פיתוח מערכת פרוטופלסט כרוב לחקר סבילות להיפוקסיה בברסיקה

Summary

פרוטוקול זה מתאר מערכת פרוטופלסט יעילה של מזופיל כרוב. נבדקו טיפולים שונים למחסור בחמצן, והמערכת הראתה שפעול גבוה של גנים המגיבים להיפוקסיה, מה שאפשר מחקרים על המנגנונים הגנטיים והמולקולריים של עמידות להצפה בירקות Brassicaceae .

Abstract

ככל ששינויי האקלים מביאים גשמים כבדים יותר, כרוב, ירק מפתח של Brassicaceae , מתמודד עם הפסדי יבול משמעותיים עקב לחץ היפוקסיה הנגרם על ידי הצפות. כדי לזהות מנגנונים של עמידות להצפה בכרובים, יש צורך בפלטפורמה רב-תכליתית למחקרים פונקציונליים גנטיים כדי להתגבר על טבעם הסרבן של הכרובים. במחקר זה פותחו מערכת ביטוי חולפת של פרוטופלסט כרוב ופרוטוקול אינדוקציה מקביל של היפוקסיה פרוטופלסט. פרוטוקול זה השיג תפוקה גבוהה ושלמות של בידוד פרוטופלסטים מעלי כרוב, עם יעילות טרנספקציה העולה על 40% באמצעות תנאים אנזימטיים אופטימליים. כדי להקל על השפעה היפוקסית פוטנציאלית לפני הטיפולים, תמיסת W5 בעבעה עם גז חמצן כדי להעלות את רמות החמצן המומס. נבדקו מספר כימיקלים להתאמת רמות החמצן וטיפולים פיזיולוגיים לסילוק חמצן, כולל EC-Oxyrase, OxyFluor, נתרן סולפיט וחבילת סופגי חמצן. בדיקות לוציפראז כפול הראו כי מקדמי הגנים לתגובת נשימה אנאירובית BoADH1 ו- BoSUS1L הופעלו בפרוטופלסטים של כרוב לאחר טיפולי היפוקסיה, כאשר רמת האינדוקציה הגבוהה ביותר נצפתה לאחר הטיפול בחבילת סופג החמצן. לסיכום, מערכת הביטוי הארעית פרוטופלסט כרוב בשילוב טיפול בהיפוקסיה מדגימה פלטפורמה יעילה ונוחה. פלטפורמה זו יכולה להקל על מחקרים של תפקוד גנים ומנגנונים מולקולריים הקשורים לתגובות היפוקסיה בכרובים.

Introduction

שינויי האקלים העולמיים החריפו את השיטפונות, שהפכו לנושא קריטי יותר ויותר ברחבי העולם. בעשורים האחרונים אנו עדים למגמת עלייה בתדירות אירועי השיטפונות, וכתוצאה מכך הפסדי יבול משמעותיים ^1,2. כרוב (Brassica oleracea var. capitata L.), ירק בעל חשיבות עולמית משמעותית, רגיש להשפעות השליליות של גשמים כבדים, המחייבים פיתוח של זני כרוב עמידים לשיטפונות כדי להבטיח ייצור בר קיימא לנוכח אירועי מזג אוויר קיצוניים. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים הקשורים לעקה הצפה בכרוב חיונית כדי לעמוד באתגר זה.

כדי להבין מנגנוני ויסות גנים בצמחים בתנאים שקועים, קווים טרנסגניים נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים פונקציונליים גנטיים. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי עלויות גבוהות, טרנספורמציה עתירת זמן ותהליכי תת-תרבות, כמו גם יעילות טרנספורמציה נמוכה במינים רבים של יבולים, המחייבת פיתוח מתודולוגיות חלופיות. מערכות ביטוי ארעיות מבוססות פרוטופלסטים יושמו באופן נרחב במחקר המולקולרי של הצמח כחלופה רב-תכליתית ויעילה. מערכות אלה מאפשרות לחקור את פעילות המקדם, מסלולי איתות בתגובה לרמזים סביבתיים, אינטראקציות חלבון-חלבון או חלבון-דנ"א, ולוקליזציה תת-תאית³. הקמת מערכות ביטוי ארעיות פרוטופלסטיות דווחה לא רק בצמחי מודל ^4,5 אלא גם בגידולים חשובים מבחינה כלכלית כגון קנה סוכר⁶, ציפורן⁷, סחלבי פלאנופסיס ⁸ וחציל⁹. יתר על כן, מערכות אלה יושמו בהצלחה בצמחים עציים, כולל Camellia oleifera¹⁰ו- Populus trichocarpa¹¹. עם זאת, הפרוטוקולים ליישום מערכות פרוטופלסט לחקר ירקות עליים תחת לחץ היפוקסיה הנגרם על ידי שקיעה מוגבלים. לכן, פותח פרוטוקול משולב בעבודה זו עבור אלה המעוניינים לחקור תגובות היפוקסיה בירקות עליים באמצעות מערכת ביטוי חולפת פרוטופלסט כרוב.

כדי לבצע את תגובת ההיפוקסיה הנגרמת על ידי שקיעה ברמה התאית, מספר מתודולוגיות לניקוי חמצן שימשו במחקרים קודמים כדי לדמות סביבות היפוקסיות. אלה כוללים את השימוש EC-Oxyrase, OxyFluor, נתרן סולפיט, ושקיות צריכת חמצן. EC-Oxyrase משמש בדרך כלל לטיפול אנאירובי בשורות תאים אנושיים¹² ו Arabidopsis protoplasts¹³. OxyFluor נמצא יעיל בהפחתת הלבנה הנגרמת על ידי מיני חמצן תגובתי במהלך הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים^14,15. נתרן סולפיט שימש בטיפול אנאירובי בנמטודות¹⁶, ולאחרונה, בפרוטופלסטים של אורז, בשילוב עם טכניקות כגון מבחני כרומטין חיסוניים (ChIP)¹⁷. חבילות בולמי חמצן, המשמשות בעיקר לתרבית חיידקים אנאירובית¹⁸, הוכיחו גם יעילות בגרימת הפעלה של מקדמי ZmPORB1 בפרוטופלסטים של תירס בתנאים אנאירוביים¹⁹.

העבודה הנוכחית שואפת להקים צינור איתן לבידוד פרוטופלסטים של כרוב וביטוי ארעי. לאחר מכן, הוערכה יעילותם של טיפולים שונים להתאמת חמצן על ידי הערכת הפעילות המקדמת של גנים לתגובה אנאירובית באמצעות בדיקות לוציפראז כפולות. הפרוטוקול שפותח במחקר זה צפוי להיות בעל ערך למחקר עתידי הקשור לשקיעה או לחץ היפוקסיה במערכות Brassica .

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בשני זנים מסחריים של כרוב (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' ו-'228'. ייצוג גרפי של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצג באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת שתילי כרוב

1. זרעו זרעי כרוב 'פויודורי' ו'228' באמצעות מצע צמחי מסחרי לתוך חורים עגולים בצורת ריבוע (עומק 4.5 ס"מ x גובה 4.5 ס"מ) של מגשי תקע 48 בארות (אורך 49 ס"מ x רוחב 28 ס"מ x גובה 5 ס"מ). הטמיעו את הזרעים בעומק של כ-1 ס"מ לתוך מצע הגידול.
2. לגדל שתילי כרוב בחדר צמיחה ב 22 °C (75 °F) עם מחזור בהיר-כהה 16/8 שעות. שמור על עוצמת אור של 100 μmol ^m-2·^s-1 (צינור פלואורסצנטי לבן) במהלך שלב האור.
3. לאחר 2-3 שבועות של צמיחה, השתמשו בשתילי כרוב בשלב 2 העלים לבידוד נוסף של מזופיל פרוטופלסט.
   הערה: הגודל המוצע של שתילי כרוב הוא שלב של 2 עלים, שבו העלה האמיתי השני מורחב במלואו, אך העלה האמיתי השלישי אינו מורחב, ואורכו קצר מ-1 ס"מ (איור 2A). כדי לסנכרן את שלבי ההתפתחות של שתילי הכרוב, יש לזרוע זרעי 'פויודורי' כיומיים מוקדם יותר מזרעי '228' בשל קצב הצמיחה השונה שלהם. התאמה זו מבטיחה צמיחה ובשלות אחידה בין צמחי הכרוב בשלב הרצוי.

2. בידוד פרוטופלסטים של כרוב

1. הכינו 12.5 מ"ל של תמיסת אנזים (טבלה 1) לפני כל בידוד פרוטופלסט.
   1. חממו מראש תמיסה עם 10 mM MES (pH 5.7) ו 0.6 M של מניטול ב 55 ° C. המשיכו לחמם את התמיסה בטמפרטורה של 55°C למשך 10 דקות לאחר הוספת 1.5% צלולאז R10 ו-0.75% Macerozyme R10.
   2. לאחר שתמיסת האנזים מתקררת לטמפרטורת החדר (25°C), הוסיפו 10 mM של CaCl₂ ו-0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). סננו את תמיסת האנזים המוכנה לצלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ באמצעות מסנן מזרקים בקוטר 0.22 מיקרומטר.
      הערה: חימום מקדים של התמיסה מגביר את מסיסות האנזים ומנטרל פרוטאז. השפעות העיכול משתנות בהתאם לסוגים השונים של אנזימי צלולאז. השילוב של צלולאז R10 ומקרואנזים R10 מתאים לבידוד פרוטופלסטים של כרוב.
2. אספו את העלים האמיתיים המורחבים השניים מחמישה עד שמונה שתילי כרוב, וחתכו אותם לרצועות 0.5-1.0 מ"מ בעזרת סכין גילוח חד. העבירו מיד את רצועות העלים לתמיסת אנזים טרייה.
   הערה: בחירת עלים בריאים וייעודיים מכרוב בשלב הנכון היא קריטית. העלים האמיתיים השניים שהורחבו לאחרונה משתילי כרוב בשלב 2 העלים מספקים את יעילות בידוד הפרוטופלסטים הגבוהה ביותר. צמחים בוגרים מדי, קוטילדונים או עלים מיושנים אינם מומלצים לבידוד פרוטופלסט. חמישה עד שנים עשר עלים אמיתיים מורחבים היטב יכולים להניב בהצלחה פרוטופלסטים של כרוב ב -12.5 מ"ל של תמיסת אנזים. מספר העלים הדרוש לבידוד פרוטופלסטים תלוי בכמות הרצויה של הפרוטופלסטים הדרושים. בדרך כלל, פרוטופלסטים המתקבלים מחמישה עד שמונה עלים מספיקים להליכים ניסיוניים הבאים.
3. לאחר חדירת ואקום בחושך במשך 30 דקות (איור 2B), שמרו את רצועות עלי הכרוב שקועות בתמיסת האנזים (איור 2C) בחושך בטמפרטורת החדר למשך 4-16 שעות נוספות.
   הערה: זמן עיכול האנזים עשוי להשתנות בין זני כרוב ויש למטב אותו בהתאם לגנוטיפ הספציפי. לדוגמה, 'Fuyudori' דורש זמן עיכול ארוך יותר (16 שעות) לעומת '228' (4 שעות) בשל עלים עבים יותר של 'Fuyudori'.
4. דללו את התמיסה המכילה פרוטופלסטים בנפח שווה של תמיסת W5, המורכבת מ-2 מילימטר של MES (pH 5.7), 154 מילימול של NaCl, 125 מילימול של CaCl₂, 5 מילימול של KCl ו-5 מילימול של גלוקוז (ראו טבלה 1 להכנה), כדי לעצור את העיכול האנזימטי.
5. שחררו את מתלה הפרוטופלסט על ידי ערבול עדין או באמצעות שייקר מסלולי. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
   הערה: הפרוטופלסטים המבודדים מסוגלים לעבור דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, בעוד שפסולת צמחית לא מעוכלת נשמרת על ידי המסננת ולאחר מכן מוסרת מהמתלה. ניתן לעשות שימוש חוזר במסננות תאים ולשמור אותן באתנול 75% לאחר השטיפה, אך יש צורך לשטוף באופן מלא את מסננות התאים בתמיסת W5 כדי להסיר שאריות אתנול לפני השימוש.
6. צנטריפוגה את פתרון protoplasts עם 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בזהירות להסיר את supernatant. שטפו בעדינות את הפרוטופלסטים הכדוריים על ידי הוספת 10 מ"ל של תמיסת W5 לאורך דופן הצינור החרוטי בקצב זרימה משוער של 1 מ"ל·^s-1. צנטריפוגה את הצינור ב 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C, ולחזור על הליך כביסה זה שוב כדי להבטיח הסרה מלאה של תמיסת האנזים.
7. השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת W5 והנח אותם על קרח למשך 30 דקות. לאחר דגירה בקרח, מסירים את הסופרנאטנט על ידי פיפטה 1 מ"ל בכל פעם עד שכל הסופרנאטנט מוסר.
8. השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת MMG מקוררת לפני קרח המורכבת מ-4 מילימטר של MES (pH 5.7), 0.4 מטר של מניטול ו-15 מילימטר של MgCl₂ (ראה טבלה 1 להכנה).
9. מדוד את ריכוז הפרוטופלסט באמצעות המוציטומטר והתאם את הריכוז הסופי ל- 4 x 10⁵ protoplasts·^mL-1 באמצעות תמיסת MMG.

3. טרנספקציה פרוטופלסטים

1. מערבבים נפח כולל של 10 μL פלסמיד (5-10 מיקרוגרם) (קובץ משלים 1) עם 100 μL של פרוטופלסטים (4 x 10,⁴ פרוטופלסטים) ומניחים על קרח למשך 10 דקות.
   הערה: לטיהור פלסמיד ברמת טרנספקציה, נעשה שימוש בערכת פלסמיד זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. כ 4 x 10⁴ protoplasts משמשים בדרך כלל בבדיקת כתב לוציפראז כפול. עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר, כמות גבוהה יותר של פרוטופלסטים זמינה עבור transfection. באופן ספציפי, סביב 2 x 10⁵ protoplasts נגועים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד להציג יעילות transfection מוכח נע בין 30% ל 40%.
2. הוסף נפח שווה (110 μL) של תמיסת PEG טרייה (ראה טבלה 1 להכנה) המכילה 40% פוליאתילן גליקול 4000 (PEG4000), 0.1 M של CaCl₂ ו- 0.2 M של מניטול לתמיסת הפרוטופלסט וערבבו בעדינות.
3. יש לדגור על תערובת הפרוטופלסטים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 440 μL של תמיסת W5 כדי לסיים את התגובה.
4. צנטריפוגה את הפרוטופלסטים הנגועים ב 150 x גרם למשך 2 דקות ב 4 ° C ולהשהות מחדש את הגלולה ב 750 μL של תמיסת W5 מועשרת בחמצן. מעבירים את הפרוטופלסטים המרחפים מחדש לצלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המצופה מראש ב-1% BSA.
   הערה: תמיסת W5 המשמשת לדגירת תאים חייבת להיות מבעבעת עם חמצן באמצעות רכז חמצן (~90% חמצן) המחובר לאבן אוויר למשך 5 דקות (איור 2D). בעקבות תהליך חמצון זה, ריכוז החמצן המומס הסופי בתמיסת W5 עלה מ-7.84 מ"ג· ^L-1 ± 0.05 מ"ג· ^L-1 עד 29.18 מ"ג· ^L-1 ± 0.43 מ"ג· ^L-1, כפי שנמדד באמצעות מד חמצן מומס. נפח תמיסת W5 להשעיה של פרוטופלסט נגוע תלוי בסוג צלחת תרבית תאי הרקמה בה נעשה שימוש. עבור לוחות תרבית תאים של 12 בארות או 24 בארות, מומלץ להפחית את נפח תמיסת W5 כדי להפחית את לחץ ההיפוקסיה במהלך הדגירה בשל העומק העמוק יותר בתוך הבארות. עבור ציפוי BSA, כל באר של צלחת התרבית קיבלה 1 מ"ל של 1% תמיסת BSA, אשר הורשה לצפות את הבארות במשך 10 שניות. לאחר מכן הושלכה תמיסת BSA מכל באר, ולאחר מכן מולאו הבארות בתמיסת W5. הליך זה נועד ליצור משטח זמני שאינו נדבק באמצעות BSA, ולמעשה למנוע מהפרוטופלסטים להידבק למשטח הפלסטיק של צלחת התרבית במהלך שלבי הניסוי הבאים.

4. טיפול היפוקסיה על פרוטופלסטים כרוב

1. בצע טיפולים כימיים או פיזיים hypoxia מיד לאחר transfection protoplast.
   הערה: מומלץ להחיל טיפול בהיפוקסיה מיד לאחר טרנספקציה של פרוטופלסט. דגירה ממושכת של פרוטופלסטים עשויה להפחית את תגובת ההיפוקסיה שלאחר מכן.
   1. להיפוקסיה כימית על פרוטופלסטים של כרוב, הוסיפו OxyFluor, EC-Oxyrase ונתרן סולפיט לתמיסת W5 protoplast.
      הערה: שימוש ב-0.6 יחידות·^mL-1 EC-oxyrase, 0.6 יחידות·^mL-1 OxyFluor, ו-1 גרם^·mL-1 נתרן סולפיט ב-W5 היו התנאים שנבדקו המסוגלים לגרום למקדם BoADH1 ו-BoSUS1L (איור 3A) עם נזק נמוך לשלמות הפרוטופלסטים בשני זני הכרוב שנבדקו.
   2. להיפוקסיה הנגרמת על ידי שקית הנגרמת על ידי שקית צריכת חמצן, הניחו שתי חבילות בולמי חמצן בצנצנת אנאירובית בנפח 3.5 ליטר כדי ליצור סביבה היפוקסית.
2. קצור פרוטופלסטים שטופלו בהיפוקסיה על ידי צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הקפיאו את הפרוטופלסטים שנאספו באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו אותם במקפיא בטמפרטורה של -80°C לבדיקות הבאות.

5. בדיקת לוציפראז כפולה

1. בצע את בדיקת הכתב כפול luciferase על פי הוראות היצרן עם שינוי קל.
   1. השהה מחדש פרוטופלסטים של כרוב ב 50 μL של 1x חיץ ליזה פסיבי ומערבולת במשך 10 שניות.
   2. לדגור על פרוטופלסטים משובשים על קרח במשך 10 דקות ולאסוף את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   3. הוסף 20 μL של ליזט התא לכל באר של microplate. יש לפזר 100 μL של מגיב בדיקת לוציפראז II לבארות ולמדוד את פעילות הלוציפראז של הגחלילית באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
   4. הוסף 100 μL של מגיב הבדיקה הזמין מסחרית לכל באר ולמדוד את פעילות Renilla luciferase באמצעות קורא microplate.

תוצאות

עבודה זו פיתחה בהצלחה מערכת ביטוי ארעי המשתמשת בפרוטופלסטים של כרוב (ראו איור 1 לזרימת עבודה). פרוטופלסטים בודדו מעלי כרוב אמיתיים בני שבועיים עד שלושה שבועות בגודל מתאים (איור 2A) מזני כרוב מסחריים 'Fuyudori' ו-'228' באמצעות עיכול צלולאז/מקרוזים ?...

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד פרוטופלסטים משני זני כרוב מסחריים. יעילותה של שיטה זו מוערכת בעיקר באמצעות שני פרמטרים קריטיים של בקרת איכות: התשואה של פרוטופלסטים ברי קיימא והיעילות של טרנספקציה של פרוטופלסט. יישום פרוטוקול זה הביא לתנובה העולה על 4.00 x 10⁶ פרוטו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation