Entwicklung eines Kohl-Protoplasten-Systems zur Untersuchung der Hypoxietoleranz bei Brassica

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Kohl-Mesophyll-Protoplasten-System. Verschiedene Behandlungen mit Sauerstoffmangel wurden getestet, und das System zeigte eine hohe Aktivierung von Hypoxie-responsiven Genen, was die Untersuchung der genetischen und molekularen Mechanismen der Überflutungstoleranz bei Brassicaceae-Gemüse erleichtert.

Zusammenfassung

Da der Klimawandel mehr Starkregen mit sich bringt, ist Kohl, ein wichtiges Gemüse der Brassicaceae , aufgrund von überschwemmungsbedingtem Hypoxie-Stress mit erheblichen Ertragseinbußen konfrontiert. Um die Mechanismen der Überschwemmungstoleranz bei Kohlköpfen zu identifizieren, wird eine vielseitige Plattform für genetische funktionelle Studien benötigt, um die transformationsresistente Natur von Kohlköpfen zu überwinden. In dieser Studie wurden ein transientes Kohl-Protoplasten-Expressionssystem und ein entsprechendes Protoplasten-Hypoxie-Induktionsprotokoll entwickelt. Dieses Protokoll erreichte eine hohe Ausbeute und Integrität der Protoplastenisolierung aus Kohlblättern mit einer Transfektionseffizienz von mehr als 40 % unter optimierten enzymatischen Bedingungen. Um einen möglichen hypoxischen Einfluss vor der Behandlung zu mildern, wurde die W5-Lösung mit Sauerstoffgas gefüllt, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff zu erhöhen. Es wurden mehrere Chemikalien zur Einstellung des Sauerstoffgehalts und physiologische Sauerstofffängerbehandlungen getestet, darunter EC-Oxyrase, OxyFluor, Natriumsulfit und ein Sauerstoffabsorberpaket. Dual-Luciferase-Assays zeigten, dass die Promotoren der anaeroben Atmungsreaktionsgene BoADH1 und BoSUS1L in Kohlprotoplasten nach Hypoxiebehandlungen aktiviert wurden, wobei das höchste Induktionsniveau nach der Behandlung mit dem Sauerstoffabsorberpaket beobachtet wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das transiente Expressionssystem von Kohlprotoplasten in Kombination mit der Hypoxiebehandlung eine effiziente und bequeme Plattform darstellt. Diese Plattform kann die Untersuchung der Genfunktion und der molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit Hypoxiereaktionen bei Kohlköpfen erleichtern.

Einleitung

Der globale Klimawandel hat die Überschwemmungen verschärft, die sich weltweit zu einem immer wichtigeren Problem entwickelt haben. In den letzten Jahrzehnten ist die Häufigkeit von Überschwemmungen gestiegen, was zu erheblichen Ernteverlusten geführt hat ^1,2. Kohl (Brassica oleracea var. capitata L.), ein Gemüse von großer globaler Bedeutung, ist anfällig für die negativen Auswirkungen starker Regenfälle, was die Entwicklung von überschwemmungstoleranten Kohlsorten erforderlich macht, um eine nachhaltige Produktion angesichts extremer Wetterereignisse zu gewährleisten. Daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die mit Überflutungsstress in Kohl verbunden sind, um diese Herausforderung zu meistern.

Um die Mechanismen der Genregulation in Pflanzen unter getauchten Bedingungen zu verstehen, werden transgene Linien häufig für genetische funktionelle Studien verwendet. Dieser Ansatz wird jedoch durch hohe Kosten, zeitintensive Transformations- und Subkulturprozesse sowie geringe Transformationseffizienzen bei vielen Kulturarten eingeschränkt, was die Entwicklung alternativer Methoden erforderlich macht. Protoplasten-basierte transiente Expressionssysteme werden in der pflanzlichen Molekularforschung als vielseitige und effiziente Alternative eingesetzt. Diese Systeme erleichtern die Untersuchung der Promotoraktivität, der Signalwege als Reaktion auf Umweltreize, der Protein-Protein- oder Protein-DNA-Wechselwirkungen und der subzellulären Lokalisation³. Die Etablierung von transienten Protoplasten-Expressionssystemen wurde nicht nur in Modellpflanzen berichtet ^4,5, sondern auch in wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen wie Zuckerrohr⁶, Nelke⁷, Phalaenopsis-Orchideen ⁸ und Aubergine⁹. Darüber hinaus wurden diese Systeme erfolgreich in Gehölzen eingesetzt, darunter Camellia oleifera¹⁰und Populus trichocarpa¹¹. Die Protokolle für die Anwendung von Protoplastensystemen zur Untersuchung von Blattgemüse unter Unterwasser-induziertem Hypoxie-Stress sind jedoch begrenzt. Daher wurde in dieser Arbeit ein integriertes Protokoll für diejenigen entwickelt, die an der Untersuchung von Hypoxiereaktionen in Blattgemüse unter Verwendung eines transienten Kohl-Protoplasten-Expressionssystems interessiert sind.

Um die submergence-induzierte Hypoxie-Reaktion auf zellulärer Ebene durchzuführen, wurden in früheren Studien verschiedene Methoden zur Sauerstoffabscheidung eingesetzt, um hypoxische Umgebungen zu simulieren. Dazu gehören die Verwendung von EC-Oxyrase, OxyFluor, Natriumsulfit und sauerstoffverbrauchenden Beuteln. EC-Oxyrase wird typischerweise zur anaeroben Behandlung der humanen Zelllinien¹² und der Arabidopsis-Protoplasten ¹³ eingesetzt. Es wurde festgestellt, dass OxyFluor bei der Abschwächung von Photobleichung, die durch reaktive Sauerstoffspezies verursacht wird, während der Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen wirksam ist^14,15. Natriumsulfit wurde bei der anaeroben Behandlung von Nematoden¹⁶ und in jüngerer Zeit bei Reisprotoplasten in Verbindung mit Techniken wie Chromatin-Immunpräzipitationsassays (ChIP)¹⁷ eingesetzt. Sauerstoffabsorberpackungen, die hauptsächlich für anaerobe Bakterienkulturen¹⁸ verwendet werden, haben auch unter anaeroben Bedingungen eine Wirksamkeit bei der Induktion der Aktivierung von ZmPORB1-Promotoren in Maisprotoplasten gezeigt¹⁹.

Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, eine robuste Pipeline für die Isolierung und transiente Expression von Kohlprotoplasten zu etablieren. Anschließend wurde die Wirksamkeit verschiedener sauerstoffadjustierender Behandlungen bewertet, indem die Promotoraktivität von anaeroben Reaktionsgenen mit Hilfe von Dual-Luciferase-Assays bewertet wurde. Es wird erwartet, dass das in dieser Studie entwickelte Protokoll für zukünftige Forschungen im Zusammenhang mit Submergence oder Hypoxie-Stress in Brassica-Systemen wertvoll sein wird.

Protokoll

In dieser Studie wurden zwei kommerzielle Kohlsorten (B. oleracea var. capitata) verwendet: 'Fuyudori' und '228'. Eine grafische Darstellung des Protokoll-Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Kohlsetzlinge

1. Säen Sie Kohlsamen der Sorten 'Fuyudori' und '228' mit handelsüblichem Pflanzensubstrat in runde, quadratische Löcher (T 4,5 cm x H 4,5 cm) von 48-Well-Steckschalen (L 49 cm x B 28 cm x H 5 cm). Betten Sie die Samen ca. 1 cm tief in das Substrat ein.
2. Züchten Sie Kohlsämlinge in einem Anbauraum bei 22 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 16/8 Stunden. Halten Sie die Lichtintensität von 100 μmol ^m-2·^s-1 (weiße Leuchtstoffröhre) während der Lichtphase aufrecht.
3. Verwenden Sie nach 2-3 Wochen Wachstum Kohlsämlinge im 2-Blatt-Stadium, um die Mesophyll-Protoplasten weiter zu isolieren.
   HINWEIS: Die empfohlene Größe von Kohlsämlingen ist ein 2-Blatt-Stadium, in dem das zweite echte Blatt vollständig ausgebreitet ist, das dritte wahre Blatt jedoch nicht ausgebreitet ist und seine Länge kürzer als 1 cm ist (Abbildung 2A). Um die Entwicklungsstadien der Kohlsetzlinge zu synchronisieren, müssen 'Fuyudori'-Samen aufgrund ihrer unterschiedlichen Wachstumsraten etwa 2 Tage früher gesät werden als '228'-Samen. Diese Anpassung sorgt für ein gleichmäßiges Wachstum und eine gleichmäßige Reife der Kohlpflanzen im gewünschten Stadium.

2. Isolierung der Kohlprotoplasten

1. Bereiten Sie vor jeder Protoplastenisolierung 12,5 ml Enzymlösung (Tabelle 1) vor.
   1. Eine Lösung mit 10 mM MES (pH 5,7) und 0,6 M Mannitol auf 55 °C vorwärmen. Erwärmen Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 55 °C, nachdem Sie 1,5 % Cellulase R10 und 0,75 % Macerozym R10 hinzugefügt haben.
   2. Nachdem die Enzymlösung auf Raumtemperatur (25 °C) abgekühlt ist, fügen Sie 10 mM CaCl₂ und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) hinzu. Filter: Sterilisieren Sie die vorbereitete Enzymlösung in einer 9 cm Petrischale mit einem 0,22 μm Spritzenfilter.
      HINWEIS: Das Vorwärmen der Lösung erhöht die Löslichkeit des Enzyms und inaktiviert die Protease. Die Verdauungseffekte variieren je nach den verschiedenen Arten von Cellulade-Enzymen. Die Kombination von Cellulase R10 und Macerozyme R10 eignet sich zur Isolierung von Kohlprotoplasten.
2. Sammle die zweiten, neu expandierten Blätter von fünf bis acht Kohlsämlingen und schneide sie mit einer scharfen Rasierklinge in 0,5-1,0 mm große Streifen. Sofort die Blattstreifen in die frisch zubereitete Enzymlösung überführen.
   HINWEIS: Die Auswahl gesunder und ausgewiesener Blätter aus Kohl zum richtigen Zeitpunkt ist entscheidend. Die zweiten, neu expandierten echten Blätter von Kohlsämlingen im 2-Blatt-Stadium bieten die höchste Protoplastenisolationseffizienz. Überreife Pflanzen, Keimblätter oder gealterte Blätter werden für die Protoplastenisolierung nicht empfohlen. Fünf bis zwölf gut expandierte echte Blätter können in 12,5 ml Enzymlösung erfolgreich Kohlprotoplasten liefern. Die Anzahl der für die Protoplastenisolierung erforderlichen Blätter hängt von der gewünschten Menge an benötigten Protoplasten ab. Typischerweise reichen Protoplasten aus fünf bis acht Blättern für nachfolgende experimentelle Verfahren aus.
3. Nach einer Vakuuminfiltration von 30 min im Dunkeln (Abbildung 2B) die in die Enzymlösung (Abbildung 2C) getauchten Kohlblattstreifen weitere 4-16 h bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahren.
   HINWEIS: Die Verdauungszeit der Enzyme kann je nach Kohlsorte variieren und sollte je nach Genotyp optimiert werden. Zum Beispiel benötigt 'Fuyudori' eine längere Verdauungszeit (16 h) im Vergleich zu '228' (4 h), da die Blätter von 'Fuyudori' dicker sind.
4. Verdünnen Sie die Protoplasten-haltige Lösung mit einem gleichen Volumen W5-Lösung, die aus 2 mM MES (pH 5,7), 154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl und 5 mM Glukose besteht (siehe Tabelle 1 zur Zubereitung), um den enzymatischen Verdau zu stoppen.
5. Lösen Sie die Protoplastensuspension durch leichtes Schwenken oder mit einem Orbitalschüttler. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb in ein konisches 50 mL Röhrchen.
   HINWEIS: Die isolierten Protoplasten sind in der Lage, ein 70-μm-Zellsieb zu passieren, während unverdaute Pflanzenreste vom Sieb zurückgehalten und anschließend aus der Suspension entfernt werden. Zellsiebe können wiederverwendet und nach dem Waschen in 75 % Ethanol aufbewahrt werden, aber es ist notwendig, die Zellsiebe vor der Verwendung vollständig mit W5-Lösung zu spülen, um Ethanolreste zu entfernen.
6. Die Protoplastenlösung mit 150 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand vorsichtig entfernen. Waschen Sie die pelletierten Protoplasten vorsichtig, indem Sie 10 ml W5-Lösung entlang der Wand des konischen Rohrs mit einer ungefähren Flussrate von 1 ^ml-s-1 hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 150 x g für 2 min bei 4 °C und wiederholen Sie diesen Waschvorgang erneut, um eine vollständige Entfernung der Enzymlösung sicherzustellen.
7. Die Protoplasten in der W5-Lösung resuspendieren und 30 min auf Eis legen. Nach der Eisinkubation wird der Überstand mit einer Pipette jeweils 1 ml entfernt, bis der gesamte Überstand entfernt ist.
8. Resuspendieren Sie die Protoplasten in einer eisgekühlten MMG-Lösung, die aus 4 mM MES (pH 5,7), 0,4 M Mannitol und 15 mM MgCl₂ besteht (siehe Tabelle 1 zur Vorbereitung).
9. Messen Sie die Protoplastenkonzentration mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Endkonzentration mit MMG-Lösung auf 4 x 10⁵ Protoplasten^·mL-1 ein.

3. Transfektion von Protoplasten

1. Mischen Sie ein Gesamtvolumen von 10 μl Plasmid (5-10 μg) (Ergänzungsdatei 1) mit 100 μl Protoplasten (4 x 10⁴ Protoplasten) und legen Sie es für 10 min auf Eis.
   HINWEIS: Für die Plasmidaufreinigung in Transfektionsqualität wird ein im Handel erhältliches Plasmid-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Ungefähr 4 x 10⁴ Protoplasten werden typischerweise in einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay verwendet. Für größere Experimente steht eine höhere Menge an Protoplasten für die Transfektion zur Verfügung. Konkret weisen etwa 2 x 10⁵ Protoplasten, die mit 10 μg Plasmid transfiziert wurden, eine nachgewiesene Transfektionseffizienz von 30 % bis 40 % auf.
2. Geben Sie ein gleiches Volumen (110 μl) frisch zubereiteter PEG-Lösung (siehe Tabelle 1 zur Zubereitung) mit 40 % Polyethylenglykol 4000 (PEG4000), 0,1 M CaCl₂ und 0,2 M Mannitol in die Protoplastenlösung und mischen Sie sie vorsichtig.
3. Das Protoplastengemisch wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und dann 440 μl W5-Lösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden.
4. Die transfizierten Protoplasten werden bei 150 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert und das Pellet in 750 μl sauerstoffangereicherter W5-Lösung resuspendiert. Übertragen Sie die resuspendierten Protoplasten auf eine 6-Well-Gewebekulturplatte, die mit 1 % BSA vorbeschichtet ist.
   HINWEIS: Die für die Zellinkubation verwendete W5-Lösung muss mit einem Sauerstoffkonzentrator (~90 % Sauerstoff), der mit einem Ausströmer verbunden ist, 5 Minuten lang mit Sauerstoff gefüllt werden (Abbildung 2D). Nach diesem Sauerstoffanreicherungsprozess stieg die endgültige Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der W5-Lösung von 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 bis 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, gemessen mit einem Messgerät für gelösten Sauerstoff. Das Volumen der W5-Lösung zur Resuspension von transfizierten Protoplasten hängt von der Art der verwendeten Gewebezellkulturplatte ab. Bei 12-Well- oder 24-Well-Zellkulturplatten ist es ratsam, das Volumen der W5-Lösung zu reduzieren, um den Hypoxiestress während der Inkubation aufgrund der tieferen Tiefe in den Wells zu mildern. Für die BSA-Beschichtung erhielt jede Vertiefung der Kulturplatte 1 mL 1%ige BSA-Lösung, die die Vertiefungen 10 s lang beschichten durfte. Die BSA-Lösung wurde dann aus jeder Vertiefung verworfen und die Vertiefungen anschließend wieder mit W5-Lösung gefüllt. Ziel dieses Verfahrens war es, mit BSA eine temporäre, nicht haftende Oberfläche zu schaffen, die effektiv verhindert, dass Protoplasten in nachfolgenden Versuchsschritten an der plastischen Oberfläche der Kulturplatte haften bleiben.

4. Hypoxie-Behandlung bei Kohl-Protoplasten

1. Führen Sie unmittelbar nach der Protoplastentransfektion chemische oder physikalisch induzierte Hypoxiebehandlungen durch.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Hypoxiebehandlung unmittelbar nach der Protoplastentransfektion durchzuführen. Eine längere Inkubation von Protoplasten kann die nachfolgende Hypoxiereaktion verringern.
   1. Bei chemisch induzierter Hypoxie auf Kohlprotoplasten fügen Sie der W5-Protoplastenlösung OxyFluor, EC-Oxyrase und Natriumsulfit hinzu.
      HINWEIS: Die Verwendung von 0,6 Einheiten ^μl-1 EC-Oxyrase, 0,6 μl 1 OxyFluor und 1 μml-1 Natriumsulfit in W5 waren die getesteten Bedingungen, die in der Lage waren, BoADH1 und BoSUS1L-Promotor (Abbildung 3A) mit geringer Schädigung der Protoplastenintegrität in den beiden untersuchten Kohlsorten zu induzieren.
   2. Bei sauerstoffverbrauchender, beutelinduzierter Hypoxie geben Sie zwei Sauerstoffabsorberpackungen in ein anaerobes 3,5-Liter-Glas, um eine hypoxische Umgebung zu schaffen.
2. Hypoxie-behandelte Protoplasten werden durch Zentrifugieren bei 150 x g für 2 min bei 4 °C gewonnen. Frieren Sie die gesammelten Protoplasten mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie in einem -80 °C Gefrierschrank für nachfolgende Assays.

5. Dualer Luciferase-Assay

1. Führen Sie den Dual-Luciferase-Reporter-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen durch.
   1. Kohlprotoplasten in 50 μl 1x passivem Lysepuffer resuspendieren und 10 s lang vortexen.
   2. Inkubieren Sie zerbrochene Protoplasten 10 min lang auf Eis und sammeln Sie den Überstand nach der Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C.
   3. Geben Sie 20 μl Zelllysat in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte. Geben Sie 100 μl Luciferase-Assay-Reagenz II in die Vertiefungen und messen Sie die Luciferase-Aktivität von Glühwürmchen mit einem Mikroplatten-Reader.
   4. Geben Sie 100 μl des im Handel erhältlichen Assay-Reagenzes in jede Vertiefung und messen Sie die Renilla-Luciferase-Aktivität mit einem Mikroplatten-Reader.

Ergebnisse

In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein transientes Expressionssystem unter Verwendung von Kohlprotoplasten entwickelt (siehe Abbildung 1 für den Arbeitsablauf). Protoplasten wurden aus 2 bis 3 Wochen alten echten Kohlblättern geeigneter Größe (Abbildung 2A) von kommerziellen Kohlsorten 'Fuyudori' und '228' mittels Cellulase/Macerozym-Aufschluss und Dunkelvakuuminfiltration isoliert (Abbildung 2B,C

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine optimierte Methode zur Isolierung von Protoplasten aus zwei kommerziellen Kohlsorten dar. Die Wirksamkeit dieser Methode wird in erster Linie durch zwei kritische Qualitätskontrollparameter bewertet: die Ausbeute an lebensfähigen Protoplasten und die Effizienz der Protoplastentransfektion. Die Implementierung dieses Protokolls führte zu einer Ausbeute von mehr als 4,00 x 10⁶ Protoplasten·g⁻¹· FW von Mesophyllgewebe beider Kohlsort...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation