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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Lipid-Mikrobläschen und eine kompatible Ein-Topf-Mikroblasen-Radiomarkierungsmethode mit einer aufreinigungsfreien Markierungseffizienz von >95 %, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Mikroblase bewahrt. Diese Methode ist bei verschiedenen Lipid-Mikrobläschen-Formulierungen wirksam und kann auf die Erzeugung radioaktiver und/oder fluoreszierender Mikrobläschen zugeschnitten werden.

Zusammenfassung

Mikrobläschen sind lipidumhüllende, gasgefüllte Partikel, die sich von vaskulären Ultraschallkontrastmitteln zu revolutionären Krebstherapieplattformen entwickelt haben. In Kombination mit therapeutischem fokussiertem Ultraschall (FUS) können sie physiologische Barrieren (z. B. Blut-Hirn-Schranke) sicher und lokal überwinden, Medikamente an sonst unzugängliche Krebsarten (z. B. Glioblastom und Bauchspeicheldrüsenkrebs) abgeben und neurodegenerative Erkrankungen behandeln. Das therapeutische Arsenal der Mikroblasen-FUS entwickelt sich in neue Richtungen, einschließlich synergistischer Kombinationsstrahlentherapie, multimodaler Bildgebung und All-in-One-Wirkstoffbeladung und -abgabe aus Mikroblasenschalen.

Die Markierung von Mikrobläschen mit Radiotracern ist der Schlüssel zur Etablierung dieser erweiterten theranostischen Fähigkeiten. Bestehende Strategien zur Radiomarkierung von Mikroblasen beruhen jedoch auf Reinigungsmethoden, von denen bekannt ist, dass sie die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Mikroblasen stören, kurzlebige Radioisotope verwenden und nicht immer zu einer stabilen Chelatbildung führen. Zusammengenommen führt dies zu Unklarheiten über die Genauigkeit der Mikroblasen-Radiobildgebung und die Effizienz der Tumor-Radioisotopenabgabe.

Dieses Protokoll beschreibt eine neue, aufreinigungsfreie Eintopf-Methode zur Markierung von Mikroblasen, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Mikroblase bewahrt und gleichzeitig eine Radioisotopen-Chelat-Effizienz von >95 % erreicht. Es ist vielseitig einsetzbar und kann erfolgreich auf kundenspezifische und kommerzielle Mikroblasenformulierungen mit unterschiedlicher Länge der Acyllipidkette, Ladung und Chelator-/Sondenzusammensetzung (Porphyrin, DTPA, DiI) angewendet werden. Es kann adaptiv bei der Herstellung von Mikroblasen von Grund auf und auf vorgefertigte Mikroblasenformulierungen mit modularer Anpassbarkeit von Fluoreszenz und multimodalen Fluoreszenz-/radioaktiven Eigenschaften angewendet werden. Dementsprechend ermöglicht dieses flexible Verfahren die Herstellung maßgeschneiderter, rückverfolgbarer (radio, fluoreszierender oder radio-/fluoreszierender aktiver) multimodaler Mikrobläschen, die für die Weiterentwicklung mechanistischer, bildgebender und therapeutischer Mikroblasen-FUS-Anwendungen nützlich sind.

Einleitung

Mikrobläschen sind mikrometergroße supramolekulare Theranostika mit einem Gaskern, der durch ein Protein, Polymer oder in den meisten Fällen eine Lipidhülle stabilisiert wird (Abbildung 1A). Wenn Mikrobläschen in den Blutkreislauf injiziert werden, behalten sie Gas-Flüssigkeits-Grenzflächen bei, die durch Ultraschall für minutenlange Zeiträume vor der Auflösung ihrer Gaskerne detektiert werden können 1,2. Folglich war die erste klinische Verwendung von Mikrobläschen als Kontrastmittel für die Echtzeit-Ultraschallbildgebung3. Die Erfindung des therapeutisch fokussierten Ultraschalls (FUS) erweiterte den klinischen Nutzen der Mikroblase. Bei Stimulation durch niederfrequente FUS oszillieren Mikrobläschen und erzeugen gezielte, abstimmbare mechanische Kräfte, die von der transienten Gefäßpermeabilisierung bis zur fokalen Gewebeablation reichen 4,5. Infolgedessen wurde in den letzten 20 Jahren die Mikrobläschen-FUS für die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Verabreichung von Tumoren (z. B. Bauchspeicheldrüsen-, Hirn- und Lebermetastasierungen), die Verabreichung von Medikamenten und bildgebenden Sonden, die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen und die Krebsablationerforscht 6,7,8,9,10,11.

Das theranostische Arsenal der Mikrobläschen entwickelt sich weiter in neue und aufregende Richtungen. Herkömmliche Mikrobläschen-FUS-Verabreichungsanwendungen beruhen auf der gleichzeitigen Verabreichung von therapeutischer oder bildgebender Fracht neben kommerziellen Mikrobläschen. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verbesserung der Mikroblasen-FUS-Verabreichungsfähigkeiten durch das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Mikroblasenhülle und biologischer Hülle, die Erforschung maßgeschneiderter nichtkommerzieller Mikroblasenformulierungen und die Erzeugung von all-in-one theranostischen Mikrobläschen mit Fracht, die direkt auf die Mikroblasenhüllegeladen wird 12,13,14. Tatsächlich verwenden etwa 40 % der Studien zur Verabreichung von Lipid-Mikrobläschen solche schalenbeladenen Mikrobläschen15. Über die Bildgebung und die Verabreichung von Medikamenten hinaus hat sich Mikroblasen-FUS auch als vielversprechend erwiesen, um die Strahlentherapie bei Krebszu verbessern 16 und die antineoplastische Wirkung von ansonsten gutartigen schalenbeladenen Wirkstoffen durch die sonodynamische Therapie zu aktivieren17,18.

Diese konventionellen und erweiterten Richtungen bei Mikrobläschenkrebsanwendungen können strategisch weiter vorangetrieben werden, indem Mikrobläschenschalen mit radioaktiven Tracern markiert werden. Im Bereich der All-in-One-Fracht-beladenen Mikrobläschen erleichtert eine solche Radiomarkierung 1) die quantitative Bewertung der On- und Off-Target-Bioverteilung dieser beladenen Mikrobläschenschalen nach Goldstandard, leitet 2) pharmakokinetische Struktur-Wirkungs-Beziehungen ab, die eine optimale Auswahl der Mikroblasenzusammensetzungen ermöglichen, um die On-Target-Abgabe zu maximieren, und 3) leitet eine strategische und geeignete bildgesteuerte Anwendungs- und Behandlungsplanung (z. B. Arten von Gewebetargets, Dosimetrie, Medikamentenauswahl zur Minderung von Sicherheitsbedenken außerhalb des Ziels, Nutzen im Vergleich zu herkömmlichen Co-Treatment-Paradigmen) von All-in-One-Cargo-Loaded-Systemen15,19. In einem präklinischen Stadium kann ein solches Verständnis des Schicksals von Mikrobläschenschalen auch breitere Wirkmechanismen von Mikrobläschen-FUS aufklären. So wurde beispielsweise gezeigt, dass der Lipidtransfer von Mikrobläschenschalen zu Zielzellen die FUS-aktivierte Sonoporation beeinflusst12,20. Das Verständnis und die Optimierung eines solchen Transfers können daher präklinische und klinische Mikroblasen-FUS-Therapien beeinflussen, bei denen Sonoporation eine Rolle spielt (in vitro Transfektion, Wirkstoffabgabe, Tumorablation, Strahlensensibilisierung und sonodynamische Therapie 20,21,22,23,24,25). Duale Ultraschall- und Radiobildgebungsgeräte würden auch die Öffnung von FUS-Gefäßen und die Überwachung der Behandlung (z. B. BHS-Öffnungskinetik) mit einem einzigen Wirkstoff anstelle herkömmlicher Dual-Agenten-Designs ermöglichen26. In gleicher Weise könnte die Lipid-Mikrobläschen-Radiomarkierung als All-in-One-Alternative zu Mikroblasen-FUS + Radiopharmaka als All-in-One-Alternative zu Mikroblasen-FUS + radiopharmazeutischen Co-Delivery-Plattformen dienen27.

Die Zerbrechlichkeit von Mikrobläschen ist eine unerhebliche Herausforderung für eine solche Kennzeichnung. Alle bestehenden Radiomarkierungsstrategien sind durch Reinigungsmethoden eingeschränkt, von denen bekannt ist, dass sie die Stabilität und Größe der Mikroblase stören, während einige auch eine ineffektive und instabile Radiomarkierung aufweisen 28,29,30,31,32. Die Anforderungen an die Reinigung führen auch zu langwierigeren Protokollen. In Kombination mit der Verwendung kurzlebiger Radioisotope (z. B. 18F t1/2 1,8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,3268Ga t1/2 1 h31) führt dies zu Ineffizienzen im Zusammenhang mit dem Radioisotopenzerfall und schränkt die Zeitrahmen für die Röntgenbildgebung und die Behandlungsplanung ein. Zusammengenommen bergen diese Einschränkungen das Risiko einer verkürzten und nicht repräsentativen Röntgenbildgebung, ungenauer pharmakokinetischer Daten und einer ineffizienten Abgabe von Tumorradioisotopen.  

In diesem Bericht werden diese Einschränkungen durch die Nutzung der starken und stabilen Metallchelatisierungsfähigkeiten von Porphyrin überwunden. Porphyrine sind organische, heterocyclische Makromoleküle mit einem hochkonjugierten planaren Ring und einer zentralen Koordinationsstelle, die eine Vielzahl von Metallen aufnehmen kann. Dazu gehören langlebige Radioisotope wie Kupfer-64 (t1/2 12,7 h), ein Radiopharmakon mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und γ-Zähl-Machbarkeiten33. Wenn Porphyrine an ein Lipidrückgrat konjugiert werden, können sie leicht in supramolekulare Strukturen eingebaut und anschließend mit Kupfer-64 mit Geschwindigkeit, hoher Chelateffizienz und Serumstabilität markiert werden, während die Eigenschaften der unmarkierten Ausgangspartikelbeibehalten werden 33,34. Darüber hinaus sind Porphyrine fluoreszenzaktiv mit modularer Selbstlöschung in Nano- und Mikropartikeln, die bei Partikelaufschluss wiederhergestellt wird; eine ergänzende Auslesung zu PET und γ-Zählen, die sowohl die Analyse des Verbleibs von Schüttgütern als auch von mikroskopischen Schalen ermöglicht (Abbildung 1A)15.

Durch die Verwendung von Porphyrin-Lipid als Chelator wurden diese Eigenschaften genutzt, um eine neue, aufreinigungsfreie Eintopf-Methode zur Radiomarkierung von Mikrobläschen zu entwickeln (Abbildung 1B, C), die die Einschränkungen bestehender Methoden zur Radiomarkierung von Mikrobläschen überwindet. Dieses Protokoll erreicht eine Kupfer-64-Chelateffizienz von >95 %, erfordert keine Reinigung nach der Markierung und bewahrt die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Mikroblase. Es kann leicht in die "grundlegende" Herstellung von Lipid-Mikrobläschen integriert werden, bevor diese aktiviert werden (Abbildung 1B). Es ist vielseitig und kann erfolgreich auf kundenspezifische und kommerzielle Mikroblasenformulierungen mit unterschiedlicher Acyllipidkettenlänge (C16 bis C22), Ladung (neutral und anionisch) und Porphyrin-Lipid-Zusammensetzungen (1 mol %, 10 mol %, 30 %) angewendet werden, wodurch Mikrobläschen mit Radio- und Fluoreszenzaktivität erzeugt werden. Seine Anpassungsfähigkeit kann auch über Porphyrin hinausgehen. Das Ein-Topf-Protokoll kann modifiziert werden, um alternative kommerziell erhältliche Chelatoren (z. B. Diethylentriaminpentaacetat (DTPA)-Lipid) und Fluorophore (z. B. DiI) zu verwenden. Es kann auch modifiziert werden, um vorgefertigte Mikroblasenformulierungen durch einen "Spiking"-Ansatz zu kennzeichnen. Dementsprechend ermöglicht dieses Verfahren die Herstellung von maßgeschneiderten, rückverfolgbaren (Radio-, Fluoreszenz- oder dualen Radio-/Fluoreszenz-Aktiven) Mikrobläschen, die für die Weiterentwicklung mechanistischer, bildgebender und therapeutischer Mikroblasen-FUS-Anwendungen nützlich sind. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von Lipid-Mikrobläschen, die Anwendung des Ein-Topf-Radiomarkierungsprotokolls, die erforderliche Radiomarkierung und die Charakterisierung physikalisch-chemischer Eigenschaften sowie mögliche Modifikationen.

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Abbildung 1: Protokoll zur Herstellung von Mikrobläschen und zur radioaktiven Markierung. (A) Porphyrin-Lipid in Form von Pyropheophorbid-a-Lipid dient als multimodaler Chelator innerhalb dieses Protokolls. Als Monomer, das an Kupfer-64 (i) chelatisiert ist, verfügt es über PET- und Bildgebungsfunktionen. Seine Fluoreszenz wird in Partikelform (Mikrobläschen (ii) und ihre Nanoprogenien nach der Auflösung (iii)) gelöscht und nicht mit Partikelaufschluss (iv) gelöscht. (B) Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll zur Hydratation/Aktivierung von Lipidfilmen zur Erzeugung von Lipidmikrobläschen aus dem Boden und (C) die Integration der Eintopf-Radiomarkierung zwischen der Bildung der Lipidsuspension und der Aktivierung der Mikroblase. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Rajora et al.15 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

1. Aufbereitung der Reagenzien

  1. Ammoniumacetat-Puffer (0,1 M, pH 5,5) vorbereiten
    1. Wiegen Sie mit einer Analysenwaage 770,8 mg Ammoniumacetat auf ein Wägepapier. Die gewogene Menge wird in ein sauberes 250-ml-Glasbecherglas umgefüllt.
    2. 90 ml doppelt destilliertes Wasser (ddH2O), gemessen mit einer Messpipette, in das Becherglas geben. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und stellen Sie das Becherglas auf eine magnetische Rührplatte, um das Ammoniumacetat aufzulösen. Rühren Sie mit einer Geschwindigkeit, die einen leichten Wirbel erzeugt, ohne dass die Lösung spritzt.
    3. Kalibrieren Sie ein pH-Messgerät gemäß den Geräteanweisungen unter Verwendung der Standards pH 4 und 7. Führen Sie nach der Kalibrierung die pH-Sonde in den Ammoniumacetat-Puffer ein.
    4. Geben Sie 104 μl Essigsäure in die Lösung, rühren Sie um, bis sie sich aufgelöst hat, und messen Sie den pH-Wert.
      HINWEIS: Der pH-Wert sollte zu diesem Zeitpunkt nahe 5,5 liegen.
    5. Passen Sie den pH-Wert des Puffers an, indem Sie mit einer Mikropipette 10 N Natriumhydroxid (oder Salzsäure, wenn der Puffer zu basisch wird) in Schritten von 5-10 μl hinzufügen. Rühren Sie um, messen Sie den pH-Wert und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf. Notieren Sie sich die Menge der zugegebenen Base/Säure.
    6. Fügen Sie genügend Volumen von ddH2O hinzu, um insgesamt 100 mL Puffer zu erzeugen.
      HINWEIS: Wenn z. B. 45 μl 10 N Natriumhydroxid während der pH-Einstellung verwendet werden, werden 9,851 ml ddH2O in das Becherglas gegeben (100 mL [Zielvolumen] - 90 mL [Schritt 1.1.2] - 0,104 mL [Schritt 1.1.4] - 0,045 mL [Schritt 1.1.5] = 9,851 mL).
    7. Rühren Sie den Puffer ein letztes Mal gründlich um, bevor Sie ihn in einen Vorratsbehälter mit Deckel umfüllen.
    8. Reinigen Sie das pH-Messgerät gemäß den Anweisungen des Geräts.
      ACHTUNG: Konzentriertes wässriges Natriumhydroxid und Salzsäure können Hautreaktionen hervorrufen und sollten mit Handschuhen angefasst werden.
  2. Hydratationspuffer (PGG) vorbereiten
    1. Aspirieren Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine Spritze und bestücken Sie das Ende mit einem Polyethersulfon-Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm. Filtern Sie das PBS in ein sauberes Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit Deckel.
      HINWEIS: Spritzenvorsatzfilter mit einer Pore von 0,2 μm aus alternativen Membranmaterialien (z. B. Polyvinylidenfluorid) können verwendet werden, solange die Membran mit PBS und Ammoniumacetat kompatibel ist.
    2. Kombinieren Sie gefiltertes PBS, Propylenglykol und Glycerin über eine Mikropipette in einem volumetrischen Verhältnis von 8:1:1, um den Hydratationspuffer (auch als PGG bezeichnet) herzustellen. Wenn Sie Propylenglykol und Glycerin hinzufügen, aspirieren und wischen Sie alle verbleibenden Tröpfchen von Propylenglykol oder Glycerin von der Oberfläche der Pipettenspitze ab, bevor Sie das Reagenz langsam in das PBS pipettieren. Eine deutliche fadenförmige viskose Trübungen ist im PBS zu sehen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, eine p1000-Mikropipette zu verwenden, um zuerst PBS in ein Zentrifugenröhrchen zu geben, gefolgt von Propylenglykol und Glycerin, da die beiden letztgenannten Reagenzien viskos sind. Daher sollten sie langsam über die Mikropipette aspiriert werden, bis keine Flüssigkeitsbewegung mehr in der Pipettenspitze zu sehen ist und keine Luft mehr aufgenommen wird, wenn die Pipettenspitze aus dem Reagenz entfernt wird. Mikropipettenspitzen mit volumetrischen Markierungen sollten idealerweise verwendet werden, um Reagenzvolumina auszuwählen, die mit solchen Markierungen übereinstimmen (z. B. 1 ml oder 5 ml PGG herstellen bzw. die 0,1 mL oder 0,5 mL Markierung auf der Mikropipettenspitze verwenden, um eine vollständige Aspiration von Propylenglykol und Glycerin zu visualisieren). Wischen Sie beim Abwischen der Oberfläche der Mikropipettenspitze nicht an der Spitzenöffnung ab, sondern nur an den Seiten.
    3. Pipettieren Sie mit der Pipettenspitze in der Lösung auf und ab, bis die Reagenzien homogen aufgelöst sind. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Lösung gelangen.
    4. Um eine vollständige Mischung des Hydratationspuffers zu gewährleisten, verschließen Sie das Zentrifugenröhrchen und drehen Sie es langsam auf und ab. Nicht wirbeln.
    5. Drehen Sie das Rohr bei weniger als 1000 x g für 20-30 s (Mindesttemperatur 4 °C, maximale RT), um nicht sichtbare Luftblasen zu entfernen.
  3. Hydratations-/Radiomarkierungspuffer (AA-PGG) vorbereiten
    1. Spritzenvorsatzfilter 0,1 M, pH 5,5 Ammoniumacetatpuffer (aus Schritt 1.1) und PBS in separate Röhrchen gemäß Schritt 1.2.1 geben.
    2. Kombinieren Sie gefilterten Ammoniumacetatpuffer, gefiltertes PBS, Propylenglykol und Glycerin über eine p1000-Mikropipette in ein Zentrifugenröhrchen in einem 5:3:1:1-Ammoniumacetatpuffer: PBS: Propylenglykol:Glycerin-Volumenverhältnis in der angegebenen Reihenfolge. Befolgen Sie die Anweisungen zum Aspirieren, Mischen und Zentrifugieren gemäß den Schritten 1.2.2-1.2.5, um AA-PGG herzustellen.
  4. Sofortiger Eluent für die Dünnschichtchromatographie (iTLC)
    1. Wiegen Sie bis zu 0,1 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und geben Sie sie in eine Durchstechflasche mit Deckel. In ddH2O so auflösen, dass eine 2%ige Gew.-% EDTA-Lösung entsteht (z. B. für 50 mg EDTA 2,5 ml ddH2O hinzufügen).
    2. Kombinieren Sie die 2%ige w/v-EDTA-Lösung mit dem Ammoniumacetatpuffer aus Schritt 1.1 in einem Verhältnis von 9:1 v/v (90%ige EDTA-Lösung, 10% Ammoniumacetatpuffer). Verschließen und lagern Sie den resultierenden iTLC-Eluenten.

2. Bildung von Lipidfilmen

HINWEIS: Dieses Verfahren beschreibt die Bildung eines Lipidfilms mit Zusammensetzungen, die die kommerzielle Mikroblase Definity® nachahmen, wobei Porphyrin-Lipid das Wirtslipid ersetzt und 30 Mol-% des Gesamtlipids ausmacht. Das Radiomarkierungsprotokoll kann jedoch auf verschiedene Lipidformulierungen angewendet werden (C16-, C18-, C22-Kettenlängen, neutrale oder anionische Ladung, unterschiedliche porphyrin-lipid-molare Zusammensetzungen). Beigefügt ist eine ergänzende Tabelle (Ergänzungsdatei 1), die Berechnungen, Zusammensetzungen, Massen und Lagermengen für die beschriebenen und andere Formulierungen enthält. Alle Lipide sind kommerziell erhältlich, mit Ausnahme des Porphyrin-Lipids, Pyropheophorbide-a-Lipid (Pyro-Lipid), dessen Synthese zuvor ausführlich beschrieben wurde35,36.

  1. Bestimmen Sie mit Hilfe der Zusatzdatei 1 die Gesamtmasse, die für jedes Lipid benötigt wird, basierend auf der Anzahl der benötigten Filme.
  2. Wiegen Sie ein leeres 0,5-Dram-Glasfläschchen auf einer Analysenwaage.
    HINWEIS: Staub stört die erfolgreiche Bildung von Mikroblasen. Blasen Sie daher Druckluft in das Fläschchen, um Staub/Partikel zu entfernen, wenn es unverschlossen gelagert wird.
  3. 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) auf Wägepapier wiegen.
    HINWEIS: Die gewogene Masse sollte aus Schritt 2.1 zuzüglich zusätzlicher 0,5-1 mg ermittelt werden, um etwaige Verluste bei der Probenhandhabung in späteren Schritten zu berücksichtigen.
  4. Übertragen Sie den DPPC in das gewogene Glasfläschchen und wiegen Sie es erneut, um die Lipidmasse im Fläschchen zu bestimmen. Dieser Prozess ermöglicht einen einfacheren Lipidtransfer in das Glasfläschchen, einen geringeren Verlust/Austritt von Lipidpulver und eine genauere Messung der Lipidmasse.
  5. Die Schritte 2.2 bis 2.4 werden mit den anderen Lipiden wiederholt: 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphat (DPPA) und C16-Pyrolipid.
    HINWEIS: Liegt Pyro-Lipid nicht in wägbarer Pulverform, sondern als Film oder Aliquot unbekannter Menge vor, so kann es in Chloroform gelöst werden, um einen Fond zu bilden, dessen Konzentration durch UV-Vis-Absorptionsmessungen in Methanol unter Verwendung des Beer-Lambert-Gesetzes berechnet werden kann, wie zuvor beschrieben35.
  6. Die folgenden organischen Lösungsmittel und Lösungen werden in Reagenzgläsern aus Glas mit Mikropipetten oder Glasspritzen hergestellt: 1) Chloroform, 2) 9:1 v/v Chloroform: Methanol und 3) 65:35:8 Chloroform:Methanol: ddH2O. Für den letzten Pipettieren Sie die Komponenten und mischen sie in der folgenden Reihenfolge: ddH2O, Methanol, dann Chloroform.
    ACHTUNG: Methanol und Chloroform sind gesundheitsgefährdend, brennbar und flüchtig. Tragen Sie einen Augenschutz, Handschuhe und einen Laborkittel und verwenden Sie einen Abzug.
  7. Verwenden Sie die Zusatzdatei 1 , um das Volumen des organischen Lösungsmittels/der organischen Lösung zu berechnen, das zur Herstellung von Lipidvorräten benötigt wird, und wählen Sie Glasspritzen mit entsprechendem Volumen aus.
    HINWEIS: Dieses Volumen sollte Stammkonzentrationen ergeben, die 15-100 μl Stammaliquotvolumina pro Film entsprechen, die mit 25-100 μl Glasmikroliterspritzen leicht gemessen werden können.
  8. Spülen Sie die Glasspritzen dreimal mit Chloroform aus. Pumpen Sie den Kolben hin und her, um die Spritze zu trocknen.
  9. Messen Sie die organischen Lösungsmittel/Lösungen und geben Sie sie über die gereinigte Glasspritze in die einzelnen Lipidfläschchen gemäß den Tabellenkalkulationen in Schritt 2.7, um Lipidvorräte zu bilden. Pyrolipid wird in Chloroform gelöst (sofern es nicht bereits gemäß der Anmerkung in Schritt 2.5 gelöst ist), DPPC und DPPE-mPEG in 9:1 v/v Chloroform: Methanol und DPPA in 65:35:8 Chloroform:Methanol:ddH2O. Wenn Sie für alle Zugaben dieselbe Glasspritze verwenden, spülen und trocknen Sie zwischen den einzelnen Lipiden.
    HINWEIS: Wenn die Formulierung der Wahl kein DPPA oder seine C18-Kettenlängenvariante enthält, können Pyrolipid, Wirts-PC-Lipid und PEG-Lipid alle in Chloroform gelöst werden.
  10. Verschließen Sie die Fläschchen und wirbeln Sie sie ein.
  11. Geben Sie berechnete Volumina von Stammlipidlösungen über eine Mikroliterspritze aus Glas in ein neues 0,5-Dram-Glasfläschchen (Filmfläschchen). Führen Sie für die erste Lipidbrühe die Nadelspitze in die untere Mitte des Fläschchens ein und tauchen Sie langsam ein, um ein Hochspritzen der Fläschchenwände zu vermeiden. Platzieren Sie die Nadelspitze für spätere Zugaben direkt über dem Flüssigkeitsspiegel und berühren Sie die Seite des Fläschchens, um alle letzten Tropfen so zu entfernen, dass die Nadel nicht der darunter liegenden Flüssigkeit ausgesetzt wird.
    HINWEIS: Spülen und trocknen Sie die Glasspritze zwischen den Lipidzusätzen, wenn eine Kontamination auftritt. Wenn Sie mehrere Filme herstellen, verschließen Sie sowohl die Folie als auch die Lagerfläschchen zwischen den Zusätzen, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu minimieren.
  12. Schwenken Sie das Fläschchen vorsichtig manuell in einer aufrechten Position, um den Inhalt zu mischen. Vermeiden Sie es, Lösung an den Wänden des Fläschchens hochzuspritzen.
  13. Lösen Sie die Kappe (bewahren Sie die Kappe auf) und führen Sie eine Stickstoffleitung in den Kopfraum der Durchstechflasche ein. Passen Sie den Stickstofffluss so an, dass eine leichte sichtbare Störung an der Flüssigkeitsoberfläche verursacht wird, jedoch ohne Trichter oder Spritzer.
  14. Wirbeln Sie das Fläschchen unmittelbar nach dem Einführen der Stickstoffleitung ein. Beginnen Sie mit einer niedrigen Geschwindigkeit, die ausreicht, um einen Trichter zu bilden, in dem das Lösungsmittel nicht höher als 1 cm vom Boden der Durchstechflasche aufsteigt. Vermeiden Sie Spritzer von Lösungsmitteln. Während das Lösungsmittel verdampft, erhöhen Sie die Wirbelgeschwindigkeit langsam und ohne Pause und halten Sie die Lösungsmittelhöhe aufrecht, bis die gesamte Flüssigkeit verdampft ist. Das Ergebnis ist ein dünner Film, der über das untere Drittel des Fläschchens beschichtet ist.
  15. Stellen Sie das Fläschchen in einen mit Vakuum ausgestatteten Exsikkator und trocknen Sie den Film 8-72 h lang unter Vakuum weiter. Decken Sie das Fläschchen (mit Ausnahme der Öffnung) oder den Exsikkator mit Alufolie ab.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die nächsten Schritte können nach dem Trocknen der Folie durchgeführt werden, oder die Folien können unter Argon, versiegelt mit Parafilm, in einem -20 °C-Gefrierschrank bis zu 1 Monat gelagert werden, bei trockener Lagerung auch länger.

3. Hydratation des Lipidfilms

HINWEIS: Wenn die Mikroblasen in vitro oder in vivo verwendet werden, verwenden Sie für die Schritte 3.3 bis 5.4 sterile Mikropipettenspitzen, Röhrchen, Spritzen und Nadeln, sofern nicht anders angegeben.

  1. Nehmen Sie die Folie aus dem Vakuum oder lassen Sie sie, falls sie im Gefrierschrank gelagert wird, auf RT erwärmen.
  2. Füllen Sie ein 250 mL Becherglas mit Wasser und erhitzen Sie das Wasser auf 70-80 °C.
  3. Erhitzen Sie ein Wasserbad-Ultraschallgerät auf 69 °C.
  4. Mikropipette 1 ml AA-PGG (Schritt 1.3) an den Rändern des Lipidfilmfläschchens, um Blasenbildung zu vermeiden.
    HINWEIS: Bei der Herstellung von unchelatierten Kontroll- oder reinen fluoreszierenden Mikrobläschen ist PGG (Schritt 1.2) anstelle von AA-PGG zu verwenden.
  5. Decken Sie die Öffnung der Durchstechflasche teilweise mit einer Kappe ab und lassen Sie genügend Platz, um eine Perfluorpropan (PFP)-Leitung einzuführen. Fließen Sie PFP 20 s über der Flüssigkeit in den Kopfraum des Fläschchens, so dass die Flüssigkeit sichtbar gestört wird, aber nicht spritzt. Fließen Sie PFP nicht direkt in die Suspension. Verschließen Sie das Fläschchen.
    HINWEIS: Wenn der Durchfluss in Stärke und Zeit ausreichend ist, beginnt die Durchstechflasche bei Berührung abzukühlen.
  6. Tauchen Sie die untere Hälfte des Fläschchens für 1 min in das 70-80 °C warme Wasserbad. Anschließend mindestens 30 s im 69 °C heißen Badsonicator beschallen oder bis sich der Lipidfilm homogen im AA-PGG dispergiert. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen oder die vorzeitige Aktivierung der Mikroblasenbildung (eine vorzeitige Aktivierung erscheint als milchige/trübe Bereiche in der Lipidsuspension). Wischen Sie bei Bedarf die Oberfläche der Durchstechflasche ab, um besser erkennen zu können, ob noch nicht suspendierte Lipide vorhanden sind.
    HINWEIS: Wenn der Lipidfilm innerhalb von 1 Minute nach der Beschallung nicht hydratisiert, erhitzen Sie ihn erneut im 70-80 °C-Bad und beschallen Sie ihn erneut.
  7. Sobald der Lipidfilm homogen suspendiert ist, ein letztes Mal für 1 min erhitzen und weitere 30 s beschallen.
  8. Wischen Sie das Fläschchen ab und lassen Sie es passiv auf RT abkühlen (~5-10 min).
  9. Füllen Sie den Kopfraum des Fläschchens gemäß Schritt 3.5 wieder mit PFP auf, verschließen Sie ihn und versiegeln Sie die Kappenränder mit Parafilm.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und spätestens nach 8 h fortgesetzt werden.

4. Radioaktive Markierung

HINWEIS: Für unchelatierte Kontrolle oder rein fluoreszierende Mikrobläschen fahren Sie mit Protokollabschnitt 5 fort.

ACHTUNG: Die Schritte 4.4-4.6 dieses Protokolls sind in einem radioaktiven Labor durchzuführen, sofern nicht anders angegeben. 64CuCl2 ist eine radiologische Gefahr mit dem Risiko einer Multisystemtoxizität durch Hautexposition, Inhalation oder Verschlucken. Wenn möglich, fassen Sie es in einem Abzug indirekt mit einer Zange mit Gummispitze. Tragen Sie bei der Handhabung einen schützenden Laborkittel, einen persönlichen Ring und ein Abzeichendosimeter sowie einen Doppelhandschuh. Stellen Sie sicher, dass 64CuCl2 über eine 2-Zoll-Bleiabschirmung gehandhabt wird. Transportieren Sie es bei Bedarf in einem mit Blei ummantelten Behälter. Schirmen Sie Abfallbehälter ab und führen Sie eine Betriebsuntersuchung auf Kontamination nach Gebrauch durch.

  1. Bereiten Sie ein 60 °C heißes Wasserbad in einem Becherglas oder einer großen Kristallisationsschale zu, die einen Magnetrührstab enthält. Verwenden Sie eine temperaturgesteuerte Heiß-/Rührplatte, die mit einer in das Wasser eingeführten Wärmesonde ausgestattet ist und so eingestellt ist, dass sie mit einer Geschwindigkeit rührt, die einen schwachen, aber sichtbaren Trichter erzeugt.
  2. Ein versiegeltes Fläschchen mit 64CuCl2 in 0,1 N HCl wird über eine Pinzette mit Gummispitze in einen Dosiskalibrator überführt.
    HINWEIS: Wenn Sie 64CuCl2 bestellen, verlangen Sie, dass es in 5-20 μl von 0,1 N HCl gelöst wird. Ein geringeres Volumen ist entscheidend für die Erhaltung der Mikroblasenausbeute.
  3. Notieren Sie die am Dosiskalibrator gemessene Kupfer-64-Aktivität und die Zeit. Nehmen Sie das Fläschchen mit einer Pinzette heraus und legen Sie es in einen bleihaltigen Behälter.
  4. Die festgestellte Aktivität dividiert durch das für die 64CuCl2 angegebene Volumen, um einen MBq·mL-1-Wert zu erhalten.
  5. Lösen Sie den Deckel der Lipidsuspension aus Schritt 3.9 und befestigen Sie sie in einem Fläschchenhalter.
  6. Lösen Sie den Deckel des 64CuCl2 Fläschchens und befestigen Sie es mit einer Pinzette.
  7. Mikropipettieren Sie ein Volumen der 64CuCl2-Lösung , das einer Aktivität von 40-250 MBq entspricht, und überführen Sie es in die Lipidsuspension. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze in die Suspension eingetaucht ist. Tauchen Sie ein und pipettieren Sie dann auf und ab, um das 64CuCl2 vollständig zu übertragen.
    HINWEIS: Die Menge an 64CuCl2 hängt von der beabsichtigten Anwendung der radioaktiv markierten Mikrobläschen und der Empfindlichkeit des Dosiskalibrators ab. Für die longitudinale PET (bis zu 48 h nach der Injektion) und Blutproben in vivo bei Mäusen werden mindestens 220 MBq bzw. 50 MBq empfohlen.
  8. Verschließen Sie sowohl die Lipidsuspension als auch 64CuCl2 Fläschchen.
  9. Drehen Sie die radioaktive Lipidsuspension mit einer flachen Pinzette mit Gummispitze mindestens 5 Mal manuell auf und ab, um das 64CuCl2 vorsichtig durch die Suspension zu mischen. Vermeiden Sie es, die Durchstechflasche zu schütteln oder fallen zu lassen, und vermeiden Sie Blasenbildung.
  10. Wenn Sie mit der rechten Seite nach oben halten, schnippen Sie vorsichtig mit der Kappe des Fläschchens, während Sie die Aufhängung stabil halten. Dies hilft dabei, dass die in der Kappe eingeschlossene Flüssigkeit auf den Boden des Fläschchens gelangt. Lösen Sie die Kappe des Fläschchens vorsichtig teilweise und führen Sie eine mit 18-G-Nadeln ausgestattete PFP-Leitung ein. Füllen Sie den Kopfraum des Fläschchens 20 s lang mit PFP gemäß Schritt 3.5. Verschließen Sie das Fläschchen und verschließen Sie es mit Parafilm.
  11. Messen Sie die Aktivität der Durchstechflasche an einem Dosiskalibrator und notieren Sie die Zeit.
    HINWEIS: Wenn keine ausreichende Aktivität auf die Durchstechflasche übertragen wurde, wiederholen Sie die Schritte 4.5 bis 4.11 und fügen Sie ein geeignetes zusätzliches Volumen von 64CuCl2 hinzu.
  12. Legen Sie das Fläschchen in einen Schaumstofffläschchenhalter und drücken Sie es durch, so dass die untere Hälfte des Fläschchens der Hitze ausgesetzt ist. Stellen Sie den Halter in das bei 60 °C gerührte Wasserbad und erhitzen Sie ihn 1 h lang.
  13. Während die Chelatreaktion abläuft, bereiten Sie iTLC-Platten vor. Schneiden Sie mit frischen Handschuhen Glasmikrofaser-Chromatographiepapier in 1 cm x 8 cm große Streifen. Die Streifen in einem 80 °C heißen Glastrockenofen erhitzen.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann in einem nicht radioaktiven Labor durchgeführt werden.
  14. Nach 1 h das Fläschchen in Schritt 4.12 vom Herd nehmen und die Ränder mit einem Tuch abwischen.
  15. Drehen Sie das Fläschchen manuell mit einer Zange mit Gummispitze auf und ab, um Kondenswasser an den Fläschchenwänden in der Lipidsuspension wieder zu kondensieren.
  16. Halten Sie das Fläschchen aufrecht und schnippen Sie mit der Kappe, während Sie das Röhrchen stabilisieren. Entfernen Sie den Parafilm und wischen Sie um die Kappe herum, um eingeschlossenes Badewasser zu entfernen.
  17. Öffnen Sie vorsichtig den Deckel der Durchstechflasche und aspirieren Sie 1-2 μl der Lipidsuspension. Platzieren Sie die Suspension 1 cm von der unteren Mitte eines iTLC-Streifens entfernt und verschließen Sie das Fläschchen wieder. Lassen Sie die Stelle trocknen.
    HINWEIS: Idealerweise sollten zur Sicherheit mindestens 2 iTLCs pro Reaktionsgemisch gesichtet und pro radioaktiv markierter Lipidsuspension entwickelt werden.
  18. Mikropipette 200 μl des iTLC-Eluenten (hergestellt in Schritt 1.4) in den Boden eines 10-ml-Reagenzglases. Bewahre das Reagenzglas in einem Bleibehälter auf. Geben Sie das gefleckte iTLC in das Röhrchen und lassen Sie den Streifen entwickeln, bis der Eluent etwa 1 cm von der Oberkante des Streifens entfernt ist.
  19. Entfernen Sie die entwickelten iTLC-Streifen mit einer Pinzette. Halten Sie den Streifen senkrecht und schneiden Sie ihn über γ Theken- und Steckverschluss-kompatiblen runden 5-ml-Kunststoffröhrchen in Drittel, so dass jedes Streifendrittel direkt in ein einzelnes Drittel fällt. Stecken Sie die Druckkappen in die drei Röhrchen.
  20. Messen Sie die streifenhaltigen Röhrchen und ein leeres/verschlossenes Kontrollröhrchen an einem γ-Zähler auf Kupfer-64-Aktivität und notieren Sie die zugehörigen Zählungen pro Minute (cpm). Subtrahieren Sie die Aktivität des Steuerrohrs von den anderen Messwerten, um die Hintergrundaktivität zu korrigieren.
    HINWEIS: Die korrigierten Messwerte für das untere Drittel des Streifens (Stück 1) sind mit Kupfer-64-chelatierten Lipidsuspensionspartikeln assoziiert. Der mittlere Abschnitt (Stück 2) enthält einen Streifen von freien Kupfer-64- und 64-Cu-Pyro-Lipid-Chelaten in nicht-supramolekularer Form. Der obere Teil (Stück 3) enthält überwiegend freies Kupfer-64.
  21. Berechnen Sie die radiochemische Reinheit über Gleichung 1.
    figure-protocol-22861(Gleichung 1)
    HINWEIS: Wenn der cpm für Stück 1 unangemessen niedrig erscheint (z. B. niedriger oder gleichwertig wie bei Stück 2 oder 3) oder wenn Messwerte über der nichtlinearen Sättigungsschwelle von γ Zählern liegen, ist ein niedrigeres Volumen oder ein verdünntes Aliquot (1-2 μl) der radioaktiv markierten Suspension für iTLC zu ermitteln.
  22. Stellen Sie sicher, dass die radiochemische Reinheit beider iTLC-Streifen pro Lipidsuspension ≥ 94 % beträgt, um fortzufahren. Wenn nicht, erhitzen Sie die Lipidsuspension weiter bei 60 °C und überwachen Sie die Chelatbildung in 30-Minuten-Intervallen über iTLC.
  23. Öffnen Sie den Deckel des radioaktiv markierten Lipidsuspensionsfläschchens und die Mikropipette 8,89 μl 1 N NaOH in die Suspension, pipettieren Sie auf und ab, um die Base vollständig zu übertragen und die Suspension zu neutralisieren. Verschließen Sie das Fläschchen, drehen Sie es manuell mit einer Pinzette, um es umzudrehen/rückgängig zu machen, und klopfen Sie dann vorsichtig auf die Fläschchenkappe.
  24. Den Kopfraum gemäß Schritt 4.10 mit PFP füllen, verschließen und mit Parafilm verschließen.

5. Aktivierung und Isolierung von Mikroblasen

  1. Aktivieren Sie die Lipidsuspension über einen mechanischen Fläschchenschüttler für 45 s bei 4530 U/min, um eine milchige Mikroblasensuspension zu erzeugen. Lassen Sie die Durchstechflasche ca. 10 Minuten lang passiv auf RT abkühlen. Die resultierende milchige Suspension trennt sich im Laufe der Zeit in zwei Schichten.
    HINWEIS: Der Inhalt der Durchstechflasche sollte nach der Aktivierung milchig aussehen. Eine deutlichere Unterbrechung nach der Aktivierung ist ein Hinweis auf eine erfolglose Aktivierung, deren Ursachen in späteren Abschnitten erörtert werden.
  2. Sobald Sie bei RT sind, invertieren/revertieren Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Mikroblasensuspension wieder zu resuspendieren. Stellen Sie das Fläschchen auf eine ebene Fläche und warten Sie 2 Minuten vor dem Dekantieren, um die gewünschte Mikroblasenpopulation wie folgt zu erhalten:
    1. Rüsten Sie eine 1-ml-Kunststoffspritze mit einer 18-G-Nadel aus und entlüften Sie die Spritze/Nadel durch Ein- und Aussaugen von Luft. Nach 2 Minuten öffnen Sie die Kappe des Fläschchens schnell und brechen Sie das Parafilm-Siegel in einer Bewegung.
    2. Ziehen Sie 400-550 μl vom Boden des Fläschchens (Ziel-Mikrobläschenpopulation), um das Ansaugen der oberen Schaumschicht größerer unerwünschter Mikrobläschenpopulationen zu vermeiden.
      HINWEIS: Kippen Sie die Durchstechflasche bei Bedarf zur Seite, um das Endvolumen in der Spritze zu sammeln und ein Ansaugen der schaumigen/leichteren Schicht zu vermeiden.
  3. Wischen Sie die Ränder der Nadel vorsichtig ab, um schaumige Verunreinigungen zu entfernen, und geben Sie die isolierte Mikroblasensuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie vorsichtig (schnappen Sie die Kappe nicht abrupt auf oder zu). Dies ist die letzte Arbeitssuspension von radioaktiv markierten Mikrobläschen.
  4. Messen Sie die Aktivität des Endprodukts der Mikroblase auf dem Dosiskalibrator und notieren Sie die Zeit. Dividieren Sie diesen Wert durch das Volumen der Suspension, das in Schritt 5.2 dekantiert wurde, um einen MBq·mL-1-Wert zu erhalten, mit dem das Injektionsvolumen in Abhängigkeit von der interessierenden Anwendung berechnet werden kann.
    HINWEIS: Die radioaktiv markierten Mikrobläschen sind jetzt gebrauchsfertig. Abschnitt 6 kann bis zu 24 h später ausgeführt werden. Für Informationen darüber, wie diese radioaktiv markierten Mikrobläschen injiziert und in vivo durch multimodale Bildgebung (Ultraschall, PET, Fluoreszenz) verfolgt werden können, siehe Rajora et al.15.

6. Validierung der Effizienz der Radiomarkierung

  1. Resuspendieren Sie die Mikroblasensuspension durch sanftes Pipettieren oder Inversion der Durchstechflasche.
    HINWEIS: Wirbeln Sie niemals ein Produkt mit Mikroblasen auf. Vortexing destabilisiert Mikroblasensuspensionen.
  2. 10-200 μl der radioaktiv markierten Suspension werden in eine 0,5-ml-Zentrifugenfiltereinheit mit einem Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) von 0,5 ml gegeben. Bei Verwendung von Volumina <200 μl wird ddH2O in die Filtereinheit gegeben, um ein Gesamtvolumen von 200 μl zu erhalten. Bringen Sie die Filtereinheit in einem kompatiblen Mikrozentrifugenröhrchen und einer Kappe unter.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Radiomarkierungstest vor und getrennt von der Anwendung in vitro oder in vivo von radioaktiv markierten Mikrobläschen durchzuführen, um einen erfolgreichen Abschluss des Protokolls zu gewährleisten. In diesem Fall könnte in diesem Schritt ein größeres Volumen (z.B. 200 μL) verwendet werden. Wenn das Protokoll anschließend für eine Behandlungssitzung verwendet wird, bereiten Sie zuerst Behandlungsvolumen/Injektionen vor und führen Sie dann so früh wie möglich Abschnitt 6 mit der verbleibenden radioaktiv markierten Mikroblasensuspension durch.
  3. 10 min bei 12.000 x g bei RT zentrifugieren.
    HINWEIS: Die Mikrozentrifuge sollte von einer Bleiabschirmung umgeben sein.
  4. Schneiden Sie mit einer Schere die Verbindung zwischen dem Mikrozentrifugenröhrchen und seiner Kappe ab.
    1. Legen Sie die Kappe in ein 20-ml-Szintillationsfläschchen mit der Aufschrift "caps". Übertragen Sie die Filtereinheit in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen (Rohr 2).
    2. Legen Sie das erste Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Überstand in ein 20-ml-Szintillationsfläschchen mit der Aufschrift "Röhrchen 1". Geben Sie 200 μL ddH2O in die Filtereinheit in Röhrchen 2.
  5. Die Filtereinheit in Röhrchen 2 bei 12.000 x g bei RT zentrifugieren.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 6.4 und 6.5. Geben Sie die Kappe des Röhrchens 2 in das Szintillationsfläschchen "Kappen", in dem sich die Kappe des Röhrchens 1 befindet. Setzen Sie das Röhrchen 2 in ein neues 20-ml-Szintillationsfläschchen ein.
  7. Schneiden Sie die Kappe des dritten Mikrozentrifugenröhrchens ab und setzen Sie es gemäß Schritt 6.4 in das Fläschchen "Kappen" ein. Übertragen Sie die Filtereinheit in ein neues 20-ml-Szintillationsfläschchen mit der Aufschrift "Einheit" und stellen Sie sicher, dass das Infranatant in Röhrchen 3 verbleibt und nicht in das Fläschchen mit der "Einheit" übertragen wird. Wenn Tropfen an den Rändern der Filtereinheit zu sehen sind, stellen Sie sie wieder in Rohr 3, verschließen Sie sie und drehen Sie sie 10 s lang nach unten. Setzen Sie das Röhrchen 3 in ein neues 20-ml-Glasszintillationsfläschchen ein.
  8. Verschließen Sie die 5 Szintillationsfläschchen (Röhrchen 1, Röhrchen 2, Röhrchen 3, Kappen und Einheit). Bereiten Sie ein leeres und verschlossenes 20-ml-Szintillationsfläschchen als Blindkontrolle vor.
  9. Messen Sie die sechs Szintillationsfläschchen auf einem γ-Zähler auf Kupfer-64-Aktivität. Subtrahieren Sie die Aktivität des Blindfläschchens von der der anderen Durchstechflaschen. Berechnen Sie die Radiomarkierungs-/Chelat-Effizienz mit Hilfe von Gleichung 2.
    figure-protocol-30258(Gleichung 2)
    HINWEIS: Wenn der cpm-Wert der Einheit unangemessen niedrig ist (z. B. niedriger oder gleichwertig mit den Röhrchen) oder wenn Messwerte über dem nichtlinearen Sättigungsschwellenwert des γ-Zählers liegen, lagern Sie die Szintillationsfläschchen bis zu 4 Tage lang in Bleibehältern, damit die Aktivität abklingen kann, bis die Werte unter dem Schwellenwert liegen, und messen Sie erneut.

7. Physikalisch-chemische Charakterisierung der Mikroblase

HINWEIS: Sofern ein Labor keine Ausrüstung für die Verarbeitung radioaktiver Proben vorgesehen hat, muss die physikalisch-chemische Charakterisierung von Mikroblasen mit nicht-radioaktiven, "kalten" Kupferchelatproben durchgeführt werden. Diese "kalte" Markierung erleichtert die Beurteilung der Ausbeute an Mikrobläschen, die für die Beurteilung der Dosis der Mikrobläschen, die für die beabsichtigte Anwendung verwendet werden, von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich mit unchelatierten Mikrobläschen zur Kontrolle, um sicherzustellen, dass der Radiomarkierungsprozess die Eigenschaften der Mikrobläschen nicht stört. Diese "kalte" Markierung und die damit verbundene physikalisch-chemische Charakterisierung sollten vor der Anwendung von radioaktiv markierten Mikroblasen erfolgen und können als Rückmeldung verwendet werden, wenn Änderungen an der Radiomarkierung erforderlich sind (siehe Diskussion).

  1. Kennzeichnung der "kalten" Kupfer-Mikroblase
    1. Berechnen Sie unter Verwendung des Volumens der 64CuCl2-Lösung , das der Lipidsuspension in Schritt 4.7 zugesetzt wurde, der porphyrinmolaren Zusammensetzung in % der Lipidfilme und der spezifischen Aktivität, die auf dem 64CuCl2-Produktblatt gefunden wurde, das ungefähre Metall:Porphyrin-molare Verhältnis, das während der Radiomarkierung erreicht wurde. Beispielrechnungen finden Sie in der Zusatzdatei 1.
    2. Befolgen Sie die Abschnitte 1-3 des aktuellen Protokolls.
    3. Bereiten Sie eine 0,1 mgμl-1 CuCl2-Lösung in 0,1 N HCl vor.
    4. Das entsprechende Volumen dieser CuCl2-Lösung wird mit einer Mikropipette in die Lipidsuspension gemäß Schritt 7.1.1 pipettiert und das Fläschchen verschlossen.
    5. Drehen Sie das Fläschchen, um das CuCl2 in die Lipidsuspension zu mischen, füllen Sie den Kopfraum mit PFP, versiegeln Sie es und erhitzen Sie es gemäß den Schritten 4.9, 4.10 und 4.12. Eine Gummizange wird für die Handhabung von Fläschchen nicht benötigt.
    6. Nehmen Sie das Fläschchen nach 1 h vom Herd und wischen Sie die Außenseite zum Trocknen ab. Lassen Sie die Durchstechflasche auf RT abkühlen.
    7. Die Lipidsuspension neutralisieren, mischen, den Kopfraum mit PFP füllen und gemäß den Schritten 4.23 und 4.24 verschließen.
    8. Aktivieren Sie die Mikroblasensuspension und das Dekantieren, um ein funktionierendes Produkt gemäß den Schritten 5.1-5.3 zu erhalten.
  2. Größenbestimmung von Mikroblasen
    HINWEIS: Die Größenbestimmung der Mikroblase sollte unmittelbar nach der Aktivierung durchgeführt werden. Wenn Sie die Stabilität der Arbeitssuspension beurteilen, wiederholen Sie die Probenvorbereitung und die Messungen in Abständen von 30 Minuten. In der Regel ist ein Zeitfenster von 1-2 Stunden repräsentativ für den Zeitraum, über den die Mikroblasen-Arbeitssuspension nach der Aktivierung verwendet/verabreicht wird. Das Ziel von Stabilitätsmessungen ist es, sicherzustellen, dass die Größe und Ausbeute der Mikroblase über diesen Zeitraum erhalten bleiben, so dass alle Behandlungen, die mit der Arbeitslösung verabreicht werden, ähnliche Mikrobläschenpopulationen enthalten.
    1. Schalten Sie den Scharzähler (CC) ein und stellen Sie die folgenden Parameter mit dem Werkzeug SOP bearbeiten ein: 30 μm Apertur, 0,6-18 μm Größenbereich, Aperturstrom 400-600 μA, Vorverstärkerverstärkung 4-8, 400 Bins, Spülung vor und nach jedem Lauf, volumetrische Analyse, 5 μl Probenvolumen.
    2. Filtrieren Sie den CC-Elektrolyten durch eine 0,2 μm Medienvakuumfiltrationseinheit. Füllen Sie den Elektrolytbehälter und einen separaten Behälter für die Probenvorbereitung.
    3. Hintergrundmessung: Füllen Sie eine 10-ml-Einwegküvette mit 10 mL gefiltertem Elektrolyten und führen Sie eine Basismessung durch. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl unter 400 liegt. Wenn nicht, spülen Sie das Instrument.
    4. Messung von Proben
      1. Geben Sie 10 ml gefilterten Elektrolyten in eine neue Küvette. Resuspendieren Sie die Mikroblasensuspension durch manuelles Invertieren/Zurücksetzen. Mikropipette 5 μl von der unteren Mitte des Fläschchens. Wischen Sie die Ränder der Pipettenspitze (mit Ausnahme der Öffnung) ab und tauchen Sie die Probe direkt in den vorbereiteten Elektrolyten.
      2. Pipettieren Sie auf und ab, um die Suspension vollständig zu übertragen. Schwenken Sie den Elektrolyten mit der Pipettenspitze vorsichtig, bis sich die "Fetzen" der Mikroblasensuspension aufgelöst haben.
    5. Messen Sie die Probe auf dem CC (zwei Läufe pro Analyt).
      HINWEIS: Ein Mikroblasenvolumen von 5 μl ist in der Regel für Proben geeignet, die Konzentrationen von 1-5 x 109 Mikroblasen ηmL-1 enthalten. Dieses Probenvolumen muss möglicherweise angepasst werden, abhängig von der spezifischen CC-Gerätekonfiguration und wenn die Ausbeute an Mikroblasen außerhalb des oben genannten Bereichs liegt.
  3. Konfokale Bildgebung
    HINWEIS: Führen Sie die konfokale Bildgebung unmittelbar nach der Größenbestimmung der Mikroblase und innerhalb des Zeitrahmens der erhaltenen Mikroblasenstabilität gemäß den Hinweisen in Schritt 7.2 durch.
    1. Resuspendieren Sie die Mikroblasensuspension und übertragen Sie 1-5 μl in die Mitte eines Glasobjektträgers. Legen Sie vorsichtig einen Deckglas über das Tröpfchen der Mikroblasensuspension, um Luftblasen zu vermeiden. Die Suspension verteilt sich unter dem Deckglas.
    2. Bilden Sie die Mikrobläschen bei 60-facher Vergrößerung mit einem Öl-Immersionsobjektiv ab. Erhalten Sie Bilder im Hellfeld und unter 633 nm Anregung/640-765 nm Emission. Überlagern Sie die Hellfeld- und Fluoreszenzbilder.
      HINWEIS: Das Fluoreszenzsignal sollte sich über die Hülle aller sichtbaren Partikel überlappen, wenn die Sonde homogen in die Mikroblasenhülle eingebaut ist.
  4. Spektrofluorometrie
    HINWEIS: Spektrofluorometrie-Messungen können innerhalb von 24 Stunden nach Aktivierung der Mikroblase durchgeführt werden.
    1. Bereiten Sie 1% Triton X-100 wie zuvor beschriebenvor 35.
    2. Schalten Sie das Spektrofluorometer 15-30 Minuten vor der ersten Messung ein.
    3. Messen Sie die Fluoreszenzspektren von 1 % Triton X-100 mit einer Anregung von 410 nm und einem Emissionsbereich von 600-800 nm in einer Quarzküvette. Wählen Sie die Option aus, um das Signal anhand des Referenzdetektorsignals (oft als S1/R1 bezeichnet) zu normalisieren.
      HINWEIS: Triton X-100 blubbert leicht, wenn es pipettiert wird. Tauchen Sie daher beim Umfüllen in eine Küvette nur bis zum ersten Anschlag der Mikropipette ein.
    4. Spülen Sie die Küvette mit Methanol und trocknen Sie sie zwischen den Proben mit Druckluft.
    5. 6 mL 1% Triton X-100 in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen geben. Resuspendieren Sie die Mikroblasensuspension und aspirieren Sie 1 μl über eine Mikropipette. Wischen Sie die Ränder der Pipettenspitze mit Ausnahme der Öffnung ab und übertragen Sie die Probe auf das vorbereitete 1% Triton X-100, wobei Sie auf und ab pipettieren, um den Transfer abzuschließen. Die Lösung vortexen und in eine Quarzküvette umfüllen.
      HINWEIS: Passen Sie das Verhältnis der Probe: 1% Triton X-100 entsprechend der Empfindlichkeit des Geräts und der nichtlinearen Sättigungsschwelle an.
    6. Diese Probe wird anhand der Parameter in Schritt 7.4.3 gemessen. Diese Messung entspricht "gestörten" Partikeln.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 7.4.3 bis 7.4.6 mit PBS. Diese Messung entspricht "intakten" Partikeln.
    8. Korrigieren Sie die gestörten und intakten Probenspektren mit 1 % Triton X-100- bzw. PBS-Messungen.
    9. Berechnen Sie die Quenching-Effizienz (QE) über Gleichung 3 unter Verwendung des integrierten baseline-korrigierten Fluoreszenzsignals der intakten Probe in PBS (FPBS) und in 1% Triton X-100 (FTx):
      figure-protocol-38957(Gleichung 3)
  5. UV-Vis-Spektroskopie
    HINWEIS: Spektroskopiemessungen können bis zu 72 Stunden nach der Aktivierung der Mikroblase durchgeführt werden.
    1. Ein Aliquot der Mikroblasensuspension wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Badsonicator bei RT beschallt, bis die Suspension transparent ist. Dadurch werden Streueffekte bei der Spektroskopie reduziert.
    2. Schalten Sie das Spektralphotometer 10 Minuten vor der ersten Messung ein. Wählen Sie ein Abtastintervall von 0,25 nm und einen Erfassungsbereich von 200 bis 800 nm. Aktivieren Sie die Grundliniensubtraktion.
    3. Verwenden Sie für die Messungen eine 1 cm dicke Quarzküvette. Spülen Sie die Küvette zwischen den Messungen mit Methanol und trocknen Sie sie mit Druckluft.
    4. Erhalten Sie eine Basismessung von Methanol.
    5. Die beschallte, transparente Mikroblasensuspension wird vortex und 10-50 μl in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 200-1000 μl Methanol überführt. Stellen Sie sicher, dass das Methanolvolumen gemessen und mit einer Mikroliterspritze aus sauberem Glas in das Röhrchen gegeben wird. Vortexen Sie die Lösung, um eine "gestörte" Probe zu erhalten.
      HINWEIS: Die Probenverdünnung hängt von der Effizienz der Porphyrinbeladung und der Molzusammensetzung in % ab. Eine 20-fache Verdünnung ist für eine Pyro-Lipid-Mikroblasenzusammensetzung von 30 Mol-% geeignet.
    6. Sammeln Sie das UV-Vis-Spektrum.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 7.5.4 bis 7.5.6 mit PBS anstelle von Methanol.
      HINWEIS: Eine Mikropipette kann zur Messung des PBS-Volumens anstelle einer Mikroliterspritze aus Glas verwendet werden.

8. Änderungen des Protokolls

  1. Alternativer Chelator
    1. Bereiten Sie Lipidfilme gemäß Abschnitt 2 vor und ersetzen Sie das Pyrolipid durch einen alternativen lipidkonjugierten Kupferchelator (z. B. 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-diethylentriaminpentaessigsäure (Ammoniumsalz), im Folgenden als DTPA-Lipid bezeichnet). Verwenden Sie die Zusatzdatei 1 , um die erforderliche Masse und das erforderliche Lagervolumen zu berechnen.
      HINWEIS: Das Testen verschiedener molarer Zusammensetzungen eines alternativen Chelators ist wahrscheinlich erforderlich, um die Obergrenze zu bestimmen, oberhalb derer keine stabilen Mikrobläschen mit hohen Ausbeuten erzeugt werden können.
    2. Befolgen Sie die Abschnitte 3 bis 6, um radioaktiv markierte Mikrobläschen zu erzeugen und zu charakterisieren.
    3. Befolgen Sie die Schritte 7.1 bis 7.3, um "kalte" kupferchelatisierte Mikrobläschen zu charakterisieren. Zur Beurteilung der Partikelmorphologie ist nur eine konfokale Hellfeldmikroskopie-Bildaufnahme erforderlich. Wenn der alternative Chelator fluoreszierend ist, ist zusätzlich zu den Schritten 7.4 und 7.5 eine konfokale Mikroskopie mit zugehörigen Anregungs- und Emissionswellenlängen durchzuführen.
  2. Alternatives Fluorophor
    1. Bereiten Sie Lipidfilme gemäß Abschnitt 2 vor und ersetzen Sie das Pyrolipid durch ein alternatives lipidkonjugiertes oder interkalierendes Fluorophor (z. B. DiI). Verwenden Sie die Zusatzdatei 1 , um die erforderliche Masse und das erforderliche Lagervolumen zu berechnen.
      HINWEIS: Das Testen verschiedener molarer Zusammensetzungen eines alternativen Fluorophors ist wahrscheinlich erforderlich, um die Obergrenze zu bestimmen, oberhalb derer keine stabilen Mikrobläschen mit hohen Ausbeuten erzeugt werden können.
    2. Befolgen Sie Abschnitt 3 mit PGG anstelle von AA-PGG.
    3. Führen Sie die Schritte 5.1 bis 5.3 und 7.2 bis 7.5 aus.
  3. "Spiking"-Ansatz: Markierung von vorgeformten Mikroblasen-Lipidsuspensionen
    1. Erzeugen Sie einen Porphyrin-Lipid-Film gemäß Abschnitt 2, wobei Sie nur Pyrolipid ohne andere Lipidbestandteile verwenden. In der Zusatzdatei 1 finden Sie Informationen zu den Pyro-Lipid-Mengen.
    2. Hydratisieren Sie den Pyro-Lipid-Film gemäß Abschnitt 3 mit 100-200 μl AA-PGG (oder PGG, wenn keine Radiomarkierung erforderlich ist) anstelle von 1 ml Hydratationspuffer.
    3. Übertragen Sie die gesamte Pyro-Lipid-Suspension in eine vorgefertigte Lipid-Mikrobläschensuspension.
    4. Füllen Sie den Kopfraum mit PFP, erhitzen und beschallen Sie die Suspension und versiegeln Sie sie unter PFP gemäß den Schritten 3.4 bis 3.9. Überwachen Sie die Dispersion der Pyro-Lipid-Suspension in der vorgefertigten Lipid-Mikroblasensuspension und führen Sie Wärme-/Ultraschallzyklen durch, bis sie vollständig dispergiert ist.
      HINWEIS: Wenn Sie ein mit Septum versiegeltes kommerzielles Mikroblasenfläschchen verwenden, kann die Pyro-Lipid-Suspension durch eine Spritze/Nadel in das Fläschchen eingeführt werden, ohne den Kopfraum des Fläschchens erneut mit PFP zu füllen.
    5. Die Radiomarkierung (siehe Schritt 8.3.5.1), die Aktivierung, die Isolierung (siehe ANMERKUNG unten) und die damit verbundene Charakterisierung gemäß den Abschnitten 4 bis 7 durchführen.
      1. Ein alternativer Ansatz besteht darin, zunächst die hydratisierte Pyro-Lipid-Suspension zu radioaktiv markieren, eine radiochemische Reinheit von >94 % zu überwachen, mit 1 N NaOH zu neutralisieren (das Volumen entsprechend dem AA-PGG-Volumen zu modifizieren, das zur Hydratisierung des Pyro-Lipidfilms verwendet wird) und dann die radioaktiv markierte Pyro-Lipid-Suspension in die vorgefertigte Mikroblasen-Lipidsuspension gemäß Schritt 8.3.3 einzubringen.
        HINWEIS: Dieser modifizierte Ansatz sollte nur zur Erzeugung von fluoreszierenden oder multimodalen radioaktiv markierten Mikrobläschen verwendet werden, wenn nach einem Isolationsprozess Submikron-Multilamellare Vesikel entfernt werden, die während der Lipidhydratation entstehen, aber nicht in Mikrobläschen eingebaut wurden. Siehe Diskussion für weitere Details.

Ergebnisse

Die wichtigsten quantifizierbaren Ergebnisse bei der Herstellung von radioaktiv markierten Mikrobläschen sind die radiochemische Reinheit und die Effizienz der radioaktiven Markierung. Dieses Protokoll verwendet iTLC bzw. ein validiertes Zentrifugalverfahren, um beide zu charakterisieren. Abbildung 2A zeigt, dass durchschnittliche radiochemische Reinheiten und Wirkungsgrade von ≥95 % bei kommerziellen Mikroblasen-imitierenden Formulierungen erreicht wurde...

Diskussion

Das derzeitige Protokoll zur radioaktiven Markierung von Lipid-Mikrobläschen erreicht eine radiochemische Reinheit von >95 %, eine Chelat-Effizienz von >95 % und die Beibehaltung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Mikroblase, ohne dass eine Reinigung nach der Markierung erforderlich ist. Diese Errungenschaften stellen Fortschritte dar, die mit bestehenden Kennzeichnungsprotokollen bisher nicht erreicht wurden. Das Fehlen von Reinigungsschritten ermöglicht eine schnellere Ver...

Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Wir danken Deborah Scollard und Teesha Komal (University Health Network Spatio-Temporal Targeting and Amplification of Radiation Response (STTARR) program, Toronto, Ontario) für ihre technischen Dienstleistungen und Anleitungen. Wir danken auch Mark Zheng und Dr. Alex Dhaliwal für ihre technische Unterstützung während der konfokalen Mikroskopie und der Advanced Optical Microscopy Facility (Toronto, Ontario) für die Bereitstellung der zugehörigen Ausrüstung. Wir erwähnen unsere Finanzierungsquellen: die Canadian Institutes of Health Research, das Terry Fox Research Institute, den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, die Canada Foundation for Innovation, die Princess Margaret Cancer Foundation, das Canada Research Chairs Program, das McLaughlin Centre, das Vanier Scholarship Program, das Ontario Graduate Student Scholarship Program, Prostate Cancer Canada und die Peterborough K. M. Hunter Charitable Foundation.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
64CuCl2Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of RadiologyN/AOrder in small volume (<10 µL) dissolved in 0.1 N HCl
Acetic acid Any company≥ 95% purity
Aluminum foilAny company
Ammonium acetateAny companyPurity: ≥ 98%
Balance - analyticalAny companyAble to measure down to 0.1 mg
Bath sonicatorAny companyCan be heated to 69 oC
CC aperture - 30 micronBeckman CoulterA36391Particle diameter range: 0.6-18 um
CC electrolyteBeckman Coulter8546719Isoton II diluent
CC SoftwareBeckman CoulterMultisizer 4e
Centrifuge filter units (0.5 mL 30,000 MWCO) with compatible microcentrifuge tubesMilliporeSigmaUFC503096Amicon Ultra - 0.5 mL
Centrifuge tubes - 15 mL with capsAny company
ChloroformAny companyPurity: ≥ 99.8% 
Coulter counterBeckman CoulterB43905Multisizer 4e Coulter Counter
Cover slipsVWR48393081VWR micro cover glass
CuCl2Any companyEnsure not oxidized
CuCl2
Cuvette- quarts, 1 cm path lengthAny company
Cuvettes - 10 mL plastic for CC measurementsBeckman CoulterA35471Coulter Counter Accuvette ST
ddH2OAny companyCan be obtained through an ultrapure water purification system
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)Any companyPowder form
Dose calibratorAny companyAble to read copper-64
DPPA (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt))Avanti Polar Lipids830855PPowder form
DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850355PPowder form
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt))Avanti Polar Lipids880200PPowder form
DTPA-lipid (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid (ammonium salt))Avanti Polar Lipids790106PPowder form
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)Any company
Gamma counterAny companyAble to read copper-64
Gamma counting tube push capsGlobe Scientific22-171-665Flanged plug caps for 12 mm tubes
Gamma counting tubesSarstedt55.15795 mL, 75 x 12 mm, PS
Glass beaker - 250 mLAny companyAble to withstand temperatures up to 100 oC
Glass drying ovenAny companyCan be heated to 80 oC
Glass microliter syringes - 25, 50, 100, 1000 µLAny companyCompatible with organic solvents
Glass scintillation vials - 20 mLVWR66022-081VWR® Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Caps, With pulp foil liner
Glass vials - 0.5 dramVWR66011-020VWR Vial 1/2 dram, with black phenolic screw cap and polyvinyl-faced pulp liner
GlycerolSigma AldrichG7757-1LPurity:  ≥ 99.0% 
Graduated pipette/gunAny company
Hot/stir plateEquipped with temperature prob for automatic tempearture control
Hydrochloric acid - 0.1 NAny company
iTLC platesAgilentA120B12 iTLC-SA chromatography paper
Laboratory tissuesAny company
Media vaccuum filtration unitAny company0.22 micron pore size, PES membrane, 500 mL funnel capacity
MethanolAny companyPurity:  ≥ 99.8%, HPLC grade, meets ACS specifications
Microcentrifuge tubes non sterile - 1.5 mLAny company
Microcentrifuge tubes sterile - 1.5 mLAny company
Micropipetes - p1000, p200, p20, p10Any companyEnsure are calibrated
Microscope slidesFisher Scientific12-550-15Superfrost Plus Microscope Slides Precleaned
Needles - 18 GSterile
ParafilmAny company
PBSSigma AldrichD8537-500MLDPBS, modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
PFPFluoroMedAPF-N40HPPurity:  ≥ 99.8%
PFP lineAny company1/4 inch diameter plastic hose cut about 50 cm in length
PFP regulatorSwagelokSS-1RF4 and SS-4HC-1-4
pH meterAny company
pH standards 4 and 7Any company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - non sterileAny company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - sterileAny company
Plastic syringe - 1 mLAny companySterile
Propylene glycolBioShopPRO888.500Purity:  ≥ 99.5%
Pyro-lipidN/AMade in-house
Rubber tipped forcepsAny companyMix of fine-tipped and flat/square edges recommended
ScissorsAny company
Sodium hydroxide - 1 NAny company
Sodium hydroxide - 10 NAny company
SpectrofluorometerAny companyCapable of 410 nm excitation and 600-850 nm emission
Spectrofluorometry softwareHoribaFluorEssence
SpectrometerAny company
Syringe - 1 mLAny companyDisposible, plastic, sterile
Syringe filters - 0.2 micron pore sizeAny companyMembrane material: PES or other compatible with ammonium acetate/acetic acid and PBS
Test tube - 10 mL
Triton X-100Any company
Vacuum desicator/vacuumAny company
VialmixLantheus Medical Imaging515030-0508Referred to in protocol as a mechanical vial shaker
Weigh paperAny companyTo avoid losing product, cutting weigh paper into 3x3 cm squares is recommended

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