o tempo.
    NOTA: Se a atividade adequada não foi transferida para o frasco, repita as etapas 4.5-4.11, adicionando um volume adicional apropriado de ⁶⁴CuCl₂.
12. Coloque o frasco para injetáveis num suporte de espuma e empurre-o para que a metade inferior do frasco para injetáveis fique exposta ao calor. Coloque o suporte no banho-maria de agitação a 60 °C e aqueça por 1 h.
13. Enquanto a reação de quelação ocorre, prepare as placas iTLC. Enquanto estiver usando luvas novas, corte o papel de cromatografia de microfibra de vidro em tiras de 1 cm x 8 cm. Aquecer as tiras num forno de secagem de vidro a 80 °C.
    NOTA: Esta etapa pode ser realizada em um laboratório não radioativo.
14. Após 1 h, retire o frasco para injetáveis do fogo na etapa 4.12 e limpe as bordas com um lenço de papel.
15. Gire o frasco para cima e para baixo manualmente com uma pinça com ponta de borracha para recondensar qualquer condensação nas paredes do frasco para a suspensão lipídica.
16. Com o frasco para injetáveis na posição vertical, sacuda a tampa enquanto estabiliza o tubo. Remova o Parafilm e limpe ao redor da tampa para remover qualquer água do banho presa.
17. Destampar cuidadosamente o frasco para injetáveis e aspirar 1-2 μL da suspensão lipídica. Coloque a suspensão a 1 cm do centro inferior de uma tira iTLC e tampe novamente o frasco. Deixe o local secar.
    NOTA: Idealmente, um mínimo de 2 iTLCs devem ser detectados por mistura de reação e desenvolvidos por suspensão lipídica radiomarcada para maior certeza.
18. Micropipeta 200 μL do eluente iTLC (preparado na etapa 1.4) no fundo de um tubo de ensaio de 10 mL. Alojar o tubo de ensaio em um recipiente de chumbo. Adicione o iTLC manchado ao tubo e deixe a tira desenvolver-se até que o eluente esteja a cerca de 1 cm do bordo superior da tira.
19. Remova as tiras iTLC desenvolvidas usando uma pinça. Segure a tira verticalmente e corte em terços sobre tubos de plástico de 5 mL compatíveis com γ balcão e tampa de pressão, de modo que cada terço da tira caia diretamente em um terço individual. Insira as tampas de pressão nos três tubos.
20. Meça os tubos contendo tiras e um tubo de controle vazio/tampado em um contador de γ para atividade de cobre-64 e registre as contagens por minuto (cpm) associadas. Subtraia a atividade do tubo de controle das outras leituras para corrigir a atividade de fundo.
    NOTA: As leituras corrigidas para o terço inferior da tira (peça 1) estão associadas a partículas de cobre-64 quelatadas a suspensão lipídica. A seção intermediária (peça 2) contém uma faixa de quelatos pirolipídicos de cobre-64 e ⁶⁴-livres na forma não supramolecular. A seção superior (peça 3) contém predominantemente cobre-64 livre.
21. Calcule a pureza radioquímica por meio da Equação 1.
    (Equação 1)
    NOTA: se o cpm para a peça 1 parecer excessivamente baixo (por ex.ample, menor ou equivalente às peças 2 ou 3) ou se alguma leitura estiver acima do limite de não linear/saturação do contador de γ, identifique um volume menor ou uma alíquota diluída (1-2 μL) da suspensão radiomarcada para iTLC.
22. Certifique-se de que a pureza radioquímica obtida de ambas as tiras de iTLC por suspensão lipídica seja ≥ 94% para continuar. Caso contrário, continue a aquecer a suspensão lipídica a 60 °C e monitore a quelação em intervalos de 30 minutos via iTLC.
23. Destampe o frasco para injetáveis de suspensão lipídica radiomarcada e micropipete 8,89 μL de NaOH 1 N na suspensão, pipetando para cima e para baixo para transferir completamente a base e neutralizar a suspensão. Tampe o frasco, gire manualmente com uma pinça para inverter/reverter e, em seguida, bata suavemente na tampa do frasco.
24. Preencha o headspace com PFP conforme a etapa 4.10, tampe e sele com Parafilm.

5. Ativação e isolamento de microbolhas

1. Ative a suspensão lipídica por meio de um agitador mecânico por 45 s a 4530 rpm para gerar uma suspensão de microbolhas leitosas. Deixe o frasco esfriar passivamente até RT por aproximadamente 10 min. A suspensão leitosa resultante se separará em duas camadas ao longo do tempo.
   NOTA: O conteúdo do frasco para injetáveis deve parecer leitoso após a ativação. Uma suspensão mais clara após a ativação é indicativa de ativação malsucedida, cujos colaboradores serão discutidos em seções posteriores.
2. Uma vez em RT, inverta / reverta suavemente o frasco para ressuspender a suspensão de microbolhas. Coloque o frasco sobre uma superfície plana e aguarde 2 minutos antes da decantação para obter a população de microbolhas desejada da seguinte forma:
   1. Equipe uma seringa de plástico de 1 mL com uma agulha de 18 G e ventile a seringa/agulha aspirando e mergulhando o ar para dentro/para fora. Na marca de 2 minutos, destampe rapidamente o frasco, quebrando o selo Parafilm em um movimento.
   2. Retire 400-550 μL do fundo do frasco (população alvo de microbolhas), evitando a aspiração da camada espumosa superior de populações maiores de microbolhas indesejadas.
      NOTA: Se necessário, incline o frasco para um lado para coletar os volumes finais na seringa para evitar aspirar a camada espumosa / mais leve.
3. Limpe as bordas da agulha cuidadosamente para remover quaisquer contaminantes espumosos e transfira a suspensão isolada de microbolhas para um tubo de microcentrífuga. Tampe suavemente (não abra ou feche abruptamente a tampa). Esta é a suspensão final de trabalho de microbolhas radiomarcadas.
4. Meça a atividade do produto final de microbolhas no calibrador de dose e anote o tempo. Divida este valor pelo volume de suspensão decantado na etapa 5.2 para obter um valor MBq·^mL-1 para calcular os volumes de injeção em função da aplicação de interesse.
   NOTA: As microbolhas radiomarcadas estão agora prontas a usar. A seção 6 pode ser executada até 24 h depois. Para obter informações sobre como essas microbolhas radiomarcadas podem ser injetadas e rastreadas in vivo por meio de imagens multimodais (ultrassom, PET, fluorescência), consulte Rajora et ^al.15.

6. Validando a eficiência da radiomarcação

1. Ressuspenda a suspensão de microbolhas por meio de pipetagem suave ou inversão do frasco.
   NOTA: Nunca vórtice um produto de trabalho de microbolhas. O vórtice desestabiliza as suspensões de microbolhas.
2. Adicione 10-200 μL da suspensão radiomarcada a uma unidade de filtro de centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) de 0,5 mL e 30.000. Se estiver usando volumes <200 μL, adicione ddH₂O à unidade de filtro para constituir um volume total de 200 μL. Aloje a unidade de filtro em um tubo de microcentrífuga compatível e tampa.
   NOTA: Recomenda-se a realização de um teste de radiomarcação antes e separadamente de qualquer uso aplicado in vitro ou in vivo de microbolhas radiomarcadas para garantir a conclusão bem-sucedida do protocolo. Nesse caso, um volume maior (por exemplo, 200 μL) pode ser usado nesta etapa. Quando o protocolo for usado posteriormente para uma sessão de tratamento, prepare os volumes/injeções de tratamento primeiro e, em seguida, conduza a seção 6 com a suspensão de microbolhas radiomarcada restante o mais cedo possível.
3. Centrifugue por 10 min a 12.000 x g em RT.
   NOTA: a microcentrífuga deve ser cercada por blindagem de chumbo.
4. Corte a conexão entre o tubo da microcentrífuga e sua tampa com uma tesoura.
   1. Coloque a tampa em um frasco de cintilação de 20 mL rotulado como "tampas". Transfira a unidade de filtro para um novo tubo de microcentrífuga (tubo 2).
   2. Coloque o primeiro tubo de microcentrífuga com infranadante em um frasco de cintilação de 20 mL rotulado como "tubo 1". Adicione 200 μL ddH₂O à unidade de filtro no tubo 2.
5. Centrifugue a unidade de filtro no tubo 2 a 12.000 x g em RT.
6. Repita as etapas 6.4 e 6.5. Adicione a tampa do tubo 2 ao frasco de cintilação "tampas" que abriga a tampa do tubo 1. Coloque o tubo 2 em um novo frasco de cintilação de 20 mL.
7. Corte a tampa do terceiro tubo de microcentrífuga e coloque no frasco para "tampas" conforme a etapa 6.4. Transfira a unidade de filtro para um novo frasco de cintilação de 20 mL rotulado como "unidade", garantindo que o infranadante permaneça no tubo 3 e não seja transferido para o frasco "unidade". Se forem vistas gotas nas bordas da unidade de filtro, coloque-a de volta no tubo 3, tampe e gire para baixo por 10 s. Coloque o tubo 3 em um novo frasco de cintilação de vidro de 20 mL.
8. Tampe os 5 frascos para injetáveis de cintilação (tubo 1, tubo 2, tubo 3, tampas e unidade). Prepare um frasco para injetáveis de cintilação de 20 mL vazio e tampado como um controle em branco.
9. Meça os seis frascos de cintilação em um balcão de γ para atividade de cobre-64. Subtraia a atividade do frasco em branco da de outros frascos. Calcule a eficiência de radiomarcação/quelação usando a Equação 2.
   (Equação 2)
   NOTA: Se o cpm da unidade for excessivamente baixo (ex, inferior ou equivalente aos tubos) ou se alguma leitura estiver acima do limite não linear/saturação de γ contadores, armazene os frascos de cintilação em recipientes de chumbo por até 4 dias para permitir que a atividade decaia até que os valores estejam abaixo do limite e meça novamente.

7. Caracterização físico-química de microbolhas

NOTA: A menos que um laboratório tenha equipamento designado para processamento de amostras radioativas, a caracterização físico-química de microbolhas deve ser realizada usando amostras quelatadas de cobre "frias" não radioativas. Essa rotulagem "fria" facilita a avaliação do rendimento das microbolhas, o que é vital para avaliar a dose de microbolhas usada para a aplicação pretendida. Além disso, permite a comparação com microbolhas não quelatadas de controle para garantir que o processo de radiomarcação não perturbe as propriedades das microbolhas. Essa marcação "fria" e a caracterização físico-química associada devem ocorrer antes da aplicação de microbolhas radiomarcadas e podem ser usadas como feedback se forem necessárias modificações na marcação radioativa (consulte Discussão).

1. Rotulagem de microbolhas de cobre "frias"
   1. Usando o volume de solução de ⁶⁴CuCl₂ adicionado à suspensão lipídica na etapa 4.7, composição molar de porfirina% dentro dos filmes lipídicos e atividade específica encontrada na ficha do produto ⁶⁴CuCl₂ , calcule a proporção molar aproximada de metal: porfirina alcançada durante a radiomarcação. Exemplos de cálculos podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1.
   2. Siga as seções 1-3 do protocolo atual.
   3. Prepare uma solução de CuCl₂ 0,1 mg · ^mL-1 em HCl 0,1 N.
   4. Micropipete o volume apropriado desta solução de CuCl₂ para a suspensão lipídica calculada a partir do passo 7.1.1 e tampe o frasco para injetáveis.
   5. Gire o frasco para misturar o CuCl₂ na suspensão lipídica, preencha o headspace com PFP, sele e aqueça de acordo com as etapas 4.9, 4.10 e 4.12. Não são necessárias pinças de borracha para o manuseio do frasco.
   6. Após 1 h, retire o frasco do fogo e limpe o exterior para secar. Deixe o frasco esfriar até RT.
   7. Neutralize a suspensão lipídica, misture, preencha o headspace com PFP e sele de acordo com as etapas 4.23 e 4.24.
   8. Ative a suspensão de microbolhas e transvase para obter um produto funcional de acordo com as etapas 5.1-5.3.
2. Dimensionamento de microbolhas
   NOTA: O dimensionamento de microbolhas deve ser realizado imediatamente após a ativação. Se estiver avaliando a estabilidade da suspensão de trabalho, repita a preparação da amostra e as medições em intervalos de 30 minutos. Normalmente, uma janela de 1-2 h é representativa do período de tempo durante o qual a suspensão de trabalho de microbolhas seria usada/administrada após a ativação. O objetivo das medições de estabilidade é garantir que o tamanho e o rendimento das microbolhas sejam mantidos durante esse período, de modo que todos os tratamentos administrados a partir da solução de trabalho contenham populações de microbolhas semelhantes.
   1. Ligue o Coulter Counter (CC) e defina os seguintes parâmetros usando a ferramenta Edit SOP : abertura de 30 μm, faixa de tamanho de 0,6-18 μm, corrente de abertura 400-600 μA, préamp ganho 4-8, 400 caixas, nivelamento antes e depois de cada execução, análise volumétrica, 5 μL sample volume.
   2. Filtre o eletrólito CC através de uma unidade de filtragem a vácuo de mídia de 0,2 μm. Encha o recipiente de eletrólitos e um recipiente separado para preparação de amostras.
   3. Medição de fundo: Encha uma cubeta descartável de 10 mL com eletrólito filtrado de 10 mL e execute uma medição de linha de base. Certifique-se de que as contagens estejam abaixo de 400. Caso contrário, lave o instrumento.
   4. Medição de amostra
      1. Adicione 10 mL de eletrólito filtrado a uma nova cubeta. Ressuspenda a suspensão de microbolhas invertendo/revertendo manualmente. Micropipeta a 5 μL do centro inferior do frasco. Limpe as bordas da ponta da pipeta (exceto a abertura) e mergulhe a amostra diretamente no eletrólito preparado.
      2. Pipete para cima e para baixo para transferir completamente a suspensão. Use a ponta da pipeta para girar suavemente o eletrólito até que os "tufos" da suspensão de microbolhas se dispersem.
   5. Meça a amostra no CC (duas corridas por analito).
      NOTA: Um volume de amostra de microbolhas de 5 μL é normalmente apropriado para amostras contendo concentrações de 1-5 x 10⁹ microbolhas · ^mL-1 . Este volume de amostra pode precisar ser ajustado dependendo da configuração específica do instrumento CC e se os rendimentos de microbolhas da amostra estiverem fora da faixa acima.
3. Imagem confocal
   NOTA: Realize imagens confocais imediatamente após o dimensionamento das microbolhas e dentro do prazo de estabilidade das microbolhas retidas, conforme a nota na etapa 7.2.
   1. Ressuspenda a suspensão de microbolhas e transfira 1-5 μL para o centro de uma lâmina de microscópio de vidro. Coloque uma lamínula cuidadosamente sobre a gota de suspensão de microbolhas, evitando qualquer aprisionamento de bolhas de ar. A suspensão se espalhará sob a lamínula.
   2. Visualize as microbolhas com ampliação de 60x com uma objetiva de imersão em óleo. Obtenha imagens em campo claro e sob excitação de 633 nm/emissão de 640-765 nm. Sobreponha as imagens de campo claro e fluorescência.
      NOTA: O sinal de fluorescência deve se sobrepor ao invólucro de todas as partículas visíveis quando a sonda for incorporada de forma homogênea ao invólucro da microbolha.
4. Espectrofluorometria
   NOTA: As medições de espectrofluorometria podem ser realizadas dentro de 24 h após a ativação das microbolhas.
   1. Prepare 1% de Triton X-100 conforme descrito anteriormente³⁵.
   2. Ligue o espectrofluorômetro 15-30 minutos antes da primeira medição.
   3. Meça os espectros de fluorescência de 1% Triton X-100 usando uma excitação de 410 nm e uma faixa de emissão de 600-800 nm em uma cubeta de quartzo. Selecione a opção para normalizar o sinal pelo sinal do detector de referência (geralmente chamado de S1/R1).
      NOTA: Triton X-100 borbulha facilmente quando pipetado. Como tal, ao transferir para uma cubeta, mergulhe apenas na primeira parada da micropipeta.
   4. Enxágue a cubeta com metanol e seque com ar pressurizado entre as amostras.
   5. Transfira 6 mL de Triton X-100 a 1% para um tubo de centrífuga de 15 mL. Ressuspenda a suspensão de microbolhas e aspire 1 μL por meio de micropipeta. Limpe as bordas da ponta da pipeta, exceto a abertura, e transfira a amostra para o Triton X-100 a 1% preparado, pipetando para cima e para baixo para completar a transferência. Vortex a solução e transfira-a para uma cubeta de quartzo.
      NOTA: Ajuste a proporção da amostra: 1% Triton X-100 de acordo com a sensibilidade do instrumento e o limite de saturação não linear.
   6. Meça esta amostra usando os parâmetros da etapa 7.4.3. Essa medida corresponde a partículas "interrompidas".
   7. Repita as etapas 7.4.3-7.4.6 usando PBS. Esta medida corresponde a partículas "intactas".
   8. Corrija a linha de base dos espectros de amostra interrompidos e intactos usando medições Triton X-100 e PBS de 1%, respectivamente.
   9. Calcule a eficiência de têmpera (QE) por meio da Equação 3 usando o sinal de fluorescência corrigido pela linha de base integrado da amostra intacta em PBS (F_PBS) e em 1% Triton X-100 (F_Tx):
      (Equação 3)
5. Espectroscopia UV-Vis
   NOTA: As medições de espectroscopia podem ser realizadas até 72 h após a ativação das microbolhas.
   1. Sonicar uma alíquota da suspensão de microbolhas num tubo de microcentrífuga utilizando um sonicador de banho à RT até que a suspensão fique transparente. Isso reduz os efeitos de dispersão durante a espectroscopia.
   2. Ligue o espectrofotômetro 10 minutos antes da primeira medição. Selecione um intervalo de varredura de 0,25 nm e uma faixa de aquisição de 200-800 nm. Ative a subtração da linha de base.
   3. Use uma cubeta de quartzo de 1 cm de comprimento de caminho para as medições. Enxágue a cubeta com metanol entre as medições e seque com ar pressurizado.
   4. Obtenha uma medição de linha de base de metanol.
   5. Vortex a suspensão de microbolhas transparente e sonicada e transfira 10-50 μL para um tubo de microcentrífuga contendo 200-1000 μL de metanol. Certifique-se de que o volume de metanol seja medido e adicionado ao tubo por meio de uma seringa de microlitro de vidro limpa. Vortex a solução para obter uma amostra "interrompida".
      NOTA: A diluição da amostra dependerá da eficiência de carregamento de porfirina e da composição molar%. Uma diluição de 20x é apropriada para uma composição de microbolhas pirolipídicas de 30 mol%.
   6. Colete o espectro UV-Vis.
   7. Repita as etapas 7.5.4 a 7.5.6 usando PBS em vez de metanol.
      NOTA: Uma micropipeta pode ser usada para medir volumes de PBS em vez de uma seringa de microlitro de vidro.

8. Modificações no protocolo

1. Quelante alternativo
   1. Preparar as películas lipídicas de acordo com o ponto 2, substituindo o pirolípido por um quelante de cobre conjugado com lípidos alternativo [por exemplo, ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-dietilenotriaminapentaacético (sal de amónio), doravante designado por DTPA-lípidos]. Use o Arquivo Suplementar 1 para calcular a massa e os volumes de estoque necessários.
      NOTA: Testar várias composições molares de um quelante alternativo é provavelmente necessário para determinar o limite superior além do qual microbolhas estáveis com alto rendimento não podem ser geradas.
   2. Siga as seções 3 a 6 para gerar e caracterizar microbolhas radiomarcadas.
   3. Siga as etapas 7.1 a 7.3 para caracterizar microbolhas quelatadas de cobre "frias". Apenas a aquisição de imagens de microscopia confocal de campo claro é necessária para avaliar a morfologia das partículas. Se o quelante alternativo for fluorescente, realizar microscopia confocal com os comprimentos de onda de excitação e emissão associados, além das etapas 7.4 e 7.5.
2. Fluoróforo alternativo
   1. Prepare filmes lipídicos de acordo com a seção 2, substituindo o pirolipídio por um fluoróforo conjugado ou intercalante lipídico alternativo (por exemplo, DiI). Use o Arquivo Suplementar 1 para calcular os volumes de massa e estoque necessários.
      NOTA: Testar várias composições molares de um fluoróforo alternativo é provavelmente necessário para determinar o limite superior além do qual microbolhas estáveis com altos rendimentos não podem ser geradas.
   2. Siga a seção 3 usando PGG em vez de AA-PGG.
   3. Conclua as etapas 5.1 a 5.3 e as etapas 7.2 a 7.5.
3. Abordagem "spikeing": Rotulagem de suspensões lipídicas de microbolhas pré-formadas
   1. Gere um filme lipídico de porfirina conforme a seção 2, usando apenas pirolipídio sem outros constituintes lipídicos. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para quantidades de pirolipídios.
   2. Hidrate o filme pirolipídico de acordo com a seção 3 usando 100-200 μL de AA-PGG (ou PGG se a marcação radioativa não for necessária) em vez de 1 mL de tampão de hidratação.
   3. Transfira toda a suspensão pirolipídica para uma suspensão de microbolhas lipídicas pré-fabricada.
   4. Preencha o headspace com PFP, aqueça e sonique a suspensão e sele sob PFP de acordo com as etapas 3.4 a 3.9. Monitore a dispersão da suspensão pirolipídica na suspensão de microbolhas lipídicas pré-fabricada e conduza ciclos de calor / sonicação até que esteja completamente dispersa.
      NOTA: Se estiver usando um frasco de microbolhas comercial selado com septo, a suspensão pirolipídica pode ser introduzida no frasco através de uma seringa/agulha sem reabastecer o headspace do frasco com PFP.
   5. Realize radiomarcação (consulte a etapa 8.3.5.1 abaixo), ativação, isolamento (consulte NOTA abaixo) e caracterização associada de acordo com as seções 4 a 7.
      1. Uma abordagem alternativa é primeiro radiomarcar a suspensão pirolipídica hidratada, monitorar a pureza radioquímica de >94%, neutralizar com 1 N NaOH (modificar o volume de acordo com o volume AA-PGG usado para hidratar o filme pirolipídico) e, em seguida, introduzir a suspensão pirolipídica radiomarcada na suspensão lipídica de microbolhas pré-fabricada de acordo com a etapa 8.3.3.
         NOTA: Esta abordagem modificada só deve ser usada para gerar microbolhas radiomarcadas fluorescentes ou multimodais se seguida por um processo de isolamento que remova vesículas multilamelares submicrônicas criadas durante a hidratação lipídica, mas não incorporadas em microbolhas. Consulte Discussão para obter mais detalhes.

Resultados

Os principais resultados quantificáveis ao fabricar microbolhas radiomarcadas são a pureza radioquímica e a eficiência da radiomarcação. Este protocolo usa iTLC e um procedimento centrífugo validado, respectivamente, para caracterizar cada um. A Figura 2A mostra que as purezas e eficiências radioquímicas médias de ≥95% foram alcançadas em formulações comerciais que imitam microbolhas nas quais o lipídio do hospedeiro foi substituído por piro...

Discussão

O atual protocolo de radiomarcação de microbolhas lipídicas atinge >95% de pureza radioquímica, eficiência de quelação de >95% e retenção de propriedades físico-químicas de microbolhas sem a necessidade de qualquer purificação pós-rotulagem. Essas realizações representam avanços anteriormente não alcançados para os protocolos de rotulagem existentes. A falta de etapas de purificação permite o uso mais rápido de radioisótopos (neste caso, cobre-64) e, portanto, a re...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
64CuCl2	Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of Radiology	N/A	Order in small volume (<10 µL) dissolved in 0.1 N HCl
Acetic acid	Any company		≥ 95% purity
Aluminum foil	Any company
Ammonium acetate	Any company		Purity: ≥ 98%
Balance - analytical	Any company		Able to measure down to 0.1 mg
Bath sonicator	Any company		Can be heated to 69 oC
CC aperture - 30 micron	Beckman Coulter	A36391	Particle diameter range: 0.6-18 um
CC electrolyte	Beckman Coulter	8546719	Isoton II diluent
CC Software	Beckman Coulter	Multisizer 4e
Centrifuge filter units (0.5 mL 30,000 MWCO) with compatible microcentrifuge tubes	MilliporeSigma	UFC503096	Amicon Ultra - 0.5 mL
Centrifuge tubes - 15 mL with caps	Any company
Chloroform	Any company		Purity: ≥ 99.8%
Coulter counter	Beckman Coulter	B43905	Multisizer 4e Coulter Counter
Cover slips	VWR	48393081	VWR micro cover glass
CuCl2	Any company		Ensure not oxidized
CuCl2
Cuvette- quarts, 1 cm path length	Any company
Cuvettes - 10 mL plastic for CC measurements	Beckman Coulter	A35471	Coulter Counter Accuvette ST
ddH2O	Any company		Can be obtained through an ultrapure water purification system
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)	Any company		Powder form
Dose calibrator	Any company		Able to read copper-64
DPPA (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt))	Avanti Polar Lipids	830855P	Powder form
DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850355P	Powder form
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt))	Avanti Polar Lipids	880200P	Powder form
DTPA-lipid (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid (ammonium salt))	Avanti Polar Lipids	790106P	Powder form
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Any company
Gamma counter	Any company		Able to read copper-64
Gamma counting tube push caps	Globe Scientific	22-171-665	Flanged plug caps for 12 mm tubes
Gamma counting tubes	Sarstedt	55.1579	5 mL, 75 x 12 mm, PS
Glass beaker - 250 mL	Any company		Able to withstand temperatures up to 100 oC
Glass drying oven	Any company		Can be heated to 80 oC
Glass microliter syringes - 25, 50, 100, 1000 µL	Any company		Compatible with organic solvents
Glass scintillation vials - 20 mL	VWR	66022-081	VWR® Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Caps, With pulp foil liner
Glass vials - 0.5 dram	VWR	66011-020	VWR Vial 1/2 dram, with black phenolic screw cap and polyvinyl-faced pulp liner
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757-1L	Purity:  ≥ 99.0%
Graduated pipette/gun	Any company
Hot/stir plate			Equipped with temperature prob for automatic tempearture control
Hydrochloric acid - 0.1 N	Any company
iTLC plates	Agilent	A120B12	iTLC-SA chromatography paper
Laboratory tissues	Any company
Media vaccuum filtration unit	Any company		0.22 micron pore size, PES membrane, 500 mL funnel capacity
Methanol	Any company		Purity:  ≥ 99.8%, HPLC grade, meets ACS specifications
Microcentrifuge tubes non sterile - 1.5 mL	Any company
Microcentrifuge tubes sterile - 1.5 mL	Any company
Micropipetes - p1000, p200, p20, p10	Any company		Ensure are calibrated
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	Superfrost Plus Microscope Slides Precleaned
Needles - 18 G			Sterile
Parafilm	Any company
PBS	Sigma Aldrich	D8537-500ML	DPBS, modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
PFP	FluoroMed	APF-N40HP	Purity:  ≥ 99.8%
PFP line	Any company		1/4 inch diameter plastic hose cut about 50 cm in length
PFP regulator	Swagelok	SS-1RF4 and SS-4HC-1-4
pH meter	Any company
pH standards 4 and 7	Any company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - non sterile	Any company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - sterile	Any company
Plastic syringe - 1 mL	Any company		Sterile
Propylene glycol	BioShop	PRO888.500	Purity:  ≥ 99.5%
Pyro-lipid	N/A		Made in-house
Rubber tipped forceps	Any company		Mix of fine-tipped and flat/square edges recommended
Scissors	Any company
Sodium hydroxide - 1 N	Any company
Sodium hydroxide - 10 N	Any company
Spectrofluorometer	Any company		Capable of 410 nm excitation and 600-850 nm emission
Spectrofluorometry software	Horiba	FluorEssence
Spectrometer	Any company
Syringe - 1 mL	Any company		Disposible, plastic, sterile
Syringe filters - 0.2 micron pore size	Any company		Membrane material: PES or other compatible with ammonium acetate/acetic acid and PBS
Test tube - 10 mL
Triton X-100	Any company
Vacuum desicator/vacuum	Any company
Vialmix	Lantheus Medical Imaging	515030-0508	Referred to in protocol as a mechanical vial shaker
Weigh paper	Any company		To avoid losing product, cutting weigh paper into 3x3 cm squares is recommended