Protocole d’injection directe du nerf vague pour les rats

Résumé

Nous présentons un protocole d’injection directe du nerf vague chez le rat, permettant l’administration directe du médicament dans le nerf sans complications post-injection. Cette méthode s’applique aux études neurologiques précliniques impliquant une manipulation du système nerveux autonome. Il peut être utilisé pour l’injection nerveuse directe pour d’autres nerfs chez les rats et d’autres espèces, avec les modifications nécessaires.

Résumé

Il existe une abondance relative de stratégies et de méthodologies pour faciliter l’administration de médicaments au système nerveux central. Cependant, l’administration de médicaments directement dans le système nerveux périphérique est moins courante, avec moins de publications de méthodes détaillées disponibles pour aider les chercheurs. Ici, nous décrivons une méthode d’injection nerveuse directe pour l’administration de médicaments dans le système nerveux périphérique, en utilisant le nerf vague comme nerf modèle. Cette méthode peut être utilisée dans le traitement des troubles du système nerveux autonome en ciblant le nerf vague gauche, bien que cette méthode d’injection générale puisse être extrapolée à l’injection d’autres nerfs avec une modification mineure. Cette méthode explique toutes les étapes critiques de la procédure impliquant la microchirurgie chez des rats adultes anesthésiés sous microscope disséquant. L’utilisation d’un colorant de suivi est décrite pour faciliter le suivi de la fidélité d’injection en temps réel. Des illustrations d’injections réussies et échouées sont fournies. Si elles sont effectuées correctement, les injections directes du nerf vague peuvent être effectuées de manière sûre et bien tolérée par le rat sans complications après l’accouchement. Par exemple, une fois que les chirurgiens ont été formés à cette méthode, six rats sur six ont été injectés avec succès sans aucune complication. Cette méthode d’injection nerveuse directe pour les études précliniques chez le rat est capable d’administrer des agents (y compris, mais sans s’y limiter, la thérapie génique) aux nerfs périphériques.

Introduction

L’application de la bonne méthode d’administration des médicaments est l’un des facteurs critiques pour obtenir des résultats thérapeutiques réussis. Malgré l’abondance de méthodes d’administration d’agents thérapeutiques dans le système nerveux central (SNC), seules quelques méthodes sont rapportées pour l’administration du système nerveux périphérique (SNP) par injection nerveuse directe. L’injection directe de nerfs, telle que l’injection dans les ganglions de la racine dorsale (DRG) chez le rat, a été testée dans des études précliniques pour mieux comprendre les mécanismes de la douleur, la toxicité des médicaments, le transfert de gènes ^1,2,3 et le développement général de méthodes ^1,4. D’autres rapports sur l’injection directe de nerfs comprennent l’injection de nerf spinal⁴, l’injection de nerf sciatique¹ et l’injection de nerf vague chez le rat⁵ et la souris⁶. Récemment, une méthode d’injection suprachondriale a été proposée pour une meilleure distribution des traitements dans la tête du nerf optique chez le lapin⁷.

Le DRG est considéré comme l’endroit idéal pour l’injection directe de vecteurs chargés de transgènes tels que le virus adéno-associé (AAV) en raison de la fonction sensorielle des corps cellulaires dans le DRG². Des méthodes chirurgicales et non chirurgicales d’injections de DRG ont été décrites ^1,8. Cependant, des conclusions controversées ont été trouvées sur la cohérence des résultats avec la méthode non chirurgicale d’injection de DRG¹. Une méthode chirurgicale impliquant une laminectomie partielle a été suggérée comme étant efficace à 100 % pour l’injection de DRG chez le rat sans aucune altération des résultats comportementaux³, ainsi qu’une méthode impliquant une ostéotomie partielle chez la souris⁹. Plusieurs études rapportent les méthodes d’injection de DRG pour l’administration de médicaments, qui ont été utilisées dans la recherche préclinique sur la thérapie génique chez les rats et les souris ^1,2,10. Les études de thérapie génique à base de vecteurs impliquant des injections localisées peuvent inclure les avantages suivants : diminution de l’expression hors cible, réduction de la toxicité systémique, charges virales et volumes d’injection plus faibles, diminution du risque de complications immunogènes^11,12.

La méthode d’injection directe dans le nerf sciatique, le nerf le plus long du corps, a été testée en exposant le nerf sciatique droit au niveau de la mi-cuisse d’un rat. La méthode utilisait une pipette en verre tiré équipée d’un système d’injection contrôlé par un microprocesseur pour injecter un volume total de 10 μL de colorant avec un débit de 1,2 μL/min¹. Cette expérience a montré un manque de distribution du colorant au niveau du DRG, et la distribution était principalement limitée autour du site d’injection. De même, d’autres méthodes d’injections directes dans les nerfs, telles que les injections dans le nerf rachidien, ont été testées avec un colorant pour évaluer la quantité appropriée de volume d’injection et le modèle de distribution du colorant chez les rats. Il est suggéré que 2 μL sont optimaux pour l’injection du nerf rachidien, tandis que 3 μL de colorant par injection de DRG ont montré la distribution dans les ganglions de la racine dorsale et ventrale chez le rat¹. Le volume d’injection de DRG chez la souris a été signalé comme étant optimal de 1,0 μL à 1,5 μL sur la base de la souche et de la taille corporelle ^2,9.

La méthode d’injection directe du nerf vague a été utilisée chez le rat⁵ et la souris⁶ pour évaluer le rôle des lésions neuronales ou de l’intégrité cellulaire dans le transfert de la α-synucléine humaine. Ces deux études, menées par le même groupe de chercheurs, décrivent une brève méthode d’injection directe de vecteurs AAV dans le nerf vague gauche de la région cervicale. Chez le rat, la méthode impliquait un capillaire en verre avec un diamètre d’embout de 60 μm pour injecter un vecteur de 2 μL à un débit de 0,5 μL/min avec une seringue Hamilton de 5 μL. Chez la souris, un volume total de solution vectorielle de 750 nL a été injecté à un débit de 160 nL/min à l’aide d’une aiguille en acier émoussée de 36 G fixée sur une seringue NanoFil^{6 de} 10 μL. Ces expériences ont montré que le transgène était délivré et exprimé dans les axones du pont et du mésencéphale des rats et des souris. De même, le noyau moteur dorsal du nerf vague gauche a montré une immunoréaction positive avec le transgène. Ces éléments de preuve illustrent que la méthode d’injection directe du nerf vague pourrait être une méthode fiable en thérapie génique où la transduction cellulaire est étendue à plusieurs endroits du cerveau, qui projettent des axones à travers le nerf vague. Cependant, ces méthodes ne mentionnent pas l’utilisation d’un colorant pour suivre la fidélité de l’injection.

Ici, une méthode est décrite pour l’injection directe dans le nerf vague gauche à l’aide de colorants de suivi non toxiques largement applicables aux chercheurs dans les études précliniques. Les pièges potentiels qui peuvent causer des difficultés dans l’administration des médicaments et les moyens de les surmonter sont discutés. Ces situations sont illustrées par des images pour montrer ce qui fait que la livraison échoue et la manière de la réussir.

Protocole

Le protocole suivant est mené conformément aux lignes directrices en matière d’éthique de l’établissement et à l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC).

1. Préparation du logement

REMARQUE : Ce protocole s’adresse aux rats adultes âgés d’au moins 2 mois. Des animaux plus petits (y compris les souris et les jeunes rats) sont possibles mais ne sont pas recommandés et seront beaucoup plus difficiles.

1. Fournir de la nourriture humide ou tout autre aliment mou (gel de récupération vétérinaire) pendant 48 heures avant la chirurgie du nerf vague. Comme les animaux peuvent avoir de la difficulté à manger après l’intervention, présentez-les aux animaux avant la chirurgie pour les aider à se familiariser avec le goût de ces aliments et à les motiver à manger.
2. Abriter les rats individuellement dans une cage au moins 1 semaine avant l’opération, ainsi que 1 semaine après l’opération. Cela leur permettra de s’acclimater au stress d’être seuls et d’éviter de gratter les plaies après une intervention chirurgicale par un compagnon de portée.

2. Préparation des articles chirurgicaux et de l’espace

1. Faites une liste de tous les articles nécessaires à l’avance et vérifiez que tous les articles sont disponibles pour la chirurgie.
2. Stérilisez tous les articles avec des méthodes de stérilisation appropriées avant la chirurgie.
3. Installez l’espace chirurgical stérile sous le microscope de dissection. Placez un coussin chauffant sous le microscope pour garder le rat au chaud pendant l’opération.
4. Placez tout le matériel chirurgical sur une table d’opération sur un champ stérile. Gardez suffisamment d’espace pour la chirurgie sous le microscope de dissection. Assurez-vous que la mise au point du microscope est optimale et qu’elle englobe la zone chirurgicale pour visualiser le nerf.
5. Placez le pousse-seringue près de la phase chirurgicale de sorte que la longueur de la tubulure soit suffisante pour atteindre le site d’injection.
6. Placez les outils chirurgicaux vers le côté de la main dominante du chirurgien.

3. Préparation d’un mélange du médicament candidat et du colorant de suivi

1. S’assurer que le médicament candidat est dilué pour atteindre la concentration requise dans le diluant recommandé, de sorte que 5 μL du médicament mélangés à un colorant donnent la quantité requise du médicament candidat à administrer. Il est recommandé d’injecter au maximum 5 μL par la méthode du nerf vague direct (y compris le colorant de suivi, voir l’étape 3.2).
2. Mélangez un colorant compatible avec le médicament candidat pour permettre le suivi de la fidélité de l’injection en temps réel. Par exemple, une concentration finale de 1 % de Luxol Fast Blue ou de 0,002 % de fluorescéine sont des colorants compatibles à utiliser.
   ATTENTION : Utilisez le colorant à sa concentration optimale dans le mélange de colorant et de médicament candidat. Lorsque la concentration de colorant dans le mélange est trop faible, il peut ne pas être visible pour suivre l’injection. Lorsque la concentration de colorant est trop élevée, il peut en résulter un mélange trop épais et à forte viscosité, ce qui bloquera l’aiguille d’injection.

4. Chargement du mélange de médicament candidat et de colorant dans le tube

1. Connectez une seringue en verre de 100 μL avec le piston retiré à une aiguille de 27 G.
2. Connectez une extrémité d’environ 45 cm de tube en polyéthylène stérilisé à l’aiguille de 27 G.
3. Prenez une seringue en plastique de 3 ml et ajustez-la avec une aiguille de 27 G. Chargez la seringue avec environ 0,5 mL de solution saline normale à 0,9 %.
4. Remplissez le tube en polyéthylène avec la solution saline normale à 0,9 % à partir de l’extrémité ouverte pour remplir toute la longueur du tube et tout le corps de la seringue en verre jusqu’à ce qu’il déborde.
   REMARQUE : Il est essentiel d’éviter que des bulles d’air ne se coincent à l’intérieur du tube.
5. Retirer et jeter la seringue de 3 ml et l’aiguille.
6. Insérez le piston de la seringue dans le corps de la seringue en verre et poussez-le légèrement vers l’avant jusqu’au milieu du cylindre.
7. Placez la seringue en verre dans le pousse-seringue.
8. Tirez légèrement le piston vers l’arrière à l’aide de la pompe à seringue pour créer un espace d’air d’environ 1,5 cm à l’extrémité ouverte dans la longueur du tube.
9. Pipeter au moins 5 μL de colorant et de mélange de médicament candidat à l’aide d’une micropipette de 10 μL et la déposer sur un morceau de parafilm stérilisé.
10. Retirez le mélange de médicament candidat dans la tubulure en tirant le piston vers l’arrière via le pousse-seringue. Maintenez la bulle d’air entre la solution saline à 0,9 % et la solution d’injection, mais sinon, évitez de piéger des bulles d’air dans la solution d’injection. Marquez le niveau du mélange d’injection dans le tube à l’aide d’un marqueur.
    REMARQUE : L’espace d’air entre le mélange médicament-colorant candidat et la solution saline stérile à l’intérieur de la tubulure est essentiel pour empêcher le mélange des deux solutions.
11. Ajustez l’aiguille de 35 G avec la tubulure. Fixez l’aiguille sur la surface propre de la scène chirurgicale avec du ruban adhésif afin que l’aiguille ne se détache pas, ne bouge pas et ne touche rien d’autre, et reste stérilisée.

5. Amorçage de l’aiguille d’injection

1. Réglez le programme de pompe à seringue pour distribuer 0,5 μL/min.
2. Démarrez le pousse-seringue pendant environ 10 à 15 secondes, jusqu’à ce que la solution d’injection commence à sortir de la pointe de l’aiguille. Une petite quantité du mélange à l’extrémité de l’aiguille sans fuite au niveau de l’articulation de la tubulure et de l’aiguille d’injection (ou n’importe où ailleurs sur la longueur de la seringue, du tube ou de l’aiguille) indique que la configuration est correcte.
   REMARQUE : Si une minuscule gouttelette à l’extrémité de l’aiguille n’est pas visible, cela indique un blocage de l’aiguille. Le blocage de l’aiguille peut se produire en raison de la viscosité élevée du mélange de médicament et de colorant candidat, de l’excès d’air emprisonné dans le système et du fait que la seringue en verre n’est pas correctement installée dans le pousse-seringue. Voir la figure 1 pour un exemple de fuite à la jonction entre l’aiguille et le tube. L’amorçage est essentiel car il permet d’identifier si l’aiguille n’est pas obstruée et si l’injection à l’intérieur du nerf se ferait en douceur.

6. Préparation du rat à la chirurgie

1. Obtenez le poids corporel du rat pour calculer la dose nécessaire d’analgésiques. Par exemple, le carprofène est utilisé à la dose de 5 mg/kg par voie sous-cutanée chez le rat.
   REMARQUE : Il est recommandé de conserver le carprofène à 4 °C avant l’injection.
2. Anesthésie le rat avec un vaporisateur d’isoflurane en utilisant un débit de 3 % à 4 % pour l’induction de l’anesthésie pendant environ 2-3 min. Réduire le débit d’isoflurane à environ 1,75 % à 2 % pour le maintien de l’anesthésie.
3. Transférez le rat sur une table séparée avec une configuration pour l’épilation et la préparation du site. Assurez-vous que cette table est proche de l’espace chirurgical.
4. Appliquez une pommade artificielle lacrymogène dans les deux yeux du rat pour prévenir une sécheresse excessive.
5. Administrer des analgésiques selon le protocole approuvé de l’établissement pour contrôler la douleur lorsque le rat reprend conscience.
6. Rasez la zone chirurgicale avec une tondeuse à cheveux sur la face ventrale du cou dans la région cervicale. Rasez jusqu’à environ 2 cm à une distance perpendiculaire de la ligne médiane des deux côtés, du menton au sternum.
7. Stérilisez la zone avec de l’alcool éthylique à 70 % et de la bétadine à 10 %, en essuyant la zone trois fois alternativement avec un tampon imbibé d’alcool et de la povidone iodée. Essuyez du centre de la zone vers l’extérieur selon un motif circulaire.
8. Transférez le rat au stade chirurgical sous le microscope en position couchée. Ajustez la mise au point du microscope pour visualiser la zone de chirurgie dans la région cervicale.

7. Réalisation d’une chirurgie du rat pour injecter le médicament candidat directement dans le nerf vague gauche (Figure 2, Figure 3 et Figure 4)

REMARQUE : Cette partie de la méthode nécessitera une deuxième personne pour aider le chirurgien.

1. Placez le rat sur un coussin chauffant en position couchée sous le microscope de dissection associé à une lumière montée.
2. Accrochez les dents de la mâchoire supérieure avant du rat avec un morceau de suture non résorbable et fixez l’extrémité ouverte de la suture à l’intérieur du cône nasal de sorte que la narine du rat soit toujours à l’intérieur du cône nasal tout au long de l’anesthésie.
3. Positionnez le rat de manière à ce que sa tête repose sur le côté gauche du chirurgien droitier (ou du côté droit d’un chirurgien gaucher). Dans cette position, la face avant du chirurgien est perpendiculaire au corps du rat. Placez un coussin de calibre stérilisé sous le cou et ajustez l’angle de la région cervicale du rat afin que la région cervicale devienne droite. Cela facilitera la localisation du nerf vague gauche et la réalisation de l’injection.
4. Drapez tout le corps du rat avec un champ stérilisé, en gardant l’espace chirurgical ouvert.
5. Fixez quatre goupilles d’écarteur individuellement avec 4 fixateurs magnétiques avec élastomères et placez les fixateurs aux quatre coins de la scène chirurgicale.
6. Injectez des anesthésiques locaux par voie épidermique sur la ligne médiane de la région cervicale où l’incision est pratiquée. Par exemple, un mélange de lidocaïne et de bupivacaïne est généralement utilisé.
7. Faites une incision cutanée longitudinale d’environ 2 cm de long sur la ligne médiane entre le menton et le sternum avec une lame de scalpel sur la face ventrale du cou dans la région cervicale (Figure 3A).
8. Séparez les bords coupés de la peau à l’aide d’embouts en coton stérilisé.
9. Rétractez les bords de la peau dans des directions opposées à partir du site de l’incision à l’aide d’embouts rétracteurs.
10. Séparez le facia avec des cotons-tiges pour aller plus loin. Poussez les glandes salivaires vers le côté latéral.
11. Séparez les muscles sterno-mastoïdiens avec des cotons-tiges et rétractez-les avec les épingles. Au fur et à mesure que la séparation du muscle sterno-mastoïdien progresse largement, la trachée apparaît au milieu, recouverte de muscle sterno-hyoïdien (Figure 3B).
    REMARQUE : Veillez à ne pas exercer de pression sur la trachée.
12. Avancez la séparation des tissus sur le côté gauche de la trachée du rat jusqu’à ce que la gaine carotide apparaisse, qui contient l’artère carotide commune qui relie le nerf vague gauche.
13. Faites soigneusement un petit trou ponctuel dans la gaine carotide avec une pince fine, en faisant attention à ne pas blesser l’artère carotide au microscope. Séparez le nerf vague gauche de l’artère carotide commune à l’aide de pinces fines.
    REMARQUE : La zone chirurgicale est anatomiquement critique. La paroi de l’artère carotide est épaisse, glissante et ne se blesse pas facilement, mais la pointe acérée d’une pince fine peut la blesser et des saignements peuvent se produire. Dans le même temps, faites attention à ne pas blesser le nerf.
14. Une fois que le nerf est séparé de l’artère par la pince, utilisez une aiguille incurvée de 25 G ajustée à une seringue de 1 mL à partir de ce trou pour « accrocher » et tenir le nerf par la main non dominante (figure 4A).
    REMARQUE : La pointe de l’aiguille incurvée est émoussée afin de ne pas blesser le nerf et l’artère. L’angle de courbure de la pointe de l’aiguille est calculé sur mesure à environ 90° à l’aide d’un hémostat (Figure 2).
15. Avec la main dominante, tenez l’aiguille chargée avec le mélange médicament-colorant candidat et piquez doucement le nerf dans la même direction que le nerf de manière à ce que le biseau de l’aiguille soit orienté vers le haut.
    1. Pour une piqûre facile, gardez le nerf droit en tirant doucement à l’aide du crochet de 25 G. Insérez l’aiguille dans le nerf et avancez vers l’avant, de plus de 0,5 cm, tout en gardant l’aiguille parallèle au nerf vague. Ensuite, tirez légèrement vers l’arrière pour qu’il reste environ 0,4 à 0,5 cm d’aiguille à l’intérieur du nerf.
       REMARQUE : L’angle de l’aiguille doit être suffisamment peu profond pour pénétrer à l’intérieur du nerf sans passer de l’autre côté.
16. Il peut arriver que l’aiguille ne soit pas obstruée à l’extérieur du nerf au moment de l’amorçage, mais que le mélange médicament-colorant candidat ne passe pas en douceur à l’intérieur du nerf. Pour éviter cette situation, limitez le nombre de piqûres nerveuses par une seule aiguille pas plus de 3 fois. Si l’aiguille s’émousse, les risques de blocage ou d’injection médiocre augmenteront.
17. Assurez-vous que l’aiguille est complètement à l’intérieur du nerf. Maintenez la position immobile et allumez le pousse-seringue.
    REMARQUE : Vérifiez soigneusement au site d’injection pour vous assurer que le mélange médicament-colorant candidat ne reflue pas hors du nerf.
18. Pendant que l’injection se poursuit, vérifiez constamment que la perfusion reste à l’intérieur du nerf et circule doucement. Utilisez la marque faite sur la tubulure de perfusion pour surveiller le mouvement du mélange médicament-colorant à partir du point de départ.
    1. Si le mélange médicament-colorant candidat ne s’écoule pas correctement, retirez l’aiguille et répétez l’étape d’amorçage (étape 5.2). Ensuite, réinsérez l’aiguille dans le nerf et reprenez la perfusion.
19. Le nerf commence à développer la couleur du colorant (Figure 4B). Poursuivre l’infusion à 0,5 μL/min pendant 10 min pour perfuser les 5 μL du mélange médicament-colorant candidat.
    REMARQUE : Il est recommandé d’irriguer les tissus exposés avec une petite quantité de solution saline stérile chaude à 0,9 % au besoin pour éviter une sécheresse excessive et des dommages.
20. Une fois que les 5 μL ont été perfusés et que le tire-seringue s’est arrêté, maintenez l’aiguille en place pendant 1 minute supplémentaire pour permettre à tout le mélange médicament-colorant candidat de se propager à partir du site d’injection. Retirez l’aiguille.
21. Retirez l’aiguille incurvée de 25 G. Utilisez des embouts en coton stériles pour remettre doucement les tissus à leur emplacement d’origine. Retirez les embouts de l’écarteur.
22. Fermez la plaie avec une suture non résorbable (une suture résorbable peut également être utilisée). Appliquez une petite quantité de colle tissulaire entre les points de suture si nécessaire pour fermer parfaitement la plaie.

8. Soins postopératoires d’un rat

1. Perfaction sous-cutanée d’environ 3 ml de solution saline tiède à 0,9 % après la fermeture de la plaie. Cela aide les rats à se réhydrater immédiatement.
2. Placez le rat dans une source de chaleur jusqu’à ce qu’il récupère complètement de l’anesthésie et revienne à un état normal. Notez tout ce qui est observé qui est anormal pendant le processus de récupération.
   REMARQUE : la durée de récupération peut être plus longue si la procédure d’injection nerveuse prend beaucoup de temps.
3. Transférez le rat dans sa cage d’accueil avec de la nourriture humide sur le sol de la cage. Assurez-vous que l’eau est disponible en tout temps. Observez le rat en postopératoire pendant environ 2 h pour vous assurer qu’il n’a pas froid.
   REMARQUE : Placez le rat dans une source de chaleur pendant des heures supplémentaires s’il est froid.
4. Surveiller le rat à 12 h, 24 h, 36 h, 48 h et 72 h après la chirurgie avec des notes écrites d’observations. Répéter la prise d’analgésiques conformément au protocole approuvé de l’établissement pour contrôler la douleur. Par exemple, le carprofène est dosé à raison de 5 mg/kg par voie sous-cutanée deux fois à 24 h d’intervalle. Consulter un vétérinaire si la douleur persiste chez le rat pendant plus de 48 h.
5. Répéter l’injection sous-cutanée d’environ 3 mL de solution saline chaude à 0,9 % à 24 h selon l’état du rat.
6. Continuez à évaluer la plaie. Assurez-vous que la plaie est sèche et qu’elle est en train de guérir.
   REMARQUE : La rougeur, l’enflure et l’état douloureux de la plaie avec l’inactivité et l’apathie du rat peuvent être une indication d’inflammation de la plaie et peuvent justifier une consultation vétérinaire supplémentaire. Un rat souffrant de douleur montrera un dos voûté, un pelage ébouriffé, des yeux rouges et un état inactif. On le trouve généralement dans un coin de la cage.
7. Retirez les sutures non résorbables dans les 2 semaines suivant la cicatrisation de la plaie.

Résultats

Six rats adultes (3 mâles et 3 femelles) ont été utilisés dans la présente étude. Sur six, un rat a été injecté plusieurs fois pour démontrer une condition d’injection d’échec qui montre une diffusion du colorant autour du site d’injection Figure 5A. Tous les autres rats ont montré une injection douce et une coloration nerveuse, comme le montrent les figures 4B et

Discussion

La méthode d’injection directe dans le nerf vague gauche peut être réalisée en toute sécurité et sans complications post-opératoires chez le rat. L’administration de médicaments au nerf vague peut être utilisée pour cibler le système nerveux autonome (SNA). Cela implique certaines étapes critiques qui nécessitent de la pratique et un degré modéré à élevé de compétence chirurgicale.

Cette intervention chirurgicale nécessite une anesth?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Tuberculin Syringe with Detachable 25 G x 5/8". Needle	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Used to connect with curved needle to pull the vagus nerve and hold it at the time of injection.
0.5% Bupivacaine Hydrochloride Injection	Hospira	NDC 0409-1162-19	Local anesthetics used to anesthetize local tissue.
100 mL 0.9% Sodium Chloride Irrigation USP	Stericare Solutions	Item #6240	Normal saline, used to rehydrate rat and tissue.
20 Blunt, Retractor Tips, 7.5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Used to pull apart and hold tissues at the time of surgery.
3 mL BD-Luer-Lok Syringe, Sterile, Single Use	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Used to inject saline in rat and fill the saline into the Polythene tubing.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Fluorescein dye visible within the nerve. Used to track injection fidelity.
Animal Weighing Scale	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Used to measure body weight of rat.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF Surgical Gloves	Ansell	ASTM D3577	Sterilie glove, it is used at the time of surgery by a surgeon.
Artificial Tears Ointment 3.5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Used in eyses to prevent excessive dryness of eyes.
Baby-Myxter Hemostat	Fine Science Tools	13013-14	Used to stop bleeding in case of emergency. Also used to bend the 25 G x 5/8" in needle.
BD Intramedic PE Tubing	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Used in the injection set up system to connect with Hamilton needle and NanoFil Needles. It also holds the injection mixture.
BD Precison Glide Needle, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Used to inject saline in rat, and to make a curved needle.
BD Precison Glide Needle, 27 G x ½"	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Used to fill sterile saline into the BD Intradermic tubing.
Benchmark Accuris ”NextPette” Variable Volume Pipette Micro Starter Setincludes 4 pipettes: 10/20/200/1000 μL, plus stand	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Used to pippette sterile solution.
Betadine, Povidine Iodine 10%	Honestmed	67618015017	Used to disinfect the surgical area.
Carprofen Injectable solution 50 mg/mL	Supplied by Covtrus (6451506845)	SKU 591149	In our case, we used diluted carprofen at the dose rate of 5 mg/kg provided by the Animal Resource Center of University of Texas Southwestern Medical Center.
Curved needle (custom made)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in needle is curved to 90 degrees with the help of a hemostat. The tip of the needle is made blunt. It needs to be sterilized before use. It is used to hook the vagus nerve and hold it at the time of separation and injection.
Dissecting microscope	Motic	SMZ-171-BLED (Binocular with Lights)	Used to magnify the crifical anatomical area at the time of vagus nerve separation, injeciton, and to check injection leakage.
Drape sheet	Dynarex	Reorder#8122	Used as drape after sterilization.
Dukal Cotton Tip Applicators, Non-Sterile	Dukal	Item 9003	Used to blunt separation of tissue, needs to sterilize before use.
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Used to separate the left vagus nerve from common carotid artery. It is curved so easy to use.
Ethicon PDS II Undyed Monofilament Suture - SUTURE, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Used in suturing the wound.
Ethilon Nylon Suture Black Monofilament	Ethicon	1856G	Used in suturing the wound if non-absorbale suture is used. Also used to hook the rat tooth to fix nose inside the nose cone.
Fine Forceps - Mirror Finish	Fine Science Tools	11412-11	Used at the time of vagus nerve separation from the common carotid artery. This is straight.
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Ued to cut tissue.
Hamilton cleaning solution	Hamilton	HT18311	Used to clean the Hamilton after use.
Hamilton Needle, 27G, Small Hub RN Needle, 2”, PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Used to connect BD Intramedic™ PE Tubing.
Hamilton Syringe , 710RN	Hamilton	7638-01	Used to hold drug at the time of vagus nerve injection.
Insulin Syringe	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	Used to inject carprofen and local anesthetics.
Lidocaine 2% Injection	Covetrus	Reorder#002468	Used to mix with Bupivacaine and inject at the site of incision.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Dye visible within the nerve, used to mix with drug so that injection mixture is visible.
Micro Bead Sterilizer with Glass Beads	Fine Science Tools	Item No. 18090-46	Used to sterilize surgical tools in between the rat surgery.
NanoFil Needles-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	Used to inject drug - dye mixture inside the vagus nerve.
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-12	Used in wound suturing.
Parafilm M Laboratory Wrapping Film, 4 Inches x 125 Feet, 1 Roll per Box, 12 Count	Honestmed	PM#996	Used to hold the aliquoted 5 uL of drug-dye mixture so that loading of drug-dye mixture into the BDTM intradermic tubing is accurate.
PDI Alcohol Prep Pads	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Used to disinfect the surgical area.
Premium Care Sterile Type VII Gauze Sponges, 8-Ply, 2" x 2"	Dukal	Item C5119	Used as cushon under the neck of rat at the time of surgery.
Press’n Seal Cling Film	Glad		Used to cover a rat at the time of surgery like a drape.
Rat Retractor Set	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Used to keep the incision open so that it is easy to separate the vagus nerve from the carotid artery.
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20.3 cm W x 25.4 cm L (8 in W x 10 in L), used to keep rat warm.
S&T Forceps - SuperGrip Tips	Fine Science Tools	00632-11	Used at the time of suturing to hold tissue without damage.
S&T Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13	Used to tight the suture.
Scalpel blade #15	Fine Science Tools	10015-00	Used to make an incision in the skin at the ventral side of neck.
Scalpel Handle-#7	Fine Science Tools	10007-12	Used to hold the scalpel blade.
Syringe Pump	KD Scientific	78-81-8052GL	Serial #D107034, Model#LEGATO-180, is a programmable pump that can pump small volume of mixture under a program.
TipOne Filter Tip Refill Starter Systems	USA Scientific	Item #1120-3510	Used to pipette the drug and dye mixture.
Vaporizer for Isoflurane, Funnel Filled	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Used to anesthetize rats.
Vetbond Tissue Adhesives	3M Science Applied to Life	ID B00016067	Used to seal tissue at the site of cut wound if suturing is not perfect.
Wahl BravMini+ Professional Cordless Clipper Kit	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Used to cut hair of rat.