פרוטוקול הזרקת עצב תועה ישיר לחולדות

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להזרקה ישירה של עצב הנרתיק בחולדות, המאפשר העברת תרופות ישירות לעצב ללא סיבוכים לאחר ההזרקה. שיטה זו חלה על מחקרים נוירולוגיים פרה-קליניים הכוללים מניפולציה של מערכת העצבים האוטונומית. זה יכול לשמש להזרקת עצבים ישירה לעצבים אחרים בחולדות ובמינים אחרים, עם השינויים הנדרשים.

Abstract

יש שפע יחסי של אסטרטגיות ומתודולוגיות כדי להקל על העברת תרופות למערכת העצבים המרכזית. עם זאת, העברת תרופות ישירות למערכת העצבים ההיקפית פחות נפוצה, עם פחות פרסומים מפורטים של שיטות זמינות כדי לסייע לחוקרים. כאן, אנו מתארים שיטת הזרקה עצבית ישירה למתן תרופות למערכת העצבים ההיקפית, תוך שימוש בעצב התועה כעצב מודל. ניתן להשתמש בשיטה זו לטיפול בהפרעות במערכת העצבים האוטונומית באמצעות מיקוד של עצב הנרתיק השמאלי, אם כי ניתן להוציא שיטת הזרקה כללית זו להזרקת עצבים אחרים עם שינוי קל. שיטה זו מסבירה את כל השלבים הקריטיים הכרוכים בהליך הכרוך במיקרו-כירורגיה בחולדות בוגרות מורדמות תחת מיקרוסקופ מנתח. השימוש בצבע מעקב מתואר כדי להקל על ניטור נאמנות ההזרקה בזמן אמת. ניתנות דוגמאות של זריקות מוצלחות וכושלות. אם מבוצעים כראוי, ניתן לבצע זריקות ישירות של עצב הנרתיק בצורה בטוחה הנסבלת היטב על ידי החולדה ללא סיבוכים לאחר הלידה. לדוגמה, לאחר שהמנתחים הוכשרו בשיטה זו, שש מתוך שש חולדות הוזרקו בהצלחה ללא סיבוכים. שיטה זו של הזרקת עצבים ישירה למחקרים פרה-קליניים בחולדות מסוגלת להעביר חומרים (כולל אך לא רק ריפוי גנטי) לעצבים היקפיים.

Introduction

יישום השיטה הנכונה למתן תרופות הוא אחד הגורמים הקריטיים להשגת תוצאות טיפוליות מוצלחות. למרות שפע השיטות להעברת חומרים טיפוליים למערכת העצבים המרכזית (CNS), רק שיטות בודדות מדווחות להעברת מערכת העצבים ההיקפית (PNS) בהזרקה עצבית ישירה. הזרקה עצבית ישירה, כגון הזרקה לגרעיני השורש הגבי (DRG) בחולדות, נוסתה במחקרים פרה-קליניים להבנה טובה יותר של מנגנוני כאב, רעילות תרופות, העברת גנים ^1,2,3 ופיתוח שיטה כללית ^1,4. דיווחים נוספים על הזרקת עצב ישירה כוללים הזרקת עצב עמוד השדרה⁴, הזרקת עצב סיאטי¹ והזרקת עצב תועה בחולדות⁵ ועכברים⁶. לאחרונה הוצעה שיטה להזרקה סופרכונדריאלית להפצה טובה יותר של טיפולים לראש עצב הראייה בארנבים⁷.

DRG נחשב למיקום האידיאלי להזרקה ישירה של וקטורים טעוני טרנסגנים כגון וירוס הקשור לאדנו (AAV) בגלל התפקוד החושי של גופי התאים ב-DRG². תוארו שיטות כירורגיות ולא כירורגיות של זריקות DRG ^1,8. עם זאת, נמצאו מסקנות שנויות במחלוקת לגבי עקביות התוצאות עם השיטה הלא כירורגית של הזרקת DRG¹. שיטה כירורגית הכוללת כריתת למינקטומיה חלקית הוצעה כמוצלחת ב-100% עבור הזרקת DRG בחולדות ללא כל שינוי בתוצאות ההתנהגות³, כמו גם שיטה הכוללת אוסטאוטומיה חלקית בעכברים⁹. מספר מחקרים מדווחים על שיטות הזרקת DRG למתן תרופות, ששימשו במחקר פרה-קליני של ריפוי גנטי בחולדות ועכברים ^1,2,10. מחקרי ריפוי גנטי מבוססי וקטור הכוללים זריקות מקומיות עשויים לכלול את היתרונות הבאים: ירידה בביטוי מחוץ למטרה, הפחתת רעילות מערכתית ועומסים נגיפיים ונפחי הזרקה קטנים יותר, ירידה בסיכון לסיבוכים אימונוגניים^11,12.

שיטת הזרקה ישירה לעצב הסיאטי, העצב הארוך ביותר בגוף, נוסתה על ידי חשיפת העצב הסיאטי הימני ברמת אמצע הירך של חולדה. השיטה השתמשה בפיפטה מזכוכית משוכה המצוידת במערכת הזרקה מבוקרת מיקרו-מעבד כדי להזריק נפח כולל של 10 מיקרוליטר צבע עם קצב זרימה של 1.2 מיקרוליטר לדקה¹. ניסוי זה הראה חוסר בפיזור הצבע לרמה של DRG, וההתפלגות הייתה מוגבלת בעיקר סביב אתר ההזרקה. באופן דומה, שיטות אחרות של הזרקות עצב ישירות, כגון הזרקות עצב עמוד השדרה, נוסו עם צבע כדי להעריך את הכמות המתאימה של נפח ההזרקה ודפוס חלוקת הצבע בחולדות. 2 מיקרוליטר מוצע כאופטימלי להזרקת עצב עמוד השדרה, בעוד ש-3 מיקרוליטר צבע על ידי הזרקת DRG הראו את ההתפלגות בגרעיני השורש הגבי והגחוני בחולדות¹. נפח הזרקת DRG בעכברים דווח כאופטימלי מ-1.0 מיקרוליטר ל-1.5 מיקרוליטר בהתבסס על מתח וגודל גוף ^2,9.

שיטת הזרקת עצב תועה ישירה שימשה בחולדות⁵ ובעכברים⁶ כדי להעריך את תפקיד הפגיעה העצבית או שלמות התא בהעברת α-synuclein אנושי. שני מחקרים אלה, שנערכו על ידי אותה קבוצת חוקרים, מתארים שיטה קצרה של הזרקה ישירה של וקטורי AAV לעצב התועה השמאלי באזור צוואר הרחם. בחולדות, השיטה כללה נימי זכוכית בקוטר קצה של 60 מיקרומטר כדי להזריק וקטור של 2 מיקרוליטר בקצב זרימה של 0.5 מיקרוליטר לדקה עם מזרק המילטון של 5 מיקרוליטר. בעכברים, נפח כולל של תמיסת וקטור של 750 nL הוזרק בקצב זרימה של 160 nL/min באמצעות מחט פלדה קהה 36-G המותקנת על מזרק NanoFil¹⁰ μL 6. ניסויים אלה הראו כי הטרנסגן הועבר והתבטא באקסונים בפונס ובמוח האמצעי של החולדות והעכברים. באופן דומה, הגרעין המוטורי הגבי של עצב הנרתיק השמאלי הראה תגובה חיסונית חיובית עם טרנסגן. ראיות אלה ממחישות כי שיטת הזרקת עצב התועה הישירה עשויה להיות שיטה אמינה בריפוי גנטי שבו ההתמרה התאית מורחבת למספר מיקומים במוח, המקרינים אקסונים דרך עצב התועה. עם זאת, שיטות אלו אינן מזכירות את השימוש בצבע כלשהו כדי לעקוב אחר נאמנות ההזרקה.

כאן, מתוארת שיטה להזרקה ישירה לעצב התועה השמאלי באמצעות צבעי מעקב לא רעילים החלים במידה רבה על חוקרים במחקרים פרה-קליניים. נדונות מלכודות פוטנציאליות שעלולות לגרום לקשיים במתן תרופות והדרכים להתגבר עליהן. מצבים אלה מומחשים בתמונות כדי להראות מה גורם למשלוח לא מוצלח והדרך להפוך אותו למוצלח.

Protocol

הפרוטוקול הבא מתנהל בהתאם להנחיות האתיקה המוסדיות ואישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. הכנת דיור

הערה: פרוטוקול זה מיועד לחולדות בוגרות בנות חודשיים לפחות. בעלי חיים קטנים יותר (כולל עכברים וחולדות צעירות יותר) אפשריים אך אינם מומלצים ויהיו קשים הרבה יותר.

1. יש לספק צ'או לח או כל מזון רך אחר (ג'ל התאוששות וטרינרי) במשך 48 שעות לפני ניתוח עצב התועה. מכיוון שבעלי חיים עשויים להיתקל בקשיים באכילה לאחר ההליך, הציגו פריטים אלה לבעלי החיים לפני הניתוח כדי לעזור להם להכיר את הטעם של פריטים אלה ולעורר מוטיבציה לאכילה.
2. חולדות בית בנפרד בכלוב לפחות שבוע לפני הניתוח, כמו גם שבוע לאחר הניתוח. זה יאפשר להם להתאקלם ללחץ של להיות לבד ולמנוע גירוד של פצעים לאחר ניתוח על ידי חבר לשגרה.

2. הכנת הפריטים והחלל הכירורגיים

1. ערכו רשימה של כל הפריטים הדרושים מבעוד מועד ובדקו שוב שכל הפריטים זמינים לניתוח.
2. עקר את כל הפריטים בשיטות עיקור מתאימות לפני הניתוח.
3. הגדר את חלל הניתוח הסטרילי מתחת למיקרוסקופ הניתוח. הנח כרית חימום מתחת למיקרוסקופ כדי לשמור על חום החולדה במהלך הניתוח.
4. הניחו את כל חומרי הניתוח על שולחן כירורגי על וילון סטרילי. שמור מספיק מקום לניתוח תחת המיקרוסקופ המנתח. ודא שמיקוד המיקרוסקופ אופטימלי ומקיף את אזור הניתוח כדי לדמיין את העצב.
5. הנח את משאבת המזרק קרוב לשלב הכירורגי כך שאורך הצינור יספיק כדי להגיע למקום ההזרקה.
6. הנח את כלי הניתוח לכיוון הצד של היד הדומיננטית של המנתח.

3. הכנת תערובת של התרופה המועמדת וצבע המעקב

1. ודא שהתרופה המועמדת מדוללת כדי להשיג את הריכוז הנדרש בדילול המומלץ כך ש-5 מיקרוליטר של התרופה מעורבבת בצבע נותנים את הכמות הנדרשת של התרופה המועמדת למסירה. נפח הזרקה מקסימלי בשיטת עצב הנרתיק הישיר מומלץ להיות 5 מיקרוליטר (כולל צבע מעקב, ראה שלב 3.2).
2. מערבבים צבע תואם עם התרופה המועמדת כדי לאפשר מעקב אחר נאמנות ההזרקה בזמן אמת. לדוגמה, ריכוז סופי של 1% Luxol Fast Blue או 0.002% פלואורסצאין הם צבעים תואמים לשימוש.
   זהירות: השתמש בצבע בריכוז האופטימלי שלו בתערובת הצבע והתרופה המועמדת כאשר ריכוז הצבע בתערובת נמוך מדי, ייתכן שלא ניתן יהיה לעקוב אחר ההזרקה. כאשר ריכוז הצבע גבוה מדי, זה עלול לגרום לתערובת סמיכה מדי ובעלת צמיגות גבוהה, שתחסום את מחט ההזרקה.

4. טעינת התרופה המועמדת ותערובת הצבע לתוך הצינור

1. חבר מזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר כשהבוכנה הוסרה למחט של 27 גרם.
2. חבר קצה אחד של כ-45 ס"מ של צינורות פוליאתילן מעוקרים למחט 27 גרם.
3. קח מזרק פלסטיק של 3 מ"ל והתאם אותו עם מחט של 27 גרם. טען את המזרק בכ-0.5 מ"ל של 0.9% מי מלח רגילים.
4. מלאו את צינור הפוליאתן במי מלח רגילים של 0.9% מהקצה הפתוח כדי למלא את כל אורך הצינור ואת כל הקנה של מזרק הזכוכית עד שהוא עולה על גדותיו.
   הערה: חשוב להימנע מבועות אוויר להילכד בתוך הצינור.
5. הסר והשליך את המזרק והמחט בנפח 3 מ"ל.
6. הכנס את בוכנת המזרק לתוך הקנה של מזרק הזכוכית ודחף אותה מעט קדימה עד לאמצע הקנה.
7. הנח את מזרק הזכוכית במשאבת המזרק.
8. משוך את הבוכנה מעט לאחור באמצעות משאבת המזרק כדי ליצור מרווח אוויר של כ-1.5 ס"מ בקצה הפתוח באורך הצינור.
9. פיפטה לפחות 5 מיקרוליטר של צבע ותרופות מועמדות עם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר וזרוק אותה על פיסת פרפילם מעוקרת.
10. משוך את תערובת התרופה המועמדת לתוך הצינור על ידי משיכת הבוכנה לאחור דרך משאבת המזרק. שמור על בועת האוויר בין תמיסת המלח של 0.9% לתמיסת ההזרקה, אך אחרת, הימנע מלכידת בועות אוויר בתוך תמיסת ההזרקה. סמן את רמת תערובת ההזרקה בצינור בעזרת טוש.
    הערה: פער האוויר בין תערובת התרופה-צבע המועמדת לבין מי המלח הסטריליים בתוך הצינור הוא קריטי למניעת ערבוב של שתי התמיסות.
11. התקן את מחט ה-35 גרם עם הצינור. קבע את המחט על המשטח הנקי של שלב הניתוח בעזרת סרט כך שהמחט לא תהיה רופפת, לא תזוז ותיגע בשום דבר אחר ותישאר מעוקרת.

5. תחול של מחט ההזרקה

1. הגדר את תוכנית משאבת המזרק להוציא 0.5 מיקרוליטר לדקה.
2. הפעל את משאבת המזרק למשך כ-10-15 שניות, עד שתמיסת ההזרקה מתחילה לצאת מקצה המחט. כמות זעירה של התערובת בקצה המחט ללא דליפה במפרק הצינור ומחט ההזרקה (או בכל מקום אחר לאורך המזרק, הצינור או המחט) מעידה על כך שההתקנה נכונה.
   הערה: אם לא רואים טיפה זעירה בקצה המחט, זה מעיד על חסימה של המחט. חסימת מחט עלולה להתרחש עקב הצמיגות הגבוהה של תערובת התרופה והצבע המועמדים, עודף אוויר הכלוא בתוך המערכת, ומזרק הזכוכית אינו יושב כראוי בתוך משאבת המזרק. ראה איור 1 לדוגמא של דליפה בצומת בין המחט לצינור. תחול הוא קריטי מכיוון שהוא עוזר לזהות אם המחט אינה חסומה והזריקה בתוך העצב תעבור בצורה חלקה.

6. הכנת חולדה לניתוח

1. השג את משקל הגוף של החולדה כדי לחשב את המינון הדרוש של משככי כאבים. לדוגמה, קרפרופן משמש במינון של 5 מ"ג/ק"ג תת עורי בחולדות.
   הערה: מומלץ לאחסן קרפרופן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני ההזרקה.
2. הרדמו את החולדה בעזרת מכשיר אידוי איזופלורן באמצעות קצב זרימה של 3%-4% לאינדוקציה של הרדמה למשך כ-2-3 דקות. הפחת את קצב זרימת האיזופלורן לכ-1.75%-2% לשמירה על ההרדמה.
3. העבירו את החולדה לשולחן נפרד עם מערך להסרת שיער והכנת האתר. ודא ששולחן זה קרוב לחלל הניתוח.
4. מרחו משחת דמעה מלאכותית בשתי עיני החולדה כדי למנוע יובש יתר.
5. יש לתת משככי כאבים לפי הפרוטוקול המוסדי המאושר לבעלי חיים כדי לשלוט בכאב כאשר החולדה חוזרת להכרה.
6. לגלח את אזור הניתוח בעזרת קוצץ שיער בצד הגחון של הצוואר באזור צוואר הרחם. גלח עד כ-2 ס"מ מרחק מאונך מקו האמצע משני הצדדים מהסנטר ועד עצם החזה.
7. יש לעקר את האזור עם 70% אלכוהול אתילי ו-10% בטדין, ולנגב את האזור שלוש פעמים לסירוגין עם ספוגית אלכוהול ופובידון יוד. נגב ממרכז האזור כלפי חוץ בתבנית מעגלית.
8. העבירו את החולדה לשלב הכירורגי מתחת למיקרוסקופ במצב שכיבה. התאם את מיקוד המיקרוסקופ כדי לדמיין את אזור הניתוח באזור צוואר הרחם.

7. ביצוע ניתוח חולדות להזרקת התרופה המועמדת ישירות לעצב התועה השמאלי (איור 2, איור 3 ואיור 4)

הערה: חלק זה של השיטה ידרוש אדם שני שיסייע למנתח.

1. הנח את החולדה על כרית חימום במצב שכיבה מתחת למיקרוסקופ הניתוח הקשור לאור רכוב.
2. חברו את שיני הלסת העליונה הקדמית של החולדה עם חתיכת תפר שאינו נספג וקבעו את הקצה הפתוח של התפר בתוך חרוט האף כך שהנחיר של החולדה יהיה תמיד בתוך חרוט האף במהלך ההרדמה.
3. מקם את החולדה כך שראשה מונח בצד שמאל של המנתח הימני (או בצד ימין של מנתח שמאלי). במצב זה, הצד הקדמי של המנתח מאונך לגוף החולדה. הניחו כרית של מד מעוקר מתחת לצוואר והתאימו את זווית אזור צוואר הרחם של החולדה כך שאזור צוואר הרחם יהפוך ישר. זה יקל על איתור עצב הנרתיק השמאלי וביצוע ההזרקה.
4. עטפו את כל גוף החולדה בווילון מעוקר, תוך שמירה על חלל הניתוח פתוח.
5. תקן ארבעה פיני מפסק בנפרד עם 4 מקבעים מגנטיים עם אלסטומרים והנח את המקבעים בארבע פינות השלב הכירורגי.
6. יש להזריק חומרי הרדמה מקומיים אפידרמיס בקו האמצע של אזור צוואר הרחם בו מתבצע החתך. לדוגמה, בדרך כלל משתמשים בתערובת של לידוקאין ובופיבקאין.
7. בצע חתך עור אורכי באורך של כ-2 ס"מ בקו האמצע בין הסנטר לעצם החזה עם להב אזמל בצד הגחון של הצוואר באזור צוואר הרחם (איור 3A).
8. הפרד את הקצוות החתוכים של העור בעזרת קצות כותנה מעוקרים.
9. משוך את קצוות העור בכיוונים מנוגדים ממקום החתך בעזרת קצות מפרק.
10. הפרד את החזית בעזרת קצות כותנה כדי להעמיק. דחוף את בלוטות הרוק לכיוון הצד הרוחבי.
11. הפרד את שרירי הסטרנומסטואיד בקצות כותנה ומשוך אותם הצידה בעזרת הסיכות. כאשר הפרדת השרירים הסטרנומסטואידים מתקדמת לרווחה, קנה הנשימה מופיע באמצע, מכוסה בשריר סטרנוהיואיד (איור 3B).
    הערה: היזהר לא להפעיל לחץ על קנה הנשימה.
12. קדם את הפרדת הרקמות בצד שמאל של קנה הנשימה של החולדה עד להופעת מעטפת הצוואר, המכילה את עורק הצוואר המשותף העובר יחד עם עצב הנרתיק השמאלי.
13. צרו בזהירות חור נקודתי קטן במעטפת הצוואר בעזרת מלקחיים עדינים, שימו לב כדי לא לפגוע בעורק הצוואר מתחת למיקרוסקופ. הפרד את עצב הנרתיק השמאלי מעורק הצוואר המשותף בעזרת מלקחיים עדינים.
    הערה: אזור הניתוח הוא קריטי מבחינה אנטומית. דופן עורק הצוואר עבה, חלקלק ואינו נפצע בקלות, אך הקצה החד של מלקחיים עדינים עלול לפצוע אותו, ועלול להתרחש דימום. יחד עם זאת, שימו לב כדי לא לפגוע בעצב.
14. לאחר שהעצב מופרד מהעורק על ידי המלקחיים, השתמש במחט מעוקלת של 25 גרם המותקנת למזרק של 1 מ"ל מהחור הזה כדי "לחבר" ולהחזיק את העצב ביד הלא דומיננטית (איור 4A).
    הערה: קצה המחט המעוקלת נעשה קהה כדי לא לפגוע בעצב ובעורק. זווית העקמומיות של קצה המחט נעשית בהתאמה אישית לכ-90 מעלות באמצעות המוסטט (איור 2).
15. עם היד הדומיננטית, החזק את המחט העמוסה בתערובת התרופה-צבע המועמדת ודקר בעדינות את העצב באותו כיוון שהעצב עובר כך שהשיפוע של המחט פונה כלפי מעלה.
    1. לדקירה קלה, שמור על העצב ישר על ידי משיכה עדינה באמצעות וו 25 G. הכנס את המחט לעצב והתקדם קדימה, יותר מ-0.5 ס"מ, תוך שמירה על המחט מקבילה לעצב הנרתיק. לאחר מכן, משוך מעט לאחור כך שתישאר מחט של 0.4-0.5 ס"מ בתוך העצב.
       הערה: זווית המחט צריכה להיות רדודה מספיק כדי לחדור לתוך העצב מבלי לעבור לצד השני.
16. ייתכנו מקרים שבהם המחט אינה חסומה מחוץ לעצב בזמן ההתחלה, אך תערובת התרופה-צבע המועמדת אינה עוברת בצורה חלקה בתוך העצב. כדי להימנע ממצב זה, הגבל את מספר דקירות העצבים במחט אחת לא יותר משלוש פעמים. אם המחט מתקהה, הסיכוי לחסימה או הזרקה לקויה אחרת יגדל.
17. ודא שהמחט נמצאת לגמרי בתוך העצב. שמור על המיקום ללא תנועה והפעל את משאבת המזרק.
    הערה: בדוק היטב במקום ההזרקה כדי לראות שתערובת התרופה-צבע המועמדת אינה זורמת חזרה מהעצב.
18. בזמן שההזרקה מתקדמת, יש לבחון כל הזמן שהעירוי נשאר בתוך העצב וזורם בצורה חלקה. השתמש בסימן שנעשה על צינור העירוי כדי לעקוב אחר תנועת תערובת התרופה-צבע מנקודת ההתחלה.
    1. אם תערובת התרופה-צבע המועמדת אינה זורמת בצורה חלקה, משוך את המחט החוצה וחזור על שלב ההתחלה (שלב 5.2). לאחר מכן הכנס מחדש את המחט לעצב והמשך את העירוי.
19. העצב מתחיל לפתח את צבע הצבע (איור 4B). המשך בעירוי ב-0.5 מיקרוליטר לדקה למשך 10 דקות כדי להחדיר את כל 5 המיקרוליטר של תערובת התרופה-צבע המועמדת
    הערה: מומלץ להשקות את הרקמות החשופות בכמות קטנה של מי מלח סטריליים חמים 0.9% לפי הצורך כדי למנוע יובש ונזק מוגזם.
20. לאחר החדרת 5 מיקרוליטר ומשאבת המזרק נעצרה, שמור את המחט במקומה למשך דקה נוספת כדי לאפשר לכל תערובת התרופה-צבע המועמדת להתפשט מאתר ההזרקה. הסר את המחט.
21. הסר את המחט המעוקלת 25 גרם. השתמשו בקצוות כותנה סטריליים כדי להחזיר בעדינות את הרקמות למקומן המקורי. הסר את קצות הנסיגה.
22. סגור את הפצע בתפר שאינו נספג (ניתן להשתמש גם בתפר נספג). מרחו כמות זעירה של דבק רקמות בין התפרים במידת הצורך כדי לסגור את הפצע בצורה מושלמת.

8. טיפול לאחר ניתוח בחולדה

1. יש להחדיר כ-3 מ"ל של 0.9% מי מלח חמים תת עורית לאחר סגירת הפצע. זה עוזר לחולדות להתייבש באופן מיידי.
2. הנח את החולדה במקור חום עד שהיא מתאוששת לחלוטין מההרדמה למצב רגיל. שימו לב לכל דבר שנצפה שהוא חריג במהלך תהליך ההחלמה.
   הערה: משך ההחלמה עשוי להיות ארוך יותר אם הליך הזרקת העצבים לוקח זמן רב.
3. העבירו את החולדה לכלוב הביתי שלה עם צ'או לח על רצפת הכלוב. ודא שיש מים זמינים כל הזמן. התבונן בחולדה לאחר הניתוח במשך כשעתיים כדי לוודא שהחולדה לא מרגישה קר.
   הערה: הניחו את החולדה במקור חום למשך שעות נוספות אם היא מרגישה קרה.
4. עקוב אחר החולדה ב-12 שעות, 24 שעות, 36 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר הניתוח עם הערות כתובות של תצפיות. משככי כאבים חוזרים בהתאם לפרוטוקול המוסדי המאושר לבעלי חיים כדי לשלוט בכאב. לדוגמה, קרפרופן במינון של 5 מ"ג/ק"ג תת עורי פעמיים במרווח של 24 שעות. התייעץ עם וטרינר אם הכאב נשאר בחולדה במשך יותר מ-48 שעות.
5. חזור על ההזרקה התת עורית של כ-3 מ"ל 0.9% מי מלח חמים תוך 24 שעות בהתאם לתנאי החולדה.
6. המשך להעריך את הפצע. ודא שהפצע יבש ונמצא בתהליך ריפוי.
   הערה: אדמומיות, נפיחות ומצב כואב של הפצע עם חוסר פעילות וקהות של החולדה יכולים להוות אינדיקציה לדלקת בפצע ועשויים להצדיק התייעצות וטרינרית נוספת. חולדה עם כאב תראה גב כפוף, פרווה פרועה ועיניים אדומות ומצב לא פעיל. הוא נמצא בדרך כלל בפינת הכלוב.
7. הסר את התפרים שאינם נספגים תוך שבועיים לאחר ריפוי הפצע.

תוצאות

במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-6 חולדות בוגרות (3 זכרים ו-3 נקבות). מתוך שש, חולדה אחת הוזרקה מספר פעמים כדי להדגים מצב של כישלון בהזרקה המראה דיפוזיה של צבע סביב אתר ההזרקה איור 5A. כל החולדות האחרות הראו הזרקה חלקה וצביעה עצבית, כפי שמוצג

Discussion

השיטה להזרקה ישירה לעצב הנרתיק השמאלי יכולה להיעשות בבטחה וללא סיבוכים לאחר הניתוח בחולדות. ניתן להשתמש בהעברת תרופות לעצב הנרתיק כדי למקד את מערכת העצבים האוטונומית (ANS). זה כרוך בשלבים קריטיים מסוימים הדורשים תרגול ורמה בינונית עד גבוהה של מיומנות כירורגית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Tuberculin Syringe with Detachable 25 G x 5/8". Needle	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Used to connect with curved needle to pull the vagus nerve and hold it at the time of injection.
0.5% Bupivacaine Hydrochloride Injection	Hospira	NDC 0409-1162-19	Local anesthetics used to anesthetize local tissue.
100 mL 0.9% Sodium Chloride Irrigation USP	Stericare Solutions	Item #6240	Normal saline, used to rehydrate rat and tissue.
20 Blunt, Retractor Tips, 7.5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Used to pull apart and hold tissues at the time of surgery.
3 mL BD-Luer-Lok Syringe, Sterile, Single Use	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Used to inject saline in rat and fill the saline into the Polythene tubing.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Fluorescein dye visible within the nerve. Used to track injection fidelity.
Animal Weighing Scale	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Used to measure body weight of rat.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF Surgical Gloves	Ansell	ASTM D3577	Sterilie glove, it is used at the time of surgery by a surgeon.
Artificial Tears Ointment 3.5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Used in eyses to prevent excessive dryness of eyes.
Baby-Myxter Hemostat	Fine Science Tools	13013-14	Used to stop bleeding in case of emergency. Also used to bend the 25 G x 5/8" in needle.
BD Intramedic PE Tubing	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Used in the injection set up system to connect with Hamilton needle and NanoFil Needles. It also holds the injection mixture.
BD Precison Glide Needle, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Used to inject saline in rat, and to make a curved needle.
BD Precison Glide Needle, 27 G x ½"	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Used to fill sterile saline into the BD Intradermic tubing.
Benchmark Accuris ”NextPette” Variable Volume Pipette Micro Starter Setincludes 4 pipettes: 10/20/200/1000 μL, plus stand	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Used to pippette sterile solution.
Betadine, Povidine Iodine 10%	Honestmed	67618015017	Used to disinfect the surgical area.
Carprofen Injectable solution 50 mg/mL	Supplied by Covtrus (6451506845)	SKU 591149	In our case, we used diluted carprofen at the dose rate of 5 mg/kg provided by the Animal Resource Center of University of Texas Southwestern Medical Center.
Curved needle (custom made)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in needle is curved to 90 degrees with the help of a hemostat. The tip of the needle is made blunt. It needs to be sterilized before use. It is used to hook the vagus nerve and hold it at the time of separation and injection.
Dissecting microscope	Motic	SMZ-171-BLED (Binocular with Lights)	Used to magnify the crifical anatomical area at the time of vagus nerve separation, injeciton, and to check injection leakage.
Drape sheet	Dynarex	Reorder#8122	Used as drape after sterilization.
Dukal Cotton Tip Applicators, Non-Sterile	Dukal	Item 9003	Used to blunt separation of tissue, needs to sterilize before use.
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Used to separate the left vagus nerve from common carotid artery. It is curved so easy to use.
Ethicon PDS II Undyed Monofilament Suture - SUTURE, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Used in suturing the wound.
Ethilon Nylon Suture Black Monofilament	Ethicon	1856G	Used in suturing the wound if non-absorbale suture is used. Also used to hook the rat tooth to fix nose inside the nose cone.
Fine Forceps - Mirror Finish	Fine Science Tools	11412-11	Used at the time of vagus nerve separation from the common carotid artery. This is straight.
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Ued to cut tissue.
Hamilton cleaning solution	Hamilton	HT18311	Used to clean the Hamilton after use.
Hamilton Needle, 27G, Small Hub RN Needle, 2”, PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Used to connect BD Intramedic™ PE Tubing.
Hamilton Syringe , 710RN	Hamilton	7638-01	Used to hold drug at the time of vagus nerve injection.
Insulin Syringe	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	Used to inject carprofen and local anesthetics.
Lidocaine 2% Injection	Covetrus	Reorder#002468	Used to mix with Bupivacaine and inject at the site of incision.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Dye visible within the nerve, used to mix with drug so that injection mixture is visible.
Micro Bead Sterilizer with Glass Beads	Fine Science Tools	Item No. 18090-46	Used to sterilize surgical tools in between the rat surgery.
NanoFil Needles-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	Used to inject drug - dye mixture inside the vagus nerve.
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-12	Used in wound suturing.
Parafilm M Laboratory Wrapping Film, 4 Inches x 125 Feet, 1 Roll per Box, 12 Count	Honestmed	PM#996	Used to hold the aliquoted 5 uL of drug-dye mixture so that loading of drug-dye mixture into the BDTM intradermic tubing is accurate.
PDI Alcohol Prep Pads	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Used to disinfect the surgical area.
Premium Care Sterile Type VII Gauze Sponges, 8-Ply, 2" x 2"	Dukal	Item C5119	Used as cushon under the neck of rat at the time of surgery.
Press’n Seal Cling Film	Glad		Used to cover a rat at the time of surgery like a drape.
Rat Retractor Set	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Used to keep the incision open so that it is easy to separate the vagus nerve from the carotid artery.
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20.3 cm W x 25.4 cm L (8 in W x 10 in L), used to keep rat warm.
S&T Forceps - SuperGrip Tips	Fine Science Tools	00632-11	Used at the time of suturing to hold tissue without damage.
S&T Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13	Used to tight the suture.
Scalpel blade #15	Fine Science Tools	10015-00	Used to make an incision in the skin at the ventral side of neck.
Scalpel Handle-#7	Fine Science Tools	10007-12	Used to hold the scalpel blade.
Syringe Pump	KD Scientific	78-81-8052GL	Serial #D107034, Model#LEGATO-180, is a programmable pump that can pump small volume of mixture under a program.
TipOne Filter Tip Refill Starter Systems	USA Scientific	Item #1120-3510	Used to pipette the drug and dye mixture.
Vaporizer for Isoflurane, Funnel Filled	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Used to anesthetize rats.
Vetbond Tissue Adhesives	3M Science Applied to Life	ID B00016067	Used to seal tissue at the site of cut wound if suturing is not perfect.
Wahl BravMini+ Professional Cordless Clipper Kit	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Used to cut hair of rat.