Investigando o potencial anti-obesidade de sementes de Papaver somniferum em modelo de rato obeso

Resumo

O estudo investiga a eficácia anti-obesidade das sementes de Papaver somniferum em ratos albinos induzidos pela obesidade. As sementes de papoula lavadas reduziram efetivamente o peso, diminuíram os níveis de glicose e melhoraram os perfis lipídicos sem toxicidade. Em contraste, as sementes não lavadas alteraram os parâmetros sanguíneos, sugerindo toxicidade potencial e a necessidade de mais pesquisas.

Resumo

A obesidade é um grande problema de saúde global, afetando quase 30% da população mundial. Apesar da prevalência da obesidade, atualmente não há dados disponíveis sobre os efeitos anti-obesidade e metabólicos do Papaver somniferum. O objetivo do estudo foi confirmar os efeitos anti-obesidade e metabólicos das sementes de Papaver somniferum (papoula) em ratos obesos induzidos por dieta hiperlipídica (HFD), avaliando seu impacto na redução de peso, perfil lipídico e toxicidade de órgãos. O experimento foi conduzido em duas fases: uma intervenção de semente de papoula de 4 semanas e um estudo de indução de obesidade de 6 semanas. Os ratos foram separados em grupos e receberam sementes de papoula lavadas ou não, HFD e um medicamento prescrito para perda de peso. Os resultados demonstraram que a lavagem das sementes de papoula diminuiu significativamente o ganho de peso e melhorou os perfis lipídicos, particularmente reduzindo os triglicerídeos, a lipoproteína de baixa densidade (LDL) e a lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL). Além disso, os grupos tratados apresentaram uma diminuição nos níveis de glicose. No entanto, doses mais altas de sementes de papoula não lavadas causaram estresse hepático modesto, indicado por níveis elevados de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) e a histopatologia renal mostrou inflamação leve, mas os parâmetros hematológicos foram constantes. Esses resultados sugerem que as sementes de papoula lavadas podem ter o potencial de reduzir a obesidade e melhorar a saúde metabólica sem danos adversos, indicando a necessidade de mais pesquisas para explorar seu potencial terapêutico.

Introdução

A obesidade é uma condição médica caracterizada por um percentual de gordura corporal excessivamente alto, apesar de um índice de massa corporal (IMC) inferior a 20 ^1,2. Quando o sistema controlado do corpo não consegue manter o equilíbrio adequado entre nutrientes e energia no sistema regulador do corpo, isso resulta no acúmulo de excesso de gordura corporal depositada no corpo³. O IMC é a principal ferramenta diagnóstica usada para determinar o peso normal, sobrepeso e obesidade. É comumente usado em pesquisas clínicas para identificar indivíduos com excesso de peso ou obesidade. Pesquisas indicam que a obesidade é uma doença em si, e não uma das principais causas de qualquer doença crônica⁴. É causada principalmente pelo consumo excessivo de alimentos calóricos e pelo sedentarismo⁵. Mecanismos genéticos de ganho de peso e exposição prolongada e excessiva a alimentos ricos em energia também podem contribuir para a obesidade. A prevalência global da obesidade aumentou rapidamente nos últimos anos, com cerca de 2,1 bilhões de pessoas em todo o mundo, ou 30% da população mundial, sofrendo de obesidade e excesso de peso. Prevê-se que esse índice atinja 40% até 2030 se as tendências atuais continuarem aumentando. Fatores ambientais como questões ecossistêmicas e sociais também influenciam o desenvolvimento da obesidade ^6,7. A obesidade tem sido associada a várias formas de câncer, incluindo câncer uterino, de mama e de cólon, bem como comorbidades como dislipidemia, diabetes e distúrbios musculoesqueléticos (especialmente osteoartrite). Além disso, a obesidade também está associada a fatores de risco cardíaco, incluindo hiperglicemia e alto índice de massa corporal. Os fatores mais conhecidos que contribuem para a obesidade incluem problemas hormonais e alimentação compulsiva⁸. Embora os tratamentos tradicionais para a obesidade não tenham sido extensivamente estudados, eles geralmente apresentam riscos mínimos. Por outro lado, os medicamentos ocidentais geralmente vêm com efeitos colaterais caros que podem representar riscos significativos à saúde. Portanto, uma abordagem alternativa para criar medicamentos anti-obesidade seguros e eficientes pode ser investigar produtos naturais contra a obesidade. O avanço dos estudos fitoquímicos reforça o uso tradicional de ervas terapêuticas⁹, que podem ser utilizadas como terapia alternativa para a obesidade. Várias investigações científicas mostraram a eficácia dos medicamentos fitoterápicos no tratamento da obesidade durante séculos. Estudos anteriores demonstraram que as ervas medicinais, que contêm uma variedade de componentes farmacológicos, são consumidas como alimento¹⁰. Tem havido discussão sobre o interesse em empregar ervas naturais como medicamentos. O uso dessas ervas tem sido associado a muito poucas consequências negativas¹¹; Essas plantas podem melhorar a digestão e acelerar a redução de peso¹². As plantas medicinais empregam uma abordagem multifacetada para lidar com a obesidade, abrangendo cinco mecanismos primários: supressão do apetite, estimulação da termogênese e metabolismo lipídico, inibição da atividade da lipase pancreática, prevenção da patogênese e promoção da lipólise¹³. Além disso, as ervas naturais geralmente contêm compostos bioativos que atuam como inibidores das enzimas digestivas, dificultando assim a hidrólise e a absorção de carboidratos e gorduras dietéticas¹⁴.

Papaver somniferum, comumente conhecida como papoula do ópio ou Khashkhash no subcontinente, é uma planta tradicional mundialmente reconhecida com uma rica história de uso. Vários fitoquímicos, incluindo alcalóides como morfina, codeína, noscapina, papaverina e tebaína, foram isolados do ópio¹⁵. Embora a planta da papoula esteja associada principalmente às suas propriedades psicoativas e analgésicas, suas sementes são cada vez mais reconhecidas por seus potenciais benefícios à saúde. As sementes de papoula são uma fonte rica em ácidos graxos poliinsaturados, particularmente os ácidos graxos ômega-3, que têm sido associados ao controle de peso¹⁶. Notavelmente, as sementes de papoula contêm ácido α-linolênico, um ácido graxo ômega-3 cujo potencial anti-obesidade atraiu atenção considerável. Os isômeros 10 e 12 do ácido α-linolênico foram especificamente implicados na perda de peso. Numerosos estudos em humanos demonstraram que a suplementação com uma combinação desses isômeros pode diminuir o percentual de gordura corporal¹⁷. O objetivo primário desta investigação foi avaliar os efeitos de P. somniferum na redução de peso em um modelo animal. Além disso, o estudo teve como objetivo avaliar seu impacto no perfil lipídico, parâmetros hematológicos, função renal e hepática e histologia do tecido adiposo.

Protocolo

Todos os procedimentos foram conduzidos após a aprovação do comitê de ética da Universidade de Lahore, Paquistão, na reunião realizada em 21-04-2021 com o nº de registro: REG. # EPZOOL02193026

1. Alojamento dos animais

1. Abrigar 35 ratos albinos Wistar machos (3 semanas de idade) individualmente em gaiolas de laboratório padrão. Forneça acesso ad libitum à ração e água para roedores durante todo o experimento.
2. Manter o ambiente do biotério a uma temperatura constante de 22 ± 1 °C e uma humidade relativa de 50% ± 10%. Implemente um ciclo claro-escuro de 12 h:12 h usando iluminação artificial.

2. Agrupamento de animais

1. No início do experimento, divida os animais em 2 grupos: obesos e não obesos. Forneça ao grupo obeso uma dieta rica em gordura, além da dieta normal. Alimente o grupo não obeso com uma dieta normal e use-a como grupo controle (controle negativo) no experimento.

3. Preparação de dieta rica em gordura (HFD)

1. Formular uma dieta rica em gordura (HFD) aumentando a proporção de gorduras derivadas de fontes vegetais e animais. Combine o HFD com a ração padrão para preparar pellets.
2. Defina o teor de gordura no HFD em 4 g por 30 g de ração. Coloque os pellets nas gaiolas dos animais por 24 h. Pese e registre qualquer pellet restante após 24 h e remova-o. Forneça pellets novos todos os dias. Mantenha este regime de alimentação HFD por 6 semanas para induzir a obesidade.
3. Monitore o peso corporal dos animais e registre todas as semanas para verificar se está aumentando ou não. Para medir o peso corporal, coloque o frasco na máquina de musculação e cubra-o. Adicione o rato dentro do frasco para verificar o peso.
4. Complemente os mesmos pellets com sementes de papoula pelas 4 semanas restantes para investigar seus potenciais efeitos de perda de peso.

4. Agrupamento de animais obesos

1. Após 6 semanas, divida ainda mais os animais obesos em quatro grupos: O Grupo 1 é o controle obeso (controle positivo), que continuou se alimentando de HFD, mas não recebeu nenhum tratamento. O Grupo 2 (Padrão) é tratado com medicamentos disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais) para controle da obesidade. O Grupo 3 (não lavado) e o Grupo 4 (lavado) são alimentados com sementes de papoula lavadas e não lavadas, respectivamente.

5. Preparação de sementes de papoula

1. Obtenha sementes de papoula (P. somniferum) de um fornecedor comercial local, pois está facilmente disponível nas lojas. Seque as sementes ao sol por algumas horas. Divida as sementes em dois grupos: não lavadas e lavadas.
2. Lave as sementes de papoula do grupo lavadas 7x com água destilada, seguida de secagem ao sol. Adicione 500 g de semente de papoula a um copo de 1 L, adicione água e misture com as mãos. Em seguida, descarte a água e repita o procedimento 7x para remover todas as impurezas, poeira e outras partículas das sementes. Após a lavagem, coloque as sementes ao sol para secar.

6. Cálculo da dosagem e preparação da ração

1. Determine a dosagem com base na ingestão de ração do animal, padronizada em 30 g por indivíduo. Administrar sementes de papoila a uma concentração de 0,5 g por 30 g de ração.
2. Incorpore as sementes de papoula na ração, misturando-as com água destilada para formar um pellet. Prepare os pellets frescos diariamente durante o período experimental de 4 semanas.

7. Dissecção de ratos e coleta de sangue

1. Jejue os ratos por 24 horas. Sacrifique o animal usando clorofórmio e colete amostras de sangue e órgãos para outros procedimentos, conforme descrito abaixo.
2. Anestesiar os ratos com clorofórmio. Administre clorofórmio por um técnico de laboratório treinado na taxa de clorofórmio inalado a 1% (0,05 mL / L) e certifique-se de que o rato esteja devidamente anestesiado, beliscando o pé do rato.
3. Realize a dissecção usando instrumentos de caixa de dissecação padrão. Desinfete uma faca afiada, tesoura e fórceps antes de iniciar a dissecação. Durante a dissecção, remova amostras de rim, fígado e tecido adiposo. Conservar as amostras excisadas em tubos de centrifugação cheios de formalina.
4. Colete amostras de sangue em frascos revestidos com EDTA. Extraia 12 mL de sangue de cada animal e, em seguida, divida 3 mL cada para testar a função renal, o teste de funcionamento do fígado e o perfil lipídico.
5. Centrifugue as amostras de sangue coletadas a 1.957 x g por 5 min. Separe o soro sanguíneo do resto como um líquido claro ou amarelado. Separe o soro e aliquote-o em tubos de microcentrífuga para análises bioquímicas adicionais.

8. Análise da amostra

1. Determinar o perfil lipídico total, incluindo colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol, triglicerídeos e VLDL, usando métodos enzimáticos colorimétricos padrão¹⁸. Basear a determinação do colesterol HDL em um procedimento de precipitação demorado¹⁸.
2. Monitore os níveis de glicose em ratos regularmente durante todo o experimento usando um monitor de glicose no sangue GL-110¹⁹.

9. Avaliação da toxicidade

1. Avaliar o impacto toxicológico do Papaver somniferum sobre os parâmetros ALT, AST, ALP, TP e bilirrubina por meio de testes de função hepática²⁰. Medir os níveis de creatinina sérica seguindo a metodologia descrita em ²¹.
2. Determine os parâmetros hematológicos, incluindo a contagem de glóbulos vermelhos (RBC) e glóbulos brancos (WBC), usando um hemocitômetro Neubauer. Avalie a concentração de hemoglobina usando o método da ciano-hemoglobina.
3. Realize um exame histopatológico das amostras de tecido coletadas. Cortes de coloração com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliação microscópica.

10. Análise estatística

1. Use o software SPSS versão 16 para análise estatística. Aplique um teste t independente aos dados do primeiro mês para o estudo de indução da obesidade.
2. Utilize ANOVA de medidas repetidas com teste post-hoc de LSD para a segunda fase. Empregar ANOVA unidirecional com LSD para analisar parâmetros sanguíneos para avaliação de toxicidade
3. Defina significância estatística como p ≤ 0,05, com p ≤ 0,001 considerado altamente significativo.

Resultados

Ratos com peso corporal inicial de 40-45 g (estágio de desmame) foram selecionados para o experimento de 70 dias, que foi dividido em duas fases. A primeira fase, com duração de 6 semanas, envolveu a indução da obesidade no grupo experimental, suplementando sua ração padrão com uma dieta rica em gordura (HFD; Figura 1). Na fase subsequente de 4 semanas, os ratos obesos receberam Papaver somniferum. O peso corporal foi medido...

Discussão

O protocolo tem as seguintes etapas críticas a serem atendidas. O primeiro passo crítico foi induzir a obesidade nos animais usando dieta rica em gordura. O segundo passo foi monitorar os animais que estão em dieta rica em gordura para que não desenvolvam diabetes ou qualquer outra doença devido ao HFD.

O protocolo também tem as seguintes limitações. Devido a restrições acadêmicas, o tempo experimental para estudar o efeito exato das sementes de pap...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood glucose monitor GL-110	Certeza	GL-110	A portable device used to measure blood glucose levels.
Centrifuge	Eppendorf	22620005	A laboratory equipment that spins samples at high speeds to separate components based on density.
EDTA-coated vials	BD Vacutainer	367861	Tubes used for collecting blood samples, preventing clotting by binding calcium ions.
Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 120.094	Small plastic tubes used for storing and handling small volumes of liquid.
Falcon tubes	Corning	352059	Conical tubes used for centrifugation and various laboratory applications.
Microscope	Olympus	CX23RF100	An optical instrument used for viewing small objects, typically magnified through lenses.
Neubauer hemocytometer	Hawksley	H.H1	A specialized slide used for counting cells under a microscope.
Orlistat120 mg	Windlas Biotech Ltd
Pipette tips	Eppendorf	0030 073.435	Disposable tips used with pipettes for transferring liquids accurately.
Serological pipettes	Falcon	357551	Graduated pipettes used for transferring liquids in larger volumes.
SPSS software version 16	IBM	N/A (software, not a physical product)	A statistical software package used for data analysis.
Standard laboratory cage (Super Mouse 750)	Lab Products, Inc.	10021	A cage designed to house laboratory mice, providing a controlled environment.