Indagine sul potenziale anti-obesità dei semi di Papaver somniferum in un modello di ratto obeso

Riepilogo

Lo studio indaga l'efficacia anti-obesità dei semi di Papaver somniferum nei ratti albini indotti dall'obesità. I semi di papavero lavati hanno ridotto efficacemente il peso, abbassato i livelli di glucosio e migliorato i profili lipidici senza tossicità. Al contrario, i semi non lavati hanno alterato i parametri del sangue, suggerendo una potenziale tossicità e la necessità di ulteriori ricerche.

Abstract

L'obesità è un grave problema di salute globale, che colpisce quasi il 30% della popolazione mondiale. Nonostante la prevalenza dell'obesità, attualmente non ci sono dati disponibili sugli effetti anti-obesità e metabolici del Papaver somniferum. L'obiettivo dello studio era quello di confermare gli effetti anti-obesità e metabolici dei semi di Papaver somniferum (papavero) nei ratti obesi indotti da una dieta ricca di grassi (HFD), valutando il loro impatto sulla riduzione del peso, sul profilo lipidico e sulla tossicità degli organi. L'esperimento è stato condotto in due fasi: un intervento di 4 settimane sui semi di papavero e uno studio di induzione dell'obesità di 6 settimane. I ratti sono stati separati in gruppi e hanno ricevuto semi di papavero lavati o non lavati, HFD e un farmaco da prescrizione per la perdita di peso. I risultati hanno dimostrato che il lavaggio dei semi di papavero ha ridotto significativamente l'aumento di peso e migliorato i profili lipidici, in particolare riducendo i trigliceridi, le lipoproteine a bassa densità (LDL) e le lipoproteine a bassissima densità (VLDL). Inoltre, i gruppi trattati hanno mostrato una diminuzione dei livelli di glucosio. Tuttavia, dosi più elevate di semi di papavero non lavati hanno causato un modesto stress epatico, indicato dall'aumento dei livelli di alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) e l'istopatologia renale ha mostrato una lieve infiammazione, ma i parametri ematologici erano costanti. Questi risultati suggeriscono che i semi di papavero lavati possono avere il potenziale per ridurre l'obesità e migliorare la salute metabolica senza danni negativi, indicando la necessità di ulteriori ricerche per esplorare il loro potenziale terapeutico.

Introduzione

L'obesità è una condizione medica caratterizzata da una percentuale di grasso corporeo eccessivamente elevata nonostante un indice di massa corporea (BMI) inferiore a 20 ^1,2. Quando il sistema controllato del corpo non riesce a mantenere il corretto equilibrio tra nutrienti ed energia nel sistema di regolazione del corpo, si verifica l'accumulo di grasso corporeo in eccesso depositato nel corpo³. L'IMC è il principale strumento diagnostico utilizzato per determinare lo stato di peso normale, sovrappeso e obesità. È comunemente usato nella ricerca clinica per identificare le persone con sovrappeso o obesità. La ricerca indica che l'obesità è una malattia in sé e per sé piuttosto che una delle principali cause di qualsiasi malattia cronica⁴. È causato principalmente dal consumo di alimenti eccessivamente calorici e da uno stile di vita sedentario⁵. Anche i meccanismi genetici di aumento di peso e l'esposizione prolungata ed eccessiva a cibi ad alto contenuto energetico possono contribuire all'obesità. La prevalenza globale dell'obesità è aumentata rapidamente negli ultimi anni, con circa 2,1 miliardi di persone a livello globale, ovvero il 30% della popolazione mondiale, che soffrono di obesità e sono in sovrappeso. Si prevede che questo rapporto raggiungerà il 40% entro il 2030 se le tendenze attuali continueranno a salire. Anche fattori ambientali come l'ecosistema e le questioni sociali influenzano lo sviluppo dell'obesità ^6,7. L'obesità è stata collegata a diverse forme di cancro, tra cui il cancro all'utero, al seno e al colon, nonché a comorbidità come dislipidemia, diabete e disturbi muscoloscheletrici (in particolare l'osteoartrite). Inoltre, l'obesità è anche associata a fattori di rischio cardiaco, tra cui l'iperglicemia e un alto indice di massa corporea. I fattori più noti che contribuiscono all'obesità includono problemi ormonali e alimentazione compulsiva⁸. Sebbene i trattamenti tradizionali per l'obesità non siano stati ampiamente studiati, generalmente comportano rischi minimi. D'altra parte, i farmaci occidentali hanno spesso effetti collaterali costosi che possono comportare rischi significativi per la salute. Pertanto, un approccio alternativo alla creazione di farmaci anti-obesità sicuri ed efficienti può essere quello di studiare prodotti naturali contro l'obesità. Il progresso degli studi fitochimici supporta l'uso tradizionale di erbe terapeutiche⁹, che possono essere utilizzate come terapia alternativa per l'obesità. Diverse ricerche scientifiche hanno dimostrato per secoli l'efficacia dei medicinali a base di erbe nel trattamento dell'obesità. Studi precedenti hanno dimostrato che le erbe medicinali, che contengono una varietà di componenti farmacologici, vengono consumate come alimento¹⁰. Si è discusso dell'interesse nell'impiego di erbe naturali come farmaci. L'uso di queste erbe è stato associato a pochissime conseguenze negative¹¹; Queste piante possono migliorare la digestione e accelerare la riduzione del peso¹². Le piante medicinali impiegano un approccio multiforme per affrontare l'obesità, che comprende cinque meccanismi primari: soppressione dell'appetito, stimolazione della termogenesi e del metabolismo lipidico, inibizione dell'attività della lipasi pancreatica, prevenzione della patogenesi e promozione della lipolisi¹³. Inoltre, le erbe naturali contengono spesso composti bioattivi che agiscono come inibitori degli enzimi digestivi, ostacolando così l'idrolisi e l'assorbimento dei carboidrati e dei grassi alimentari¹⁴.

Il Papaver somniferum, comunemente noto come papavero da oppio o Khashkhash nel subcontinente, è una pianta tradizionale riconosciuta a livello mondiale con una ricca storia di utilizzo. Varie sostanze fitochimiche, tra cui alcaloidi come la morfina, la codeina, la noscapina, la papaverina e la tebaina, sono state isolate dall'oppio¹⁵. Mentre la pianta del papavero è principalmente associata alle sue proprietà psicoattive e analgesiche, i suoi semi sono sempre più riconosciuti per i loro potenziali benefici per la salute. I semi di papavero sono una ricca fonte di acidi grassi polinsaturi, in particolare gli acidi grassi omega-3, che sono stati collegati alla gestione del peso¹⁶. In particolare, i semi di papavero contengono acido α-linolenico, un acido grasso omega-3 il cui potenziale anti-obesità ha suscitato notevole attenzione. Gli isomeri 10 e 12 dell'acido α-linolenico sono stati specificamente implicati nella perdita di peso. Numerosi studi sull'uomo hanno dimostrato che l'integrazione con una combinazione di questi isomeri può ridurre la percentuale di grasso corporeo¹⁷. L'obiettivo principale di questa indagine è stato quello di valutare gli effetti di P. somniferum sulla riduzione del peso in un modello animale. Inoltre, lo studio mirava a valutarne l'impatto sul profilo lipidico, sui parametri ematologici, sulla funzionalità renale ed epatica e sull'istologia del tessuto adiposo.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte dopo che il comitato etico dell'Università di Lahore Pakistan le ha approvate nella riunione tenutasi il 21-04-2021 con numero di registrazione: REG. # EPZOOL02193026

1. Stabulazione degli animali

1. Ospita 35 ratti albini Wistar maschi (3 settimane di età) individualmente in gabbie da laboratorio standard. Fornire l'accesso ad libitum al cibo e all'acqua dei roditori durante l'esperimento.
2. Mantenere l'ambiente del vivarium a una temperatura costante di 22 ± 1 °C e un'umidità relativa del 50% ± 10%. Implementa un ciclo luce-buio di 12 ore:12 ore utilizzando l'illuminazione artificiale.

2. Raggruppamento di animali

1. All'inizio dell'esperimento, dividi gli animali in 2 gruppi: obesi e non obesi. Fornire al gruppo obeso una dieta ricca di grassi in aggiunta alla dieta normale. Nutrire il gruppo non obeso con una dieta normale e usarla come gruppo di controllo (controllo negativo) nell'esperimento.

3. Preparazione di una dieta ricca di grassi (HFD)

1. Formulare una dieta ricca di grassi (HFD) aumentando la percentuale di grassi derivati da fonti sia vegetali che animali. Combina l'HFD con il chow standard per preparare i pellet.
2. Impostare il contenuto di grassi nell'HFD a 4 g per 30 g di mangime. Mettere i pellet nelle gabbie degli animali per 24 ore. Pesare e registrare l'eventuale pellet rimasto dopo 24 ore, quindi rimuoverlo. Fornire pellet freschi ogni giorno. Mantenere questo regime di alimentazione HFD per 6 settimane per indurre l'obesità.
3. Monitora il peso corporeo degli animali e registra ogni settimana per verificare se sta aumentando o meno. Per misurare il peso corporeo, metti il barattolo sulla macchina per il peso e coprilo. Aggiungi il topo all'interno del barattolo per controllare il peso.
4. Integra gli stessi pellet con semi di papavero per le restanti 4 settimane per studiare i loro potenziali effetti sulla perdita di peso.

4. Raggruppamento di animali obesi

1. Dopo 6 settimane, dividere ulteriormente gli animali obesi in quattro gruppi: il gruppo 1 è il controllo obeso (controllo positivo), che ha continuato a nutrirsi con HFD ma non ha ricevuto alcun trattamento. Il gruppo 2 (standard) viene trattato con farmaci disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali) per il controllo dell'obesità. Il gruppo 3 (non lavato) e il gruppo 4 (lavato) vengono nutriti rispettivamente con semi di papavero lavati e non lavati.

5. Preparazione dei semi di papavero

1. Ottieni semi di papavero (P. somniferum) da un fornitore commerciale locale in quanto sono facilmente disponibili nei negozi. Asciuga i semi al sole per qualche ora. Dividi i semi in due gruppi: non lavati e lavati.
2. Lavare i semi di papavero lavati 7 volte con acqua distillata, quindi asciugarli al sole. Aggiungere 500 g di semi di papavero in un bicchiere da 1 L, aggiungere l'acqua e mescolare con le mani. Quindi scartare l'acqua e ripetere la procedura 7 volte per assicurarsi di rimuovere tutte le impurità, la polvere e le altre particelle dai semi. Dopo il lavaggio, mettere i semi alla luce del sole ad asciugare.

6. Calcolo del dosaggio e preparazione del mangime

1. Determinare il dosaggio in base all'assunzione di mangime dell'animale, standardizzato a 30 g per individuo. Somministrare semi di papavero a una concentrazione di 0,5 g per 30 g di mangime.
2. Incorporare i semi di papavero nel mangime mescolandoli con acqua distillata per formare un pellet. Preparare i pellet freschi ogni giorno per tutto il periodo sperimentale di 4 settimane.

7. Dissezione di ratti e raccolta del sangue

1. Digiunare i ratti per 24 ore. Sacrificare l'animale usando il cloroformio e raccogliere i campioni di sangue e organi per ulteriori procedure come descritto di seguito.
2. Anestetizzare i ratti usando il cloroformio. Somministrare il cloroformio da un tecnico di laboratorio addestrato al ritmo dell'1% di cloroformio inalato (0,05 ml/L) e assicurarsi che il ratto prima sia adeguatamente anestetizzato pizzicando il piede del ratto.
3. Eseguire la dissezione utilizzando strumenti standard per scatole di dissezione. Disinfettare un coltello affilato, le forbici e una pinza prima di iniziare la dissezione. Durante la dissezione, prelevare campioni di rene, fegato e tessuto adiposo. Conservare i campioni asportati in provette da centrifuga riempite di formalina.
4. Raccogliere campioni di sangue in fiale rivestite di EDTA. Estrarre 12 ml di sangue da ciascun animale e quindi dividere ulteriormente 3 ml ciascuno per testare la funzionalità renale, il test di funzionalità epatica e il profilo lipidico.
5. Centrifugare i campioni di sangue raccolti a 1.957 x g per 5 minuti. Separare il siero di sangue dal resto come un liquido limpido o giallastro. Separare il siero e aliquotarlo in provette da microcentrifuga per ulteriori analisi biochimiche.

8. Analisi del campione

1. Determinare il profilo lipidico totale, inclusi colesterolo totale, colesterolo HDL, colesterolo LDL, trigliceridi e VLDL, utilizzando metodi colorimetrici enzimatici standard¹⁸. Basare la determinazione del colesterolo HDL su una lunga procedura di precipitazione¹⁸.
2. Monitorare regolarmente i livelli di glucosio nel ratto durante l'intero esperimento utilizzando un glucometro GL-110¹⁹.

9. Valutazione della tossicità

1. Valutare l'impatto tossicologico di Papaver somniferum sui parametri ALT, AST, ALP, TP e bilirubina utilizzando test di funzionalità epatica²⁰. Misurare i livelli sierici di creatinina seguendo la metodologia descritta in ²¹.
2. Determinare i parametri ematologici, tra cui la conta dei globuli rossi (RBC) e dei globuli bianchi (WBC), utilizzando un emocitometro Neubauer. Valutare la concentrazione di emoglobina utilizzando il metodo della cianometaemoglobina.
3. Condurre un esame istopatologico dei campioni di tessuto raccolti. Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina (H&E) per la valutazione microscopica.

10. Analisi statistica

1. Utilizzare il software SPSS versione 16 per l'analisi statistica. Applicare un t-test indipendente ai dati del primo mese per lo studio di induzione dell'obesità.
2. Utilizzare l'ANOVA a misure ripetute con il test post-hoc LSD per la seconda fase. Utilizzare l'ANOVA unidirezionale con LSD per analizzare i parametri ematici per la valutazione della tossicità
3. Definisci la significatività statistica come p ≤ 0,05, con p ≤ 0,001 considerato altamente significativo.

Risultati

I ratti con un peso corporeo iniziale di 40-45 g (fase di svezzamento) sono stati selezionati per l'esperimento di 70 giorni, che è stato diviso in due fasi. La prima fase, della durata di 6 settimane, ha comportato l'induzione dell'obesità nel gruppo sperimentale integrando il loro cibo standard con una dieta ricca di grassi (HFD; Figura 1). Nella successiva fase di 4 settimane, ai ratti obesi è stato somministrato Papaver somniferum...

Discussione

Il protocollo prevede i seguenti passaggi critici da gestire. Il primo passo critico è stato quello di indurre l'obesità negli animali utilizzando una dieta ricca di grassi. Il secondo passo è stato quello di monitorare gli animali che seguono una dieta ricca di grassi che non sviluppano il diabete o qualsiasi altra malattia dovuta all'HFD.

Il protocollo presenta anche le seguenti limitazioni. A causa delle restrizioni accademiche, il tempo sperimentale per...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood glucose monitor GL-110	Certeza	GL-110	A portable device used to measure blood glucose levels.
Centrifuge	Eppendorf	22620005	A laboratory equipment that spins samples at high speeds to separate components based on density.
EDTA-coated vials	BD Vacutainer	367861	Tubes used for collecting blood samples, preventing clotting by binding calcium ions.
Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.094	Small plastic tubes used for storing and handling small volumes of liquid.
Falcon tubes	Corning	352059	Conical tubes used for centrifugation and various laboratory applications.
Microscope	Olympus	CX23RF100	An optical instrument used for viewing small objects, typically magnified through lenses.
Neubauer hemocytometer	Hawksley	H.H1	A specialized slide used for counting cells under a microscope.
Orlistat120 mg	Windlas Biotech Ltd
Pipette tips	Eppendorf	0030 073.435	Disposable tips used with pipettes for transferring liquids accurately.
Serological pipettes	Falcon	357551	Graduated pipettes used for transferring liquids in larger volumes.
SPSS software version 16	IBM	N/A (software, not a physical product)	A statistical software package used for data analysis.
Standard laboratory cage (Super Mouse 750)	Lab Products, Inc.	10021	A cage designed to house laboratory mice, providing a controlled environment.