חקירת הפוטנציאל נגד השמנת יתר של זרעי Papaver somniferum במודל חולדה שמנה

Summary

המחקר חוקר את היעילות נגד השמנת יתר של זרעי Papaver somniferum בחולדות לבקניות הנגרמות על ידי השמנת יתר. זרעי פרג שטופים הפחיתו ביעילות את המשקל, הורידו את רמות הגלוקוז ושיפרו את פרופילי השומנים ללא רעילות. לעומת זאת, זרעים לא שטופים שינו את מדדי הדם, מה שמרמז על רעילות פוטנציאלית ועל הצורך במחקר נוסף.

Abstract

השמנת יתר היא בעיה בריאותית עולמית מרכזית, המשפיעה על כמעט 30% מהאוכלוסייה ברחבי העולם. למרות השכיחות של השמנת יתר, אין כיום נתונים זמינים על ההשפעות האנטי-השמנת והמטבוליות של Papaver somniferum. מטרת המחקר הייתה לאשר את ההשפעות האנטי-השמנת והמטבוליות של זרעי פרג (Papaver somniferum ) בחולדות שמנות הנגרמות על ידי תזונה עתירת שומן (HFD), ולהעריך את השפעתם על ירידה במשקל, פרופיל שומנים ורעילות איברים. הניסוי נערך בשני שלבים: התערבות של 4 שבועות בזרעי פרג וניסוי אינדוקציה של 6 שבועות להשמנת יתר. החולדות הופרדו לקבוצות וקיבלו זרעי פרג שטופים או לא שטופים, HFD ותרופות מרשם לירידה במשקל. הממצאים הראו כי שטיפת זרעי פרג הפחיתה משמעותית את העלייה במשקל ושיפרה את פרופילי השומנים, במיוחד הפחתת טריגליצרידים, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL). בנוסף, קבוצות שטופלו הראו ירידה ברמות הגלוקוז. עם זאת, מינונים גבוהים יותר של זרעי פרג לא שטופים גרמו ללחץ כבד צנוע, שצוין על ידי רמות גבוהות של אלנין אמינוטרנספראז (ALT) ואספרטט אמינוטרנספראז (AST) והיסטופתולוגיה של הכליות הראתה דלקת קלה, אך הפרמטרים ההמטולוגיים היו קבועים. תוצאות אלו מצביעות על כך שלזרעי פרג שטופים עשוי להיות פוטנציאל להפחית השמנת יתר ולשפר את הבריאות המטבולית ללא נזק שלילי, מה שמעיד על הצורך במחקר נוסף כדי לחקור את הפוטנציאל הטיפולי שלהם.

Introduction

השמנת יתר היא מצב רפואי המאופיין באחוז שומן גבוה מדי בגוף למרות מדד מסת גוף (BMI) של פחות מ-20 ^1,2. כאשר המערכת המבוקרת של הגוף לא מצליחה לשמור על האיזון הנכון בין חומרים מזינים ואנרגיה במערכת הוויסות של הגוף, זה גורם להצטברות עודפי שומן בגוף³. ה-BMI הוא כלי האבחון העיקרי המשמש לקביעת משקל תקין, עודף משקל והשמנת יתר. הוא משמש בדרך כלל במחקר קליני לזיהוי אנשים עם עודף משקל או השמנת יתר. מחקרים מצביעים על כך שהשמנת יתר היא מחלה בפני עצמה ולא גורם עיקרי למחלה כרונית כלשהי⁴. זה נגרם בעיקר על ידי צריכה מוגזמת של מזון המכיל קלוריות ואורח חיים יושבני⁵. מנגנוני עלייה גנטיים במשקל וחשיפה ממושכת ומוגזמת למזון עתיר אנרגיה עשויים גם הם לתרום להשמנה. השכיחות העולמית של השמנת יתר עלתה במהירות בשנים האחרונות, כאשר כ-2.1 מיליארד אנשים ברחבי העולם, או 30% מאוכלוסיית העולם, סובלים מהשמנת יתר ועודף משקל. יחס זה צפוי להגיע ל-40% עד 2030 אם המגמות הנוכחיות ימשיכו לעלות. גורמים סביבתיים כמו מערכת אקולוגית וסוגיות חברתיות משפיעים גם הם על התפתחות השמנת יתר ^6,7. השמנת יתר נקשרה למספר צורות של סרטן, כולל סרטן הרחם, השד והמעי הגס, כמו גם מחלות נלוות כגון דיסליפידמיה, סוכרת והפרעות שרירים ושלד (במיוחד דלקת מפרקים ניוונית). יתר על כן, השמנת יתר קשורה גם לגורמי סיכון לבביים, כולל היפרגליקמיה ומדד מסת גוף גבוה. הגורמים הידועים ביותר התורמים להשמנה כוללים בעיות הורמונליות ואכילה כפייתית⁸. בעוד שטיפולים מסורתיים להשמנת יתר לא נחקרו בהרחבה, הם בדרך כלל מהווים סיכונים מינימליים. מצד שני, תרופות מערביות מגיעות לעתים קרובות עם תופעות לוואי יקרות שעלולות להוות סיכונים בריאותיים משמעותיים. לכן, גישה חלופית ליצירת תרופות בטוחות ויעילות נגד השמנת יתר יכולה להיות לחקור מוצרים טבעיים נגד השמנת יתר. התקדמות המחקרים הפיטוכימיים תומכת בשימוש המסורתי בצמחי מרפא טיפוליים⁹, שעשויים לשמש כטיפול אלטרנטיבי להשמנת יתר. מספר מחקרים מדעיים הראו את יעילותן של תרופות צמחיות בטיפול בהשמנת יתר במשך מאות שנים. מחקרים קודמים הראו כי צמחי מרפא, המכילים מגוון רכיבים פרמקולוגיים, נצרכים כמזון¹⁰. היה דיון על העניין בשימוש בצמחי מרפא טבעיים כתרופות. שימוש בצמחי מרפא אלה נקשר למעט מאוד השלכות שליליות¹¹; צמחים אלה יכולים לשפר את העיכול ולהאיץ את הירידה במשקל¹². צמחי מרפא משתמשים בגישה רב-צדדית לטיפול בהשמנת יתר, הכוללת חמישה מנגנונים עיקריים: דיכוי תיאבון, גירוי תרמוגנזה ומטבוליזם של שומנים, עיכוב פעילות ליפאז בלבלב, מניעת פתוגנזה וקידום ליפוליזה¹³. יתר על כן, צמחי מרפא טבעיים מכילים לרוב תרכובות ביו-אקטיביות הפועלות כמעכבי אנזימי עיכול, ובכך מעכבות את ההידרוליזה והספיגה של פחמימות ושומנים תזונתיים¹⁴.

Papaver somniferum, הידוע בכינויו פרג האופיום או Khashkhash בתת-היבשת, הוא צמח מסורתי מוכר ברחבי העולם עם היסטוריה עשירה של שימוש. פיטוכימיקלים שונים, כולל אלקלואידים כגון מורפיום, קודאין, נוסקפין, פפברין ותביין, בודדו מאופיום¹⁵. בעוד שצמח הפרג קשור בעיקר לתכונותיו הפסיכואקטיביות ומשככות הכאבים, זרעיו מוכרים יותר ויותר בזכות היתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלהם. זרעי פרג הם מקור עשיר לחומצות שומן רב בלתי רוויות, במיוחד חומצות שומן אומגה 3, אשר נקשרו לניהול משקל¹⁶. יש לציין כי זרעי הפרג מכילים חומצה α-לינולנית, חומצת שומן אומגה 3 שהפוטנציאל שלה נגד השמנת יתר זכה לתשומת לב רבה. האיזומרים 10 ו-12 של חומצה α-לינולנית היו מעורבים באופן ספציפי בירידה במשקל. מחקרים רבים בבני אדם הראו כי תוספת של שילוב של איזומרים אלה יכולה להפחית את אחוז השומן בגוף¹⁷. המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה להעריך את ההשפעות של P. somniferum על ירידה במשקל במודל של בעלי חיים. בנוסף, המחקר נועד להעריך את השפעתו על פרופיל השומנים, פרמטרים המטולוגיים, תפקודי כליות וכבד והיסטולוגיה של רקמת השומן.

Protocol

כל ההליכים נערכו לאחר שוועדת האתיקה של אוניברסיטת לאהור פקיסטן אישרה אותם בפגישה שהתקיימה בתאריך 21-04-2021 עם מספר רישום: REG. # EPZOOL02193026

1. דיור בעלי חיים

1. מאכלסים 35 חולדות לבקניות זכרים (בני 3 שבועות) בנפרד בכלובי מעבדה סטנדרטיים. ספק גישה אד ליביטום לצ'או מכרסמים ומים לאורך כל הניסוי.
2. שמור על סביבת הוויווריום בטמפרטורה קבועה של 22 ± 1 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50% ± 10%. יישם מחזור אור-חושך של 12 שעות:12 שעות באמצעות תאורה מלאכותית.

2. קיבוץ בעלי חיים

1. בתחילת הניסוי חלקו את בעלי החיים לשתי קבוצות: שמנים ולא שמנים. ספק לקבוצה השמנה תזונה עתירת שומן בנוסף לתזונה הרגילה. האכילו את הקבוצה הלא שמנה בתזונה רגילה והשתמשו בה כקבוצת הביקורת (ביקורת שלילית) בניסוי.

3. הכנת תזונה עתירת שומן (HFD)

1. גבשו תזונה עתירת שומן (HFD) על ידי הגדלת שיעור השומנים המופקים ממקורות צמחיים ומן החי. שלב את ה-HFD עם הצ'או הסטנדרטי להכנת כדורים.
2. הגדר את תכולת השומן ב- HFD על 4 גרם לכל 30 גרם הזנה. הניחו את הכדורים בכלובי החיות למשך 24 שעות. שקלו ורשמו את כל הגלולה שנותרה לאחר 24 שעות, ולאחר מכן הסירו אותה. ספק כדורים טריים בכל יום. שמרו על משטר האכלה HFD זה למשך 6 שבועות כדי לגרום להשמנה.
3. עקוב אחר משקל הגוף של בעלי החיים ורשום כל שבוע כדי לבדוק אם הוא עולה או לא. כדי למדוד את משקל הגוף, הניחו את הצנצנת על מכונת המשקולות וכסו אותה. הוסף את החולדה בתוך הצנצנת כדי לבדוק את המשקל.
4. השלימו את אותם כדורים עם זרעי פרג במשך 4 השבועות הנותרים כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות שלהם לירידה במשקל.

4. קיבוץ בעלי חיים שמנים

1. לאחר 6 שבועות, חלקו עוד בעלי חיים שמנים לארבע קבוצות: קבוצה 1 היא קבוצת הביקורת השמנה (ביקורת חיובית), שהמשיכה לאכול מ-HFD אך לא קיבלה טיפול כלשהו. קבוצה 2 (סטנדרטית) מטופלת בתרופות זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים) לבקרת השמנת יתר. קבוצה 3 (לא שטופה) וקבוצה 4 (שטופה) מוזנות בפרג שטופים ולא שטופים, בהתאמה.

5. הכנת זרעי פרג

1. השג זרעי פרג (P. somniferum) מספק מסחרי מקומי מכיוון שהוא זמין בקלות בחנויות. יבש את הזרעים בשמש למשך מספר שעות. מחלקים את הזרעים לשתי קבוצות: לא שטופים ושטופים.
2. שוטפים את זרעי הפרג הקבוצתיים השטופים פי 7 במים מזוקקים, ולאחר מכן מייבשים בשמש. מוסיפים 500 גרם פרג לכוס של 1 ליטר, מוסיפים מים ומערבבים עם הידיים. לאחר מכן השליכו את המים וחזרו על ההליך פי 7 כדי לוודא שאתם מסירים את כל הזיהומים, האבק וחלקיקים אחרים מהזרעים. לאחר הכביסה מניחים את הזרעים באור השמש לייבוש.

6. חישוב מינון והכנת הזנה

1. קבע את המינון על סמך צריכת המזון של בעל החיים, מתוקנן ל-30 גרם לאדם. נהל זרעי פרג בריכוז של 0.5 גרם לכל 30 גרם הזנה.
2. שלבו את זרעי הפרג בהזנה על ידי ערבובם עם מים מזוקקים ליצירת גלולה. הכן את הכדורים טריים מדי יום לאורך תקופת הניסוי של 4 שבועות.

7. נתיחת חולדות ואיסוף דם

1. מהר את החולדות למשך 24 שעות. הקריבו את בעל החיים באמצעות כלורופורם ואספו את דגימות הדם והאיברים להמשך הליכים כמתואר להלן.
2. להרדים את החולדות באמצעות כלורופורם. מתן כלורופורם על ידי טכנאי מעבדה מיומן בשיעור של 1% כלורופורם בשאיפה (0.05 מ"ל/ליטר) וודא שהחולדה לפני כן מורדמת כראוי על ידי צביטה בכף הרגל של החולדה.
3. בצע דיסקציה באמצעות מכשירי קופסת ניתוח סטנדרטיים. יש לחטא סכין חדה, מספריים ומלקחיים לפני תחילת הדיסקציה. במהלך הדיסקציה יש להסיר דגימות רקמת כליות, כבד ושומן. שמור את הדגימות שנכרתו בצינורות צנטריפוגות מלאים בפורמלין.
4. אסוף דגימות דם בבקבוקונים מצופים EDTA. הוציאו 12 מ"ל דם מכל בעל חיים ולאחר מכן חלקו עוד 3 מ"ל כל אחד כדי לבדוק את תפקוד הכליות, בדיקת תפקודי כבד ופרופיל שומנים.
5. צנטריפוגה דגימות הדם שנאספו ב-1,957 x גרם למשך 5 דקות. יש להפריד את סרום הדם מהשאר כנוזל צלול או צהבהב. הפרד את הסרום וחלק אותו לצינורות מיקרו צנטריפוגות לניתוחים ביוכימיים נוספים.

8. ניתוח מדגם

1. קבע את פרופיל השומנים הכולל, כולל כולסטרול כולל, כולסטרול HDL, כולסטרול LDL, טריגליצרידים ו-VLDL, באמצעות שיטות קולורימטריות אנזימטיות סטנדרטיות¹⁸. בסס את קביעת כולסטרול HDL על הליך משקעים גוזל זמן¹⁸.
2. עקוב אחר רמות הגלוקוז בחולדות באופן קבוע במהלך כל הניסוי באמצעות מוניטור גלוקוז בדם GL-110¹⁹.

9. הערכת רעילות

1. להעריך את ההשפעה הטוקסיקולוגית של Papaver somniferum על הפרמטרים ALT, AST, ALP, TP ובילירובין באמצעות בדיקות תפקודי כבד²⁰. מדוד את רמות הקריאטינין בסרום בהתאם למתודולוגיה המתוארת ^ב-21.
2. קבע פרמטרים המטולוגיים, כולל ספירת תאי דם אדומים (RBC) ותאי דם לבנים (WBC), באמצעות המוציטומטר נויבאואר. להעריך את ריכוז ההמוגלובין בשיטת ציאנמתמוגלובין.
3. ערכו בדיקה היסטופתולוגית של דגימות הרקמה שנאספו. חתכי כתמים עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) להערכה מיקרוסקופית.

10. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש בתוכנת SPSS גרסה 16 לניתוח סטטיסטי. החל מבחן t עצמאי על נתוני החודש הראשון לניסוי השראת השמנת יתר.
2. השתמש במדידות חוזרות ANOVA עם מבחן פוסט-הוק LSD לשלב השני. השתמש ב-ANOVA חד-כיווני עם LSD כדי לנתח פרמטרים בדם להערכת רעילות
3. הגדר מובהקות סטטיסטית כ-p ≤ 0.05, כאשר p ≤ 0.001 נחשב למובהק ביותר.

תוצאות

חולדות במשקל גוף התחלתי של 40-45 גרם (שלב הגמילה) נבחרו לניסוי בן 70 יום, שחולק לשני שלבים. השלב הראשון, שנמשך 6 שבועות, כלל השראת השמנת יתר בקבוצת הניסוי על ידי השלמת הצ'או הסטנדרטי שלהם עם תזונה עתירת שומן (HFD; איור 1). בשלב של 4 שבועות לאחר מכן, החולדות ה...

Discussion

הפרוטוקול כולל את השלבים הקריטיים הבאים שיש לטפל בהם. הצעד הקריטי הראשון היה לגרום להשמנת יתר אצל בעלי החיים על ידי שימוש בתזונה עתירת שומן. הצעד השני היה לעקוב אחר בעלי חיים שנמצאים בדיאטה עתירת שומן שהם לא מפתחים סוכרת או כל מחלה אחרת עקב HFD.

לפרוטוקול יש ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood glucose monitor GL-110	Certeza	GL-110	A portable device used to measure blood glucose levels.
Centrifuge	Eppendorf	22620005	A laboratory equipment that spins samples at high speeds to separate components based on density.
EDTA-coated vials	BD Vacutainer	367861	Tubes used for collecting blood samples, preventing clotting by binding calcium ions.
Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.094	Small plastic tubes used for storing and handling small volumes of liquid.
Falcon tubes	Corning	352059	Conical tubes used for centrifugation and various laboratory applications.
Microscope	Olympus	CX23RF100	An optical instrument used for viewing small objects, typically magnified through lenses.
Neubauer hemocytometer	Hawksley	H.H1	A specialized slide used for counting cells under a microscope.
Orlistat120 mg	Windlas Biotech Ltd
Pipette tips	Eppendorf	0030 073.435	Disposable tips used with pipettes for transferring liquids accurately.
Serological pipettes	Falcon	357551	Graduated pipettes used for transferring liquids in larger volumes.
SPSS software version 16	IBM	N/A (software, not a physical product)	A statistical software package used for data analysis.
Standard laboratory cage (Super Mouse 750)	Lab Products, Inc.	10021	A cage designed to house laboratory mice, providing a controlled environment.