Floresan ve Radyoaktif İzleyicilerle Mikro Kabarcıkların Üretilmesi ve Etiketlenmesi

Özet

Bu protokol, lipid mikro kabarcıklarının üretimini ve mikro kabarcık fizikokimyasal özelliklerini koruyan, saflaştırma gerektirmeyen %>95 etiketleme verimliliğine sahip uyumlu bir tek hazneli mikro kabarcık radyoetiketleme yöntemini ana hatlarıyla belirtir. Bu yöntem, çeşitli lipid mikro kabarcık formülasyonlarında etkilidir ve radyoaktif ve/veya floresan mikro kabarcıklar oluşturmak üzere uyarlanabilir.

Özet

Mikro kabarcıklar, vasküler ultrason kontrast maddelerinden devrim niteliğindeki kanser tedavisi platformlarına evrimleşen lipit kabuklu, gazla dolu parçacıklardır. Terapötik odaklı ultrason (FUS) ile birleştirildiğinde, fizyolojik engelleri (örneğin kan-beyin bariyeri) güvenli ve lokal olarak aşabilir, başka türlü erişilemeyen kanserlere (örneğin glioblastoma ve pankreas kanseri) ilaç verebilir ve nörodejeneratif hastalıkları tedavi edebilirler. Mikrokabarcık-FUS'un terapötik cephaneliği, sinerjik kombinasyon radyoterapisi, multimodal görüntüleme ve mikro kabarcık kabuklarından hepsi bir arada ilaç yükleme ve verme dahil olmak üzere yeni yönlerde ilerliyor.

Mikro kabarcıkları radyoizleyicilerle etiketlemek, bu genişletilmiş teranostik yeteneklerin oluşturulmasının anahtarıdır. Bununla birlikte, mevcut mikro kabarcık radyoetiketleme stratejileri, mikro kabarcık fizikokimyasal özelliklerini bozduğu, kısa ömürlü radyoizotoplar kullandığı ve her zaman kararlı şelasyon sağlamadığı bilinen saflaştırma metodolojilerine dayanmaktadır. Toplu olarak, bu, mikro kabarcık radyogörüntülemenin doğruluğunu ve tümör radyoizotop dağıtımının verimliliğini çevreleyen belirsizlik yaratır.

Bu protokol, %>95 radyoizotop şelasyon verimliliği sağlarken mikro kabarcık fizikokimyasal özelliklerini koruyan yeni bir tek hazneli, saflaştırma içermeyen mikro kabarcık etiketleme metodolojisini açıklar. Çok yönlüdür ve farklı asil lipid zincir uzunluğu, şarj ve şelatör / prob (porfirin, DTPA, DiI) bileşimine sahip özel ve ticari mikro kabarcık formülasyonlarında başarıyla uygulanabilir. Öğütülmüş mikro kabarcık üretimi sırasında ve floresan ve multimodal floresan / radyoaktif özelliklerin modüler özelleştirilebilirliği ile önceden yapılmış mikro kabarcık formülasyonlarına uyarlanabilir şekilde uygulanabilir. Buna göre, bu esnek yöntem, mekanik, görüntüleme ve terapötik mikro kabarcık-FUS uygulamalarını ilerletmek için yararlı olan özel, izlenebilir (radyo, floresan veya radyo/floresan aktif) multimodal mikro kabarcıkların üretimini sağlar.

Giriş

Mikro kabarcıklar, bir protein, polimer veya çoğu durumda bir lipid kabuğu ile stabilize edilmiş bir gaz çekirdeğine sahip mikron boyutunda supramoleküler teranostik ajanlardır (Şekil 1A). Kan dolaşımına enjekte edildiğinde, mikro kabarcıklar, gaz çekirdeklerinin ^1,2 çözünmesinden önce dakikalar süren zaman dilimleri boyunca ultrason tarafından tespit edilebilen gaz/sıvı arayüzlerini korur. Sonuç olarak, mikro kabarcıkların ilk klinik kullanımı gerçek zamanlı ultrason görüntüleme kontrast maddeleriydi³. Terapötik odaklı ultrasonun (FUS) icadı, mikro kabarcık klinik yardımcı programlarını genişletti. Düşük frekanslı FUS ile uyarıldığında, mikro kabarcıklar salınır ve geçici vasküler geçirgenlikten fokal doku ablasyonuna^{kadar değişen} hedeflenmiş, ayarlanabilir mekanik kuvvetler üretir ^4,5. Sonuç olarak, son 20 yılda, kan-beyin bariyeri (BBB) açılması, tümör (örneğin, pankreas, beyin ve karaciğer metastatik kanseri) ilaç ve görüntüleme probu dağıtımı, nörodejeneratif hastalık tedavisi ve kanser ablasyonu^için mikrokabarcık-FUS araştırılmıştır 6,7,8,9,10,11.

Mikro kabarcıkların teranostik cephaneliği yeni ve heyecan verici yönlerde ilerlemeye devam ediyor. Konvansiyonel mikro kabarcık-FUS dağıtım uygulamaları, ticari mikro kabarcıkların yanı sıra terapötik veya görüntüleme kargosunun birlikte uygulanmasına dayanır. Mikro kabarcık kabuğu/biyolojik etkileşimlerini anlayarak, ısmarlama ticari olmayan mikro kabarcık formülasyonlarını keşfederek ve kargonun doğrudan mikro kabarcık kabuğuna^yüklendiği hepsi bir arada teranostik mikro kabarcıklar üreterek mikro kabarcık-FUS dağıtım yeteneklerini geliştirmeye artan bir ilgi vardır ^12,13,14. Aslında, lipid mikro kabarcık ilaç dağıtım çalışmalarının yaklaşık% 40'ı bu tür kabuk yüklü mikro kabarcıkları kullanır¹⁵. Görüntüleme ve ilaç dağıtımının ötesinde, mikrokabarcık-FUS ayrıca kanser radyoterapisinin¹⁶ arttırılmasında ve sonodinamik tedavi^17,18 yoluyla aksi takdirde iyi huylu kabuk yüklü ajanların antineoplastik etkilerinin aktive edilmesinde umut vaat etmiştir.

Mikro kabarcık kanseri uygulamalarındaki bu geleneksel ve genişletilmiş talimatlar, mikro kabarcık kabuklarını radyoaktif izleyicilerle etiketleyerek daha stratejik olarak geliştirilebilir. Hepsi bir arada kargo yüklü mikro kabarcıklar alanında, bu tür radyoetiketleme 1) bu yüklü mikro kabarcık kabuklarının hedef içi ve dışı biyolojik dağılımının altın standart, nicel değerlendirmesini kolaylaştırır, 2) hedefe yönelik teslimatı en üst düzeye çıkarmak için mikro kabarcık bileşimlerinin optimal seçimini bildiren farmakokinetik yapı-aktivite ilişkilerini türetir ve 3) stratejik ve uygun görüntü kılavuzlu uygulama ve tedavi planlamasına rehberlik eder (örneğin, doku hedeflerinin türleri, dozimetri, hedef dışı güvenlik endişelerini azaltmak için ilaç seçimi, geleneksel ortak tedavi paradigmalarına kıyasla fayda) hepsi bir arada kargo yüklü sistemlerin^15,19. Klinik öncesi bir aşamada, mikro kabarcık kabuğu kaderinin böyle bir anlayışı, daha geniş mikro kabarcık-FUS etki mekanizmalarını da aydınlatabilir. Örneğin, mikro kabarcık kabuklarından hedef hücrelere lipid transferinin FUS özellikli sonoporasyonu etkilediği gösterilmiştir^12,20. Bu tür bir transferin anlaşılması ve optimize edilmesi, sonoporasyonun dahil olduğu preklinik ve klinik mikrokabarcık-FUS tedavilerini (in vitro transfeksiyon, ilaç dağıtımı, tümör ablasyonu, radyasyon duyarlılığı ve sonodinamik tedavi 20,21,22,23,24,25). İkili ultrason ve radyogörüntüleme olanakları, geleneksel çift ajan tasarımları yerine tek bir ajandan FUS damar açma ve tedavi izlemesini (örneğin, BBB açma kinetiği) de mümkün kılacaktır²⁶. Aynı şekilde, lipid mikro kabarcık radyoetiketleme, mikro kabarcık-FUS + radyofarmasötik ortak dağıtım platformlarına hepsi bir arada tek ajanlı mikro kabarcık-FUS / radyoterapi alternatifi olarak hizmet edebilir²⁷.

Mikro kabarcıkların kırılganlığı, bu tür etiketleme için önemsiz bir zorluktur. Mevcut tüm radyoetiketleme stratejileri, mikro kabarcık stabilitesini ve boyutunu bozduğu bilinen saflaştırma metodolojileri ile sınırlıdır, bazıları ise etkisiz ve kararsız radyoetiketleme^{özelliğine sahiptir} 28,29,30,31,32. Saflaştırma gereksinimleri ayrıca daha uzun protokollere yol açar. Kısa ömürlü radyoizotopların kullanımıyla birleştiğinde (örneğin, ¹⁸F t_1/2 1.8 ^{h,28,29 99m}Tc t_1/2 6 ^h,3268Ga t_1/2 1 h³¹), bu, radyoizotop bozunması ile ilgili verimsizlikler yaratır ve radyogörüntüleme ve tedavi planlama zaman dilimlerini sınırlar. Toplu olarak, bu sınırlamalar, kısaltılmış ve temsili olmayan radyogörüntüleme, yanlış farmakokinetik veriler ve verimsiz tümör radyoizotop iletiminin elde edilmesini riske atar.  

Bu raporda, porfirinin güçlü ve stabil metal şelasyon yeteneklerinden yararlanılarak bu sınırlamaların üstesinden gelinmektedir. Porfirinler, yüksek oranda konjuge düzlemsel bir halkaya ve çeşitli metalleri barındırabilen merkezi bir koordinasyon bölgesine sahip organik, heterosiklik makromoleküllerdir. Bu, bakır-64 (t_1/2 12.7 h), pozitron emisyon tomografisi (PET) olan bir radyofarmasötik ve γ sayma fizibiliteleri³³ gibi daha uzun ömürlü radyoizotopları içerir. Bir lipid omurgasına konjuge edildiğinde, porfirinler supramoleküler yapılara kolayca dahil edilebilir ve daha sonra hız, yüksek şelasyon verimliliği ve serum stabilitesi ile bakır-64 ile etiketlenebilirken, ana etiketlenmemiş partiküllerin özelliklerini korurken^33,34. Ayrıca, porfirinler, partikül bozulması üzerine eski haline getirilen nano ve mikropartiküllerde modüler kendi kendine söndürme ile floresan olarak aktiftir; hem toplu hem de mikroskobik kabuk kaderi analizini kolaylaştıran PET ve γ sayımına tamamlayıcı bir okuma (Şekil 1A)¹⁵.

Bir şelatör olarak porfirin-lipid kullanılarak, bu özellikler, mevcut mikro kabarcık radyoetiketleme yöntemleriyle ilişkili sınırlamaların üstesinden gelen yeni bir tek kaplı, saflaştırma içermeyen mikro kabarcık radyoetiketleme metodolojisi (Şekil 1B, C) oluşturmak için kullanıldı. Bu protokol %>95 bakır-64 şelasyon verimliliğine ulaşır, etiketleme sonrası saflaştırma gerektirmez ve mikro kabarcık fizikokimyasal özelliklerini korur. Aktivasyonlarından önce lipid mikro kabarcıklarının "topraklanmış" imalatına kolayca entegre edilebilir (Şekil 1B). Çok yönlüdür ve farklı asil lipid zincir uzunluğu (C16 ila C22), yük (nötr ve anyonik) ve porfirin-lipid bileşimleri (%1 mol, %10 mol, %30) ile özel ve ticari mikro kabarcık formülasyonlarında başarıyla uygulanabilir ve hem radyo hem de floresan aktiviteye sahip mikro kabarcıklar oluşturur. Uyarlanabilirliği porfirinin ötesine de uzanabilir. Tek kap protokolü, ticari olarak temin edilebilen alternatif şelatörleri (örneğin, dietilentriamin pentaasetat (DTPA)-lipid) ve floroforları (örneğin, DiI) kullanacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, "spiking" yaklaşımıyla önceden hazırlanmış mikro kabarcık formülasyonlarını etiketlemek için de değiştirilebilir. Buna göre, bu yöntem, mekanik, görüntüleme ve terapötik mikrokabarcık-FUS uygulamalarını ilerletmek için yararlı olan, özelleştirilmiş, izlenebilir (radyo, floresan veya çift radyo/floresan aktif) mikro kabarcıkların üretilmesini sağlar. Aşağıdaki protokol, lipid mikro kabarcıklarının üretimini, tek hazneli radyoetiketleme protokolünün uygulanmasını, gerekli radyoetiketleme ve fizikokimyasal özellik karakterizasyonunu ve potansiyel modifikasyonları özetlemektedir.

Şekil 1: Mikro kabarcık üretimi ve radyoetiketleme protokolü. (A) Pirofeoforbid-a-lipid formundaki porfirin-lipid, bu protokol içinde multimodal bir şelatör görevi görür. Bakır-64 (i) şelatlı bir monomer olarak, PET ve görüntüleme yeteneklerine sahiptir. Floresansı partikül formunda söndürülür (mikro kabarcıklar (ii) ve çözünme sonrası nanoprogenleri (iii)) ve partikül bozulması (iv) ile söndürülmez. (B) Yerden yukarıya lipid mikro kabarcıkları oluşturmak için bu raporda açıklanan lipit film hidrasyonu/aktivasyon protokolü ve (C) lipid süspansiyon oluşumu ile mikro kabarcık aktivasyonu arasında tek kap radyo etiketlemenin entegrasyonu. Bu rakam Rajora ve ^ark.15'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. Amonyum asetat tamponu hazırlayın (0.1 M, pH 5.5)
   1. Analitik bir terazi kullanarak, 770,8 mg amonyum asetat bir tartım kağıdına tartın. Tartılan miktarı 250 mL'lik temiz bir cam kabın içine aktarın.
   2. Behere dereceli bir pipetle ölçülen 90 mL çift damıtılmış su (ddH₂O) ekleyin. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve amonyum asetatı çözmek için beheri manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Hafif bir girdap oluşturan, ancak çözelti sıçraması olmayan bir hızda karıştırın.
   3. pH 4 ve 7 standartlarını kullanarak bir pH metreyi cihaz talimatlarına göre kalibre edin. Kalibre edildikten sonra, pH probunu amonyum asetat tamponuna yerleştirin.
   4. Çözeltiye 104 μL asetik asit ekleyin, çözünmesi için karıştırın ve pH'ı ölçün.
      NOT: Bu noktada pH 5.5'e yakın olmalıdır.
   5. Bir mikropipet kullanarak 5-10 μL'lik artışlarla 10 N sodyum hidroksit (veya tampon çok bazik hale gelirse hidroklorik asit) ekleyerek tamponun pH'ını ayarlayın. Karıştırın, pH'ı ölçün ve gerektiği kadar tekrarlayın. Eklenen baz/asit hacmini not edin.
   6. Toplam 100 mL tampon oluşturmak için yeterli miktarda ddH_2Oekleyin.
      NOT: Örneğin, pH ayarlaması sırasında 45 μL 10 N sodyum hidroksit kullanılmışsa, behere 9.851 mL ddH_2Oeklenecektir (100 mL [hedef hacim] - 90 mL [adım 1.1.2] - 0.104 mL [adım 1.1.4] - 0.045 mL [adım 1.1.5] = 9.851 mL).
   7. Kapaklı bir saklama kabına aktarmadan önce tamponu son bir kez iyice karıştırın.
   8. pH metreyi cihaz talimatlarına göre temizleyin.
      DİKKAT: Konsantre sulu sodyum hidroksit ve hidroklorik asit cilt reaksiyonlarına neden olabilir ve eldiven kullanılarak kullanılmalıdır.
2. Hidrasyon tamponu (PGG) hazırlayın
   1. Fosfat tamponlu salini (PBS) bir şırıngaya aspire edin ve ucunu bir polietersülfon 0.2 μm gözenek boyutu şırınga filtresi ile donatın. PBS'yi temiz, plastik, kapaklı bir santrifüj tüpüne filtreleyin.
      NOT: Alternatif membran malzemelerinin (örneğin, poliviniliden florür) 0,2 μm gözenekli şırınga filtreleri, membran PBS ve amonyum asetat ile uyumlu olduğu sürece kullanılabilir.
   2. Hidrasyon tamponunu (PGG olarak da adlandırılır) yapmak için filtrelenmiş PBS, propilen glikol ve gliserolü mikropipet aracılığıyla 8:1:1 hacimsel oranda birleştirin. Propilen glikol ve gliserol eklerken, reaktifi PBS'ye yavaşça pipetlemeden önce pipet ucunun yüzeyinden kalan propilen glikol veya gliserol damlacıklarını aspire edin ve silin. PBS'de berrak bir sicim benzeri viskoz bulanıklık görülecektir.
      NOT: Önce bir santrifüj tüpüne PBS eklemek için bir p1000 mikropipet kullanılması önerilir, ardından propilen glikol ve gliserol kullanılır, çünkü son iki reaktif viskozdur. Bu nedenle, pipet ucunda sıvı hareketi artık görülmeyene ve pipet ucu reaktiften çıkarıldığında hava alınmayacak şekilde mikropipet aracılığıyla yavaşça aspire edilmelidirler. Hacimsel işaretlere sahip mikropipet uçları, bu tür işaretlerle uyumlu reaktif hacimlerini seçmek için ideal olarak kullanılmalıdır (örneğin, 1 mL veya 5 mL PGG yapmak ve sırasıyla propilen glikol ve gliserolün tam aspirasyonunu görselleştirmek için mikropipet ucundaki 0,1 mL veya 0,5 mL işaretini kullanmak). Mikropipet ucunun yüzeyini silerken, uç açıklığından silmeyin, sadece yanlardan silin.
   3. Reaktifler homojen bir şekilde çözülene kadar pipet ucu solüsyon içinde olacak şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin. Solüsyonun içine herhangi bir hava kabarcığı girmemesine dikkat edin.
   4. Hidrasyon tamponunun tam bir karışımını daha da sağlamak için santrifüj tüpünü kapatın ve yavaşça yukarı ve aşağı döndürün. Girdap yapmayın.
   5. Gözlenemeyen hava kabarcıklarını gidermek için tüpü 20-30 s (minimum sıcaklık 4 °C, maksimum RT) boyunca 1000 x g'dan daha düşük bir sıcaklıkta döndürün.
3. Hidrasyon/radyoetiketleme tamponu (AA-PGG) hazırlayın
   1. Şırınga filtresi 0.1 M, pH 5.5 amonyum asetat tamponu (adım 1.1'den itibaren) ve PBS'yi adım 1.2.1'e göre ayrı tüplere koyun.
   2. Filtrelenmiş amonyum asetat tamponunu, filtrelenmiş PBS'yi, propilen glikolü ve gliserolü bir p1000 mikropipet aracılığıyla 5: 3: 1: 1 amonyum asetat tamponunda bir santrifüj tüpüne birleştirin: PBS: propilen glikol: gliserol hacimsel oranı listelenen sırayla. AA-PGG yapmak için 1.2.2.2.5-1.2.5 adımlarına göre aspirasyon, karıştırma ve santrifüjleme talimatlarını izleyin.
4. Anlık ince tabaka kromatografisi (iTLC) eluenti
   1. 0,1 g'a kadar etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tartın ve kapaklı bir şişeye aktarın. ddH₂O'da% 2 w / v EDTA çözeltisi yapılacak şekilde çözün (örneğin, 50 mg EDTA için 2.5 mL ddH₂O ekleyin).
   2. %2 w/v EDTA çözeltisini 1.1. adımdaki amonyum asetat tamponu ile 9:1 v/v oranında (%90 EDTA çözeltisi, %10 amonyum asetat tamponu) birleştirin. Elde edilen iTLC eluent'i kapatın ve saklayın.

2. Lipid filmlerin oluşumu

NOT: Bu prosedür, konakçı lipidin yerini alan ve toplam lipidin %30'unu oluşturan porfirin-lipid ile ticari mikro kabarcığı taklit eden bileşimlerle, Definity'ye^® sahip bir lipit filminin oluşumunu ana hatlarıyla belirtir. Bununla birlikte, radyo etiketleme protokolü çeşitli lipid formülasyonlarına (C16, C18, C22 zincir uzunlukları, nötr veya anyonik yük, değişen porfirin-lipid molar bileşimleri) uygulanabilir. Açıklanan ve diğer formülasyonlar için hesaplamalar, bileşimler, kütleler ve stok hacimleri sağlayan bir Ek Elektronik Tablo (Ek Dosya 1) eklenmiştir. Sentezi daha önce ayrıntılı olarak tarif edilmiş olan porfirin-lipid, pirofeoforbid-a-lipid (piro-lipid) hariç tüm lipitler ticari olarak temin edilebilir^35,36.

1. Ek Dosya 1'i kullanarak, gerekli film sayısına bağlı olarak her bir lipit için gereken toplam kütleyi belirleyin.
2. Boş bir 0,5 dram cam şişeyi analitik terazide tartın.
   NOT: Toz, başarılı mikro kabarcık oluşumunu engeller. Bu nedenle, kapaksız olarak saklanırsa herhangi bir toz/partikülü gidermek için şişeye basınçlı hava üfleyin.
3. 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfokolini (DPPC) tartı kağıdına tartın.
   NOT: Tartılan kütle, daha sonraki adımlarda numune işleme sırasında herhangi bir kaybı hesaba katmak için adım 2.1'den artı ek bir 0.5-1 mg elde edilmelidir.
4. DPPC'yi tartılan cam şişeye aktarın ve şişedeki lipit kütlesini belirlemek için yeniden tartın. Bu işlem, cam şişeye daha kolay lipit transferi, lipit tozu kaybının/dökülmesinin azaltılmasına ve lipit kütlesinin daha doğru ölçülmesine olanak tanır.
5. 2.2'den 2.4'e kadar olan adımları diğer lipitlerle tekrarlayın: 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfat (DPPA) ve C16 piro-lipid.
   NOT: Piro-lipid tartılabilir bir toz formunda mevcut değilse, bunun yerine bilinmeyen miktarda bir film veya alikot olarak mevcutsa, daha önce açıklandığı gibi Beer-Lambert yasası kullanılarak metanolde UV-Vis absorbans ölçümleri yoluyla konsantrasyonu hesaplanabilen bir stok oluşturmak için kloroform içinde çözülebilir³⁵.
6. Mikropipetler veya cam şırıngalar kullanarak cam test tüplerinde aşağıdaki organik çözücüleri ve çözeltileri hazırlayın: 1) kloroform, 2) 9:1 v/v kloroform: metanol ve 3) 65:35:8 kloroform: metanol: ddH₂O. Son olarak, bileşenleri pipetleyin ve aşağıdaki sırayla karıştırın: ddH₂O, metanol, ardından kloroform.
   DİKKAT: Metanol ve kloroform sağlığa zararlıdır, yanıcı ve uçucudur. Göz koruması, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin ve çeker ocak kullanın.
7. Lipid stokları yapmak ve uygun hacimlerde cam şırıngaları seçmek için gereken organik çözücü/çözelti hacmini hesaplamak için Ek Dosya 1'i kullanın.
   NOT: Bu hacim, 25-100 μL cam mikrolitre şırıngalar kullanılarak kolayca ölçülebilen, film başına 15-100 μL stok alikot hacimlerine karşılık gelen stok konsantrasyonları vermelidir.
8. Cam şırıngaları kloroform ile üç kez durulayın. Şırıngayı kurutmak için pistonu ileri geri pompalayın.
9. Lipid stokları oluşturmak için temizlenmiş cam şırınga yoluyla organik çözücüyü / çözeltileri ölçün ve adım 2.7'deki elektronik tablo hesaplamalarına göre ayrı lipid şişelerine ekleyin. Piro-lipidi kloroformda çözün (adım 2.5 notuna göre zaten çözünmemişse), DPPC ve DPPE-mPEG'i 9:1 v/v kloroformda çözün: metanol ve DPPA'yı 65:35:8 kloroform:metanol:ddH₂O'da çözün. Tüm eklemeler için aynı cam şırıngayı kullanıyorsanız, her bir lipit arasında durulayın ve kurulayın.
   NOT: Tercih edilen formülasyon DPPA veya C18 zincir uzunluğu varyantını içermiyorsa, piro-lipid, konak PC lipidi ve PEG lipidinin tümü kloroformda çözülebilir.
10. Şişeleri ve girdabı kapatın.
11. Bir cam mikrolitre şırınga aracılığıyla yeni bir 0.5 dram cam şişeye (film şişesi) hesaplanan hacimlerde stok lipid çözeltileri ekleyin. İlk lipit stoğu için, iğne ucunu şişenin alt ortasına yerleştirin ve şişe duvarlarına sıçramasını önlemek için yavaşça daldırın. Sonraki eklemeler için, iğne ucunu doğrudan sıvı seviyesinin üzerine yerleştirin ve son damlaları iğneyi aşağıdaki sıvıya maruz bırakmayacak şekilde çıkarmak için şişenin yan tarafına dokunun.
    NOT: Kontaminasyon meydana geldiğinde lipit ilaveleri arasında cam şırıngayı durulayın ve kurulayın. Birden fazla film yapıyorsanız, solvent buharlaşmasını en aza indirmek için eklemeler arasında hem filmi hem de stok şişelerini kapatın.
12. İçeriği karıştırmak için şişeyi manuel olarak dik konumda hafifçe döndürün. Flakon duvarlarına herhangi bir çözelti sıçratmaktan kaçının.
13. Kapağı açın (kapağı saklayın) ve şişenin üst boşluğuna bir nitrojen hattı yerleştirin. Nitrojen akışını, sıvı yüzeyinde gözle görülür hafif bir rahatsızlığa neden olacak şekilde, ancak herhangi bir huni veya sıçrama olmadan ayarlayın.
14. Nitrojen hattını yerleştirdikten hemen sonra şişeyi vorteksleyin. Şişenin dibinden 1 cm'den daha yükseğe çıkmayan çözücü ile bir huni oluşturmaya yetecek kadar düşük bir hızda başlayın. Solvent sıçramasını önleyin. Çözücü buharlaştıkça, girdap hızını yavaşça ve duraklamadan artırın ve tüm sıvı buharlaşana kadar çözücü yüksekliğini koruyun. Sonuç, şişenin alt üçte birlik kısmı boyunca kaplanmış ince bir film olacaktır.
15. Şişeyi vakumlu bir kurutucuya yerleştirin ve filmi 8-72 saat vakum altında kurutmaya devam edin. Şişeyi (açıklık hariç) veya kurutucuyu alüminyum folyo ile örtün.
    NOT: Protokol buradan duraklatılabilir. Sonraki adımlar, film kuruduktan sonra gerçekleştirilebilir veya filmler argon altında, Parafilm ile kapatılmış, -20 ° C'lik bir dondurucuda 1 aya kadar ve kuru tutulursa daha uzun süre saklanabilir.

3. Lipid film hidrasyonu

NOT: Mikro kabarcıklar in vitro veya in vivo kullanılıyorsa, aksi belirtilmedikçe 3.3 ila 5.4 arasındaki adımlar için steril mikropipet uçları, tüpler, şırıngalar ve iğneler kullanın.

1. Filmi vakumdan çıkarın veya dondurucuda saklanıyorsa, RT'ye kadar ısınmasına izin verin.
2. 250 mL'lik bir kabı suyla doldurun ve suyu 70-80 °C'ye ısıtın.
3. Bir su banyosu sonikatörünü 69 °C'ye ısıtın.
4. Kabarcık oluşumunu önlemek için lipid film şişesinin kenarlarından 1 mL AA-PGG (adım 1.3) mikropipetleyin.
   NOT: Şelatsız kontrol veya yalnızca floresan mikro kabarcıklar üretirken, AA-PGG yerine PGG (adım 1.2) kullanın.
5. Flakon açıklığını bir kapakla kısmen kapatın ve bir perfloropropan (PFP) hattı yerleştirmek için yeterli alan bırakın. PFP'yi sıvının üzerinde 20 saniye boyunca flakon üst boşluğuna akıtın, böylece sıvı gözle görülür şekilde bozulur ancak sıçramaz. PFP'yi doğrudan süspansiyona akıtmayın. Şişeyi kapatın.
   NOT: Akış güç ve zaman açısından yeterliyse, flakon dokunulduğunda soğumaya başlayacaktır.
6. Şişenin alt yarısını 1 dakika boyunca 70-80 ° C su banyosuna daldırın. Ardından, 69 ° C banyo sonikatöründe en az 30 saniye boyunca veya lipit filmi AA-PGG'ye homojen bir şekilde dağılana kadar sonikasyon yapın. Kabarcıklar oluşturmaktan veya mikro kabarcık oluşumunu erken aktive etmekten kaçının (erken aktivasyon, lipid süspansiyonunda sütlü / bulanık alanlar olarak görünecektir). Herhangi bir askıya alınmamış lipit kalıp kalmadığını daha iyi ayırt etmek için gerektiğinde flakon yüzeyini silin.
   NOT: Lipid film sonikasyondan sonraki 1 dakika içinde hidratlanmazsa, 70-80 °C banyoda yeniden ısıtın ve yeniden sonikasyon yapın.
7. Lipid film homojen bir şekilde süspanse edildikten sonra, son bir kez 1 dakika ısıtın ve 30 saniye daha sonikat yapın.
8. Şişeyi silin ve pasif olarak RT'ye (~ 5-10 dakika) soğumaya bırakın.
9. Flakon üst boşluğunu adım 3.5'e göre PFP ile yeniden doldurun, kapatın ve kapak kenarlarını Parafilm ile kapatın.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve en geç 8 saat sonra devam ettirilebilir.

4. Radyo etiketleme

NOT: Şelatsız kontrol veya yalnızca floresan içeren mikro kabarcıklar için protokol Bölüm 5'e geçin.

DİKKAT: Aksi belirtilmedikçe, bu protokolün 4.4-4.6 adımlarını radyoaktif bir laboratuvarda gerçekleştirin. ⁶⁴CuCl₂ , cilde maruz kalma, soluma veya yutma yoluyla multisistem toksisite riski olan radyolojik bir tehlikedir. Mümkün olduğunda, lastik uçlu forseps kullanarak dolaylı olarak bir çeker ocakta tutun. Kullanırken koruyucu bir laboratuvar önlüğü, kişisel bir yüzük ve rozet dozimetresi ve çift eldiven giyin. ⁶⁴CuCl_2'nin 2 inç kurşun koruma boyunca işlendiğinden emin olun. Gerektiğinde, kurşun kılıflı bir kapta taşıyın. Atık konteynırlarını koruyun ve kullanımdan sonra kontaminasyon için operasyonel bir anket yapın.

1. 60 °C'lik bir cam beherde veya manyetik karıştırma çubuğu içeren büyük kristalleştirici bir kapta su banyosu hazırlayın. Suya yerleştirilmiş bir termal prob ile donatılmış, zayıf ancak görünür bir huni oluşturan bir hızda karıştırmaya ayarlanmış, sıcaklık kontrollü bir sıcak/karıştırma plakası kullanın.
2. 0.1 N HCl'de ⁶⁴CuCl₂ içeren kapalı bir şişeyi kauçuk uçlu forseps aracılığıyla bir doz kalibratörüne aktarın.
   NOT: ⁶⁴CuCl₂ sipariş ederken, 5-20 μL 0.1 N HCl'de çözülmesini isteyin. Mikro kabarcık verimini korumak için daha düşük bir hacim kritik öneme sahiptir.
3. Doz kalibratöründe ölçülen bakır-64 aktivitesine ve zamana dikkat edin. Forseps kullanarak şişeyi çıkarın ve kurşunlu bir kaba koyun.
4. Bir MBq·^mL-1 değeri elde etmek için ⁶⁴CuCl₂ için bildirilen hacme not edilen aktiviteyi bölün.
5. Lipid süspansiyonunu adım 3.9'dan itibaren açın ve bir şişe tutucusuna sabitleyin.
6. ⁶⁴CuCl₂ şişesinin kapağını açın ve forseps ile sabitleyin.
7. 40-250 MBq aktiviteye karşılık gelen ⁶⁴CuCl₂ çözeltisinin bir hacmini mikropipetleyin ve lipit süspansiyonuna aktarın. Pipet ucunun süspansiyona daldırıldığından emin olun. ⁶⁴CuCl_2'yi tamamen aktarmak için daldırın ve ardından yukarı ve aşağı pipetleyin.
   NOT: Eklenen ⁶⁴CuCl₂ miktarı, radyoaktif işaretli mikro kabarcıklar için amaçlanan uygulamaya ve doz kalibratörünün hassasiyetine bağlı olacaktır. Farelerde uzunlamasına (enjeksiyondan 48 saate kadar) PET ve in vivo kan örneklemesi için sırasıyla en az 220 MBq ve 50 MBq önerilir.
8. Hem lipid süspansiyonunu hem de ⁶⁴CuCl₂ şişesini kapatın.
9. Düz kauçuk uçlu forseps kullanarak, ⁶⁴CuCl_2'yi süspansiyon boyunca nazikçe karıştırmak için radyoaktif lipid süspansiyonunu en az 5 kez manuel olarak yukarı ve aşağı döndürün. Şişeyi sallamaktan veya düşürmekten kaçının ve kabarcık oluşumunu önleyin.
10. Sağ taraf yukarı bakacak şekilde, süspansiyonu sabit tutarken şişenin kapağını hafifçe vurun. Bu, kapakta sıkışan herhangi bir sıvının şişenin dibine çekilmesine yardımcı olacaktır. Şişenin kapağını dikkatlice kısmen açın ve 18 G iğneli bir PFP hattı yerleştirin. Flakon üst boşluğunu adım 3.5'e göre 20 saniye boyunca PFP ile doldurun. Şişeyi kapatın ve Parafilm ile kapatın.
11. Bir doz kalibratöründe flakon aktivitesini ölçün ve zamanı not edin.
    NOT: Şişeye yeterli aktivite aktarılmadıysa, ^{uygun bir ek hacim 64}CuCl₂ ekleyerek Adım 4.5-4.11'i tekrarlayın.
12. Şişeyi bir köpük şişe tutucusuna yerleştirin ve şişenin alt yarısı ısıya maruz kalacak şekilde itin. Tutucuyu 60 °C'lik karıştırma su banyosuna yerleştirin ve 1 saat ısıtın.
13. Şelasyon reaksiyonu devam ederken, iTLC plakalarını hazırlayın. Taze eldiven giyerken, cam mikrofiber kromatografi kağıdını 1 cm x 8 cm'lik şeritler halinde kesin. Şeritleri 80 °C'lik bir cam kurutma fırınında ısıtın.
    NOT: Bu adım, radyoaktif olmayan bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir.
14. 1 saat sonra, adım 4.12'deki şişeyi ocaktan alın ve kenarlarını mendille silin.
15. Flakon duvarlarındaki herhangi bir yoğuşmayı lipid süspansiyonuna yeniden yoğunlaştırmak için şişeyi lastik uçlu forseps ile manuel olarak yukarı ve aşağı döndürün.
16. Flakon dik konumdayken, tüpü stabilize ederken kapağı hafifçe vurun. Parafilmi çıkarın ve sıkışan banyo suyunu çıkarmak için kapağın etrafını silin.
17. Şişenin kapağını dikkatlice açın ve 1-2 μL lipit süspansiyonunu aspire edin. Süspansiyonu bir iTLC şeridinin alt merkezinden 1 cm uzakta bulun ve şişeyi yeniden kapatın. Lekenin kurumasını bekleyin.
    NOT: İdeal olarak, reaksiyon karışımı başına en az 2 iTLC tespit edilmeli ve kesinlik için radyoaktif işaretli lipid süspansiyonu başına geliştirilmelidir.
18. 200 μL iTLC eluentini (adım 1.4'te hazırlanan) 10 mL'lik bir test tüpünün dibine mikropipetleyin. Test tüpünü kurşun bir kaba koyun. Benekli iTLC'yi tüpe ekleyin ve eluent şeridin üst kenarından yaklaşık 1 cm uzakta olana kadar şeridin gelişmesine izin verin.
19. Forseps kullanarak geliştirilen iTLC şeritlerini çıkarın. Şeridi dikey olarak tutun ve γ tezgah ve itme kapağı uyumlu yuvarlak bazlı 5 mL plastik tüpler üzerinde, her bir şeridin üçte biri doğrudan ayrı bir üçte birine düşecek şekilde üçe bölün. İtme kapaklarını üç tüpe yerleştirin.
20. Bakır-64 aktivitesi için bir γ sayacında şerit içeren tüpleri ve boş/kapaklı bir kontrol tüpünü ölçün ve ilgili dakika başına sayıları (cpm) kaydedin. Arka plan aktivitesini düzeltmek için kontrol tüpü aktivitesini diğer okumalardan çıkarın.
    NOT: Şeridin alt üçte birlik kısmı (parça 1) için düzeltilmiş okumalar, lipid süspansiyon partiküllerine şelatlanmış bakır-64 ile ilişkilidir. Orta kısım (parça 2), supramoleküler olmayan formda bir dizi serbest bakır-64 ve ⁶⁴Cu-piro-lipid şelat içerir. Üst kısım (parça 3) ağırlıklı olarak serbest bakır-64 içerir.
21. Denklem 1 ile radyokimyasal saflığı hesaplayın.
    (Denklem 1)
    NOT: parça 1 için cpm makul olmayan bir şekilde düşük görünüyorsa (örneğin, parça 2 veya 3'e daha düşük veya eşdeğer) veya herhangi bir okuma γ sayacı doğrusal olmayan/doygunluk eşiğinin üzerindeyse, daha düşük bir hacim veya seyreltilmiş bir alikot (1-2 μL) iTLC için radyo etiketli süspansiyonun.
22. Devam etmek için lipid süspansiyonu başına her iki iTLC şeridinden elde edilen radyokimyasal saflığın ≥ %94 olduğundan emin olun. Değilse, lipid süspansiyonunu 60 ° C'de ısıtmaya devam edin ve şelasyonu iTLC aracılığıyla 30 dakikalık aralıklarla izleyin.
23. Radyoaktif işaretli lipid süspansiyon şişesinin kapağını açın ve 8.89 μL 1 N NaOH mikropipetini süspansiyona yerleştirin, tabanı tamamen aktarmak ve süspansiyonu nötralize etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Şişeyi kapatın, ters çevirmek/geri döndürmek için forseps ile manuel olarak döndürün ve ardından şişe kapağına hafifçe vurun.
24. Baş boşluğunu adım 4.10'a göre PFP ile doldurun, kapatın ve Parafilm ile kapatın.

5. Mikro kabarcık aktivasyonu ve izolasyonu

1. Sütlü bir mikro kabarcık süspansiyonu oluşturmak için lipid süspansiyonunu 4530 rpm'de 45 saniye boyunca mekanik bir flakon çalkalayıcı ile etkinleştirin. Şişenin yaklaşık 10 dakika boyunca RT'ye pasif olarak soğumasına izin verin. Elde edilen sütlü süspansiyon zamanla iki katmana ayrılacaktır.
   NOT: Aktivasyondan sonra flakon içeriği sütlü görünmelidir. Aktivasyon sonrası daha net bir askıya alma, katkıda bulunanları daha sonraki bölümlerde tartışılacak olan başarısız aktivasyonun göstergesidir.
2. RT'ye geldikten sonra, mikro kabarcık süspansiyonunu yeniden askıya almak için şişeyi nazikçe ters çevirin / geri döndürün. Şişeyi düz bir yüzeye yerleştirin ve istenen mikro kabarcık popülasyonunu elde etmek için boşaltmadan önce 2 dakika bekleyin:
   1. 1 mL'lik bir plastik şırıngayı 18 G'lik bir iğne ile donatın ve şırıngayı/iğneyi aspire ederek ve havayı içeri/dışarı daldırarak havalandırın. 2 dakika işaretinde, Parafilm contasını tek bir hareketle kırarak şişenin kapağını hızlı bir şekilde açın.
   2. Şişenin altından (hedef mikro kabarcık popülasyonu) 400-550 μL çekin, daha büyük istenmeyen mikro kabarcık popülasyonlarının üst köpüklü tabakasının aspirasyonunu önleyin.
      NOT: Gerekirse, köpüklü / hafif tabakanın aspire edilmesini önlemek için uç hacimleri şırıngada toplamak için şişeyi bir tarafa eğin.
3. Köpüklü kirleticileri çıkarmak için iğnenin kenarlarını dikkatlice silin ve izole edilmiş mikro kabarcık süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yavaşça kapatın (kapağı aniden açıp kapatmayın). Bu, radyoaktif işaretli mikro kabarcıkların son çalışma süspansiyonudur.
4. Doz kalibratöründe nihai mikro kabarcık ürününün aktivitesini ölçün ve süreyi not edin. İlgilenilen uygulamaya bağlı olarak enjeksiyon hacimlerini hesaplamak için bir MBq·^mL-1 değeri elde etmek için bu değeri adım 5.2'de boşaltılan süspansiyon hacmine bölün.
   NOT: Radyo etiketli mikro kabarcıklar artık kullanıma hazırdır. Bölüm 6, 24 saat sonrasına kadar yürütülebilir. Bu radyoaktif işaretli mikro kabarcıkların multimodal (ultrason, PET, floresan) görüntüleme yoluyla in vivo olarak nasıl enjekte edilebileceği ve izlenebileceği hakkında bilgi için Rajora ve ^ark.15'e bakın.

6. Radyo etiketleme verimliliğinin doğrulanması

1. Mikro kabarcık süspansiyonunu hafif pipetleme veya flakon ters çevirme yoluyla yeniden askıya alın.
   NOT: Mikro kabarcıklı çalışan bir ürünü asla girdaplamayın. Girdap, mikro kabarcık süspansiyonlarını dengesizleştirir.
2. 0.5 mL 30.000 moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj filtre ünitesine 10-200 μL radyo işaretli süspansiyon ekleyin. <200 μL'lik hacimler kullanılıyorsa, toplam 2 μL'lik bir hacim oluşturmak için filtre ünitesine_ddH200 O ekleyin. Filtre ünitesini uyumlu bir mikrosantrifüj tüpüne ve kapağına yerleştirin.
   NOT: Protokolün başarılı bir şekilde tamamlanmasını sağlamak için uygulanan herhangi bir in vitro veya in vivo radyoaktif işaretli mikro kabarcıkların kullanımından önce ve ayrı olarak bir radyoetiketleme testinin yapılması önerilir. Bu durumda, bu adımda daha büyük bir hacim (örneğin, 200 μL) kullanılabilir. Protokol daha sonra bir tedavi seansı için kullanıldığında, önce tedavi hacimlerini/enjeksiyonlarını hazırlayın ve ardından kalan radyoaktif işaretli mikro kabarcık süspansiyonu ile mümkün olduğunca erken bölüm 6'yı gerçekleştirin.
3. RT'de 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   NOT: mikrosantrifüj kurşun koruma ile çevrelenmelidir.
4. Mikrosantrifüj tüpü ile kapağı arasındaki bağlantıyı makasla kesin.
   1. Kapağı "kapaklar" etiketli 20 mL'lik bir parıldama şişesine yerleştirin. Filtre ünitesini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne (tüp 2) aktarın.
   2. İlk mikrosantrifüj tüpünü infranatant ile "tüp 1" etiketli 20 mL'lik bir sintilasyon şişesine yerleştirin. Tüp_2'dekifiltre ünitesine 200 μL ddH 2 O ekleyin.
5. Filtre ünitesini tüp 2'de RT'de 12.000 x g'de santrifüjleyin.
6. 6.4 ve 6.5 adımlarını tekrarlayın. Tüp 2 kapağını, tüp 1 kapağını barındıran "kapaklar" parıldama şişesine ekleyin. Tüp 2'yi 20 mL'lik yeni bir sintilasyon şişesine yerleştirin.
7. Üçüncü mikrosantrifüj tüpünün kapağını kesin ve adım 6.4'e göre "kapaklar" şişesine yerleştirin. Filtre ünitesini "ünite" etiketli yeni bir 20 mL'lik sintilasyon şişesine aktarın, böylece infranatantın tüp 3'te kaldığından ve "ünite" şişesine aktarılmadığından emin olun. Filtre ünitesinin kenarlarında damlalar görülürse, boru 3'e geri koyun, kaplayın ve 10 saniye aşağı döndürün. Tüp 3'ü 20 mL'lik yeni bir cam sintilasyon şişesine yerleştirin.
8. 5 sintilasyon şişesini kapatın (tüp 1, tüp 2, tüp 3, kapaklar ve ünite). Boş bir kontrol olarak boş ve kapaklı 20 mL sintilasyon şişesi hazırlayın.
9. Bakır-64 aktivitesi için altı parıldama şişesini γ bir sayaç üzerinde ölçün. Boş flakon aktivitesini diğer flakonlarınkinden çıkarın. Denklem 2'yi kullanarak radyoetiketleme/şelasyon verimliliğini hesaplayın.
   (Denklem 2)
   NOT: Birim cpm makul olmayan bir şekilde düşükse (örn, daha düşük veya tüplere eşdeğer) veya herhangi bir okuma γ sayacı doğrusal olmayan/doygunluk eşiğinin üzerindeyse, değerler eşiğin altına düşene kadar aktivitenin bozulmasına izin vermek için sintilasyon şişelerini kurşun kaplarda 4 güne kadar saklayın ve yeniden ölçün.

7. Mikro kabarcık fizikokimyasal karakterizasyonu

NOT: Bir laboratuvar radyoaktif numune işleme için belirlenmiş ekipmana sahip olmadıkça, mikrokabarcık fizikokimyasal karakterizasyonu, radyoaktif olmayan, "soğuk" bakır şelatlı numuneler kullanılarak yapılmalıdır. Bu "soğuk" etiketleme, kişinin amaçlanan uygulaması için kullanılan mikro kabarcıkların dozunu değerlendirmek için hayati önem taşıyan mikro kabarcık veriminin değerlendirilmesini kolaylaştırır. Ek olarak, radyoetiketleme işleminin mikro kabarcıkların özelliklerini bozmamasını sağlamak için kontrol şelatsız mikro kabarcıklarla karşılaştırmaya izin verir. Bu "soğuk" etiketleme ve ilgili fizikokimyasal karakterizasyon, radyoaktif işaretli mikro kabarcık uygulamasından önce yapılmalıdır ve radyoetiketlemede değişiklik yapılması gerekiyorsa geri bildirim olarak kullanılabilir (bkz.

1. "Soğuk" bakır mikro kabarcık etiketleme
   1. Adım 4.7'de lipid süspansiyonuna eklenen ⁶⁴CuCl₂ çözeltisinin hacmini, lipid filmleri içindeki porfirin molar% bileşimini ve ⁶⁴CuCl₂ ürün sayfasında bulunan spesifik aktiviteyi kullanarak, radyoetiketleme sırasında elde edilen yaklaşık metal: porfirin molar oranını hesaplayın. Örnek hesaplamalar Ek Dosya 1'de bulunabilir.
   2. Mevcut protokolün 1-3 bölümlerini takip edin.
   3. 0.1 N HCl'de 0.1 mg·^mL-1 CuCl₂ çözeltisi hazırlayın.
   4. Bu CuCl₂ çözeltisinin uygun hacmini, adım 7.1.1'den hesaplanan lipit süspansiyonuna mikropipetleyin ve şişeyi kapatın.
   5. CuCl_2'yi lipid süspansiyonuna karıştırmak için şişeyi döndürün, üst boşluğu PFP ile doldurun, kapatın ve 4.9, 4.10 ve 4.12 adımlarına göre ısıtın. Flakon kullanımı için kauçuk forseps gerekli değildir.
   6. 1 saat sonra, şişeyi ocaktan alın ve kuruması için dışını silin. Şişenin RT'ye soğumasına izin verin.
   7. Lipid süspansiyonunu nötralize edin, karıştırın, üst boşluğu PFP ile doldurun ve adım 4.23 ve 4.24'e göre kapatın.
   8. Adım 5.1-5.3'e göre çalışan bir ürün elde etmek için mikro kabarcık süspansiyonunu ve boşaltıcıyı etkinleştirin.
2. Mikro kabarcık boyutlandırma
   NOT: Mikro kabarcık boyutlandırma, aktivasyondan hemen sonra yapılmalıdır. Çalışma süspansiyonunun stabilitesini değerlendiriyorsanız, numune hazırlamayı ve ölçümleri 30 dakikalık aralıklarla tekrarlayın. Tipik olarak, 1-2 saatlik bir pencere, mikro kabarcık çalışma süspansiyonunun aktivasyon sonrası kullanılacağı/uygulanacağı zaman dilimini temsil eder. Stabilite ölçümlerinin amacı, mikro kabarcık boyutunun ve veriminin bu zaman dilimi boyunca korunmasını sağlamaktır, böylece çalışma çözeltisinden uygulanan tüm tedaviler benzer mikro kabarcık popülasyonları içerir.
   1. Coulter Sayacını (CC) açın ve SOP Düzenle aracını kullanarak aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 30 μm açıklık, 0,6-18 μm boyut aralığı, açıklık akımı 400-600 μA, preamp kazancı 4-8, 400 bölme, her çalıştırmadan önce ve sonra yıkama, hacimsel analiz, 5 μL örnek hacmi.
   2. CC elektrolitini 0,2 μm'lik bir ortam vakum filtreleme ünitesinden süzün. Elektrolit kabını ve numune hazırlama için ayrı bir kabı doldurun.
   3. Arka plan ölçümü: 10 mL'lik tek kullanımlık bir küveti 10 mL filtrelenmiş elektrolitle doldurun ve bir temel ölçüm yapın. Sayımların 400'ün altında olduğundan emin olun. Değilse, cihazı yıkayın.
   4. Numune ölçümü
      1. Yeni bir küvete 10 mL filtrelenmiş elektrolit ekleyin. Manuel olarak ters çevirerek/geri alarak mikro kabarcık süspansiyonunu yeniden askıya alın. Şişenin alt ortasından 5 μL mikropipetleyin. Pipet ucunun kenarlarını (açıklık hariç) silin ve numuneyi doğrudan hazırlanan elektrolite daldırın.
      2. Süspansiyonu tamamen aktarmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Mikro kabarcık süspansiyonunun "tutamları" dağılana kadar elektroliti hafifçe döndürmek için pipet ucunu kullanın.
   5. Numuneyi CC üzerinde ölçün (analit başına iki çalışma).
      NOT: 5 μL'lik bir mikro kabarcık numune hacmi tipik olarak 1-5 x 10⁹ mikro kabarcık·^mL-1 konsantrasyonları içeren numuneler için uygundur. Bu numune hacminin, belirli CC cihaz kurulumuna bağlı olarak ve numune mikro kabarcık verimlerinin yukarıdaki aralığın dışında kalıp kalmadığına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
3. Konfokal görüntüleme
   NOT: Mikro kabarcık boyutlandırmasından hemen sonra ve adım 7.2'deki nota göre korunan mikro kabarcık stabilitesinin zaman çerçevesi içinde konfokal görüntüleme yapın.
   1. Mikro kabarcık süspansiyonunu yeniden askıya alın ve 1-5 μL'yi bir cam mikroskop lamının merkezine aktarın. Hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için mikro kabarcık süspansiyon damlacığının üzerine dikkatlice bir örtü kayışı yerleştirin. Süspansiyon, kapak kaymasının altına yayılacaktır.
   2. Mikro kabarcıkları yağa daldırma objektifi ile 60x büyütmede görüntüleyin. Parlak alanda ve 633 nm uyarma/640-765 nm emisyon altında görüntüler elde edin. Parlak alan ve floresan görüntülerin üst üste bindirilmesi.
      NOT: Floresan sinyali, prob homojen bir şekilde mikro kabarcık kabuğuna dahil edildiğinde tüm görünür parçacıkların kabuğu boyunca üst üste gelmelidir.
4. Spektroflorometri
   NOT: Spektroflorometri ölçümleri, mikro kabarcık aktivasyonundan sonraki 24 saat içinde gerçekleştirilebilir.
   1. Daha önce tarif edildiği gibi% 1 Triton X-100 hazırlayın³⁵.
   2. İlk ölçümden 15-30 dakika önce spektroflorometreyi açın.
   3. Bir kuvars küvette 1 nm uyarma ve 100-410 nm emisyon aralığı kullanarak %600 Triton X-800'ün floresan spektrumlarını ölçün. Sinyali referans dedektör sinyaliyle normalleştirme seçeneğini seçin (genellikle S1/R1 olarak anılır).
      NOT: Triton X-100 pipetlendiğinde kolayca köpürür. Bu nedenle, bir küvete aktarırken, yalnızca ilk mikropipet durdurucusuna daldırın.
   4. Küveti metanol ile durulayın ve numuneler arasında basınçlı hava ile kurulayın.
   5. 6 mL %1 Triton X-100'ü 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Mikro kabarcık süspansiyonunu yeniden askıya alın ve mikropipet ile 1 μL aspire edin. Pipet ucunun açıklık dışındaki kenarlarını silin ve numuneyi hazırlanan %1 Triton X-100'e aktarın, aktarımı tamamlamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Çözeltiyi girdaplayın ve bir kuvars küvete aktarın.
      NOT: Numune oranını ayarlayın:% 1 Triton X-100, cihaz hassasiyetine ve doğrusal olmayan doygunluk eşiğine göre.
   6. Bu numuneyi adım 7.4.3'teki parametreleri kullanarak ölçün. Bu ölçüm, "bozulmuş" parçacıklara karşılık gelir.
   7. PBS kullanarak 7.4.3-7.4.6 adımlarını tekrarlayın. Bu ölçüm "sağlam" parçacıklara karşılık gelir.
   8. Sırasıyla% 1 Triton X-100 ve PBS ölçümlerini kullanarak bozulmuş ve sağlam numune spektrumlarını temel olarak düzeltin.
   9. PBS (F PBS) ve %3 Triton X-1 (F_Tx) cinsinden bozulmamış numunenin entegre taban çizgisi düzeltmeli floresan sinyalini kullanarak Denklem 100 aracılığıyla su verme verimliliğini (_QE) hesaplayın:
      (Denklem 3)
5. UV-Vis spektroskopisi
   NOT: Spektroskopi ölçümleri, mikro kabarcık aktivasyonundan sonra 72 saate kadar gerçekleştirilebilir.
   1. Süspansiyon şeffaf olana kadar RT'de bir banyo sonikatörü kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde mikro kabarcık süspansiyonunun bir alikotunu sonikleştirin. Bu, spektroskopi sırasında saçılma etkilerini azaltır.
   2. İlk ölçümden 10 dakika önce spektrofotometreyi açın. 0,25 nm'lik bir tarama aralığı ve 200-800 nm'lik bir alım aralığı seçin. Satır taban çizgisi çıkarmayı etkinleştirin.
   3. Ölçümler için 1 cm yol uzunluğunda bir kuvars küvet kullanın. Küveti ölçümler arasında metanol ile durulayın ve basınçlı hava ile kurulayın.
   4. Metanolün temel bir ölçümünü elde edin.
   5. Sonikasyonlu, şeffaf mikro kabarcık süspansiyonunu girdap haline getirin ve 10-50 μL'yi 200-1000 μL metanol içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Metanol hacminin ölçüldüğünden ve temiz bir cam mikrolitre şırınga ile tüpe eklendiğinden emin olun. "Bozulmuş" bir numune elde etmek için çözeltiyi girdaplayın.
      NOT: Numune seyreltmesi, porfirin yükleme verimliliğine ve molar% bileşime bağlı olacaktır. 30 mol'lük bir piro-lipid mikro kabarcık bileşimi için 20x'lik bir seyreltme uygundur.
   6. UV-Vis spektrumunu toplayın.
   7. Metanol yerine PBS kullanarak 7.5.4 ile 7.5.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
      NOT: PBS hacimlerini ölçmek için cam mikrolitre şırınga yerine bir mikropipet kullanılabilir.

8. Protokolde yapılan değişiklikler

1. Alternatif şelatör
   1. Piro-lipidi alternatif bir lipid konjuge bakır şelatör ile değiştirerek bölüm 2'ye göre lipit filmleri hazırlayın (örneğin, 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-dietilentriamiminpentaasetik asit (amonyum tuzu), bundan böyle DTPA-lipid olarak anılacaktır). Gerekli kütle ve stok hacimlerini hesaplamak için Ek Dosya 1'i kullanın.
      NOT: Alternatif bir şelatörün çeşitli molar bileşimlerinin test edilmesi, yüksek verime sahip kararlı mikro kabarcıkların üretilemeyeceği üst sınırı belirlemek için muhtemelen gereklidir.
   2. Radyoaktif işaretli mikro kabarcıklar oluşturmak ve karakterize etmek için 3'ten 6'ya kadar olan bölümleri izleyin.
   3. "Soğuk" bakır şelatlı mikro kabarcıkları karakterize etmek için 7.1'den 7.3'e kadar olan adımları izleyin. Parçacık morfolojisini değerlendirmek için yalnızca parlak alan konfokal mikroskopi görüntü alımı gereklidir. Alternatif şelatör floresan ise, adım 7.4 ve 7.5'e ek olarak ilişkili uyarma ve emisyon dalga boyları ile konfokal mikroskopi yapın.
2. Alternatif florofor
   1. Piro-lipidi alternatif bir lipid konjuge veya ara oluşturan florofor (örn., DiI) ile değiştirerek bölüm 2'ye göre lipit filmler hazırlayın. Gerekli kütle ve stok hacimlerini hesaplamak için Ek Dosya 1'i kullanın.
      NOT: Alternatif bir floroforun çeşitli molar bileşimlerinin test edilmesi, yüksek verime sahip kararlı mikro kabarcıkların üretilemeyeceği üst sınırı belirlemek için muhtemelen gereklidir.
   2. AA-PGG yerine PGG kullanarak bölüm 3'ü takip edin.
   3. 5.1 ile 5.3 arasındaki adımları ve 7.2 ile 7.5 arasındaki adımları tamamlayın.
3. "Spiking" yaklaşımı: Önceden oluşturulmuş mikro kabarcıklı lipid süspansiyonlarının etiketlenmesi
   1. Başka hiçbir lipid bileşeni içermeyen sadece piro-lipid kullanarak, bölüm 2'ye göre bir porfirin-lipid filmi oluşturun. Piro-lipid miktarları için Ek Dosya 1'e bakın.
   2. 1 mL hidrasyon tamponu yerine 100-200 μL AA-PGG (veya radyoetiketleme gerekmiyorsa PGG) kullanarak piro-lipid filmi bölüm 3'e göre hidratlayın.
   3. Tüm piro-lipid süspansiyonunu önceden hazırlanmış bir lipid mikro kabarcık süspansiyonuna aktarın.
   4. Baş boşluğunu PFP ile doldurun, ısıtın ve süspansiyonu sonikleştirin ve 3.4 ila 3.9 arasındaki adımlara göre PFP altında kapatın. Piro-lipid süspansiyonunun önceden yapılmış lipid mikro kabarcık süspansiyonuna dağılmasını izleyin ve tamamen dağılana kadar ısı / sonikasyon döngüleri gerçekleştirin.
      NOT: Septum sızdırmaz bir ticari mikro kabarcık şişesi kullanılıyorsa, piro-lipid süspansiyonu, şişe üst boşluğunu PFP ile yeniden doldurmadan bir şırınga / iğne yoluyla şişeye verilebilir.
   5. Radyoetiketleme (aşağıdaki adım 8.3.5.1'e bakın), aktivasyon, izolasyon (aşağıdaki NOT'a bakın) ve bölüm 4 ila 7'ye göre ilgili karakterizasyonu gerçekleştirin.
      1. Alternatif bir yaklaşım, önce hidratlı piro-lipid süspansiyonunu radyo-etiketlemek, %>94 radyokimyasal saflığı izlemek, 1 N NaOH ile nötralize etmek (hacmi piro-lipid filmi hidratlamak için kullanılan AA-PGG hacmine göre değiştirmek) ve ardından radyoaktif işaretli piro-lipid süspansiyonunu, adım 8.3.3'e göre önceden hazırlanmış mikro kabarcık lipid süspansiyonuna sokmaktır.
         NOT: Bu değiştirilmiş yaklaşım, lipid hidrasyonu sırasında oluşan ancak mikro kabarcıklara dahil edilmeyen mikron altı çok katmanlı vezikülleri ortadan kaldıran bir izolasyon işlemi izlerse, yalnızca floresan veya çok modlu radyoaktif işaretli mikro kabarcıklar oluşturmak için kullanılmalıdır. Daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakın.

Sonuçlar

Radyoaktif işaretli mikro kabarcıklar üretilirken ölçülebilir temel sonuçlar, radyokimyasal saflık ve radyo-etiketleme verimliliğidir. Bu protokol, her birini karakterize etmek için sırasıyla iTLC ve doğrulanmış bir santrifüj prosedürü kullanır. Şekil 2A , konakçı lipidin toplam lipidin %1, %10 mol veya %30'lük bileşimlerde piro-lipid ile ikame edildiği ticari mikro kabarcık taklit formülasyonlarında ortalama %≥95'lik radyokimya...

Tartışmalar

Mevcut lipid mikro kabarcık radyoetiketleme protokolü, herhangi bir etiketleme sonrası saflaştırma gerektirmeden %>95 radyokimyasal saflık, %>95 şelasyon verimliliği ve mikro kabarcık fizikokimyasal özelliklerinin korunmasına ulaşır. Bu başarılar, mevcut etiketleme protokolleri için daha önce elde edilemeyen ilerlemeleri temsil etmektedir. Saflaştırma adımlarının olmaması, radyoizotopların (bu durumda bakır-64) daha hızlı kullanılmasına ve böylece radyoaktif...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
64CuCl2	Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of Radiology	N/A	Order in small volume (<10 µL) dissolved in 0.1 N HCl
Acetic acid	Any company		≥ 95% purity
Aluminum foil	Any company
Ammonium acetate	Any company		Purity: ≥ 98%
Balance - analytical	Any company		Able to measure down to 0.1 mg
Bath sonicator	Any company		Can be heated to 69 oC
CC aperture - 30 micron	Beckman Coulter	A36391	Particle diameter range: 0.6-18 um
CC electrolyte	Beckman Coulter	8546719	Isoton II diluent
CC Software	Beckman Coulter	Multisizer 4e
Centrifuge filter units (0.5 mL 30,000 MWCO) with compatible microcentrifuge tubes	MilliporeSigma	UFC503096	Amicon Ultra - 0.5 mL
Centrifuge tubes - 15 mL with caps	Any company
Chloroform	Any company		Purity: ≥ 99.8%
Coulter counter	Beckman Coulter	B43905	Multisizer 4e Coulter Counter
Cover slips	VWR	48393081	VWR micro cover glass
CuCl2	Any company		Ensure not oxidized
CuCl2
Cuvette- quarts, 1 cm path length	Any company
Cuvettes - 10 mL plastic for CC measurements	Beckman Coulter	A35471	Coulter Counter Accuvette ST
ddH2O	Any company		Can be obtained through an ultrapure water purification system
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)	Any company		Powder form
Dose calibrator	Any company		Able to read copper-64
DPPA (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (sodium salt))	Avanti Polar Lipids	830855P	Powder form
DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850355P	Powder form
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt))	Avanti Polar Lipids	880200P	Powder form
DTPA-lipid (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid (ammonium salt))	Avanti Polar Lipids	790106P	Powder form
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)	Any company
Gamma counter	Any company		Able to read copper-64
Gamma counting tube push caps	Globe Scientific	22-171-665	Flanged plug caps for 12 mm tubes
Gamma counting tubes	Sarstedt	55.1579	5 mL, 75 x 12 mm, PS
Glass beaker - 250 mL	Any company		Able to withstand temperatures up to 100 oC
Glass drying oven	Any company		Can be heated to 80 oC
Glass microliter syringes - 25, 50, 100, 1000 µL	Any company		Compatible with organic solvents
Glass scintillation vials - 20 mL	VWR	66022-081	VWR® Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Caps, With pulp foil liner
Glass vials - 0.5 dram	VWR	66011-020	VWR Vial 1/2 dram, with black phenolic screw cap and polyvinyl-faced pulp liner
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757-1L	Purity:  ≥ 99.0%
Graduated pipette/gun	Any company
Hot/stir plate			Equipped with temperature prob for automatic tempearture control
Hydrochloric acid - 0.1 N	Any company
iTLC plates	Agilent	A120B12	iTLC-SA chromatography paper
Laboratory tissues	Any company
Media vaccuum filtration unit	Any company		0.22 micron pore size, PES membrane, 500 mL funnel capacity
Methanol	Any company		Purity:  ≥ 99.8%, HPLC grade, meets ACS specifications
Microcentrifuge tubes non sterile - 1.5 mL	Any company
Microcentrifuge tubes sterile - 1.5 mL	Any company
Micropipetes - p1000, p200, p20, p10	Any company		Ensure are calibrated
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15	Superfrost Plus Microscope Slides Precleaned
Needles - 18 G			Sterile
Parafilm	Any company
PBS	Sigma Aldrich	D8537-500ML	DPBS, modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
PFP	FluoroMed	APF-N40HP	Purity:  ≥ 99.8%
PFP line	Any company		1/4 inch diameter plastic hose cut about 50 cm in length
PFP regulator	Swagelok	SS-1RF4 and SS-4HC-1-4
pH meter	Any company
pH standards 4 and 7	Any company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - non sterile	Any company
Pipette tips for p1000, p200, p10 - sterile	Any company
Plastic syringe - 1 mL	Any company		Sterile
Propylene glycol	BioShop	PRO888.500	Purity:  ≥ 99.5%
Pyro-lipid	N/A		Made in-house
Rubber tipped forceps	Any company		Mix of fine-tipped and flat/square edges recommended
Scissors	Any company
Sodium hydroxide - 1 N	Any company
Sodium hydroxide - 10 N	Any company
Spectrofluorometer	Any company		Capable of 410 nm excitation and 600-850 nm emission
Spectrofluorometry software	Horiba	FluorEssence
Spectrometer	Any company
Syringe - 1 mL	Any company		Disposible, plastic, sterile
Syringe filters - 0.2 micron pore size	Any company		Membrane material: PES or other compatible with ammonium acetate/acetic acid and PBS
Test tube - 10 mL
Triton X-100	Any company
Vacuum desicator/vacuum	Any company
Vialmix	Lantheus Medical Imaging	515030-0508	Referred to in protocol as a mechanical vial shaker
Weigh paper	Any company		To avoid losing product, cutting weigh paper into 3x3 cm squares is recommended