Protocolo de injeção direta do nervo vago para ratos

Resumo

Apresentamos um protocolo para injeção direta do nervo vago em ratos, permitindo a administração do medicamento diretamente no nervo sem complicações pós-injeção. Este método se aplica a estudos neurológicos pré-clínicos envolvendo manipulação do sistema nervoso autônomo. Pode ser usado para injeção direta de nervos para outros nervos em ratos e outras espécies, com as modificações necessárias.

Resumo

Há uma abundância relativa de estratégias e metodologias para facilitar a entrega de medicamentos ao sistema nervoso central. No entanto, a administração de medicamentos diretamente no sistema nervoso periférico é menos comum, com menos publicações de métodos detalhados disponíveis para ajudar os pesquisadores. Aqui, descrevemos um método de injeção direta de nervo para administração de medicamentos no sistema nervoso periférico, usando o nervo vago como nervo modelo. Este método pode ser usado no tratamento de distúrbios do sistema nervoso autônomo através do direcionamento do nervo vago esquerdo, embora este método geral de injeção possa ser extrapolado para injeção de outros nervos com pequenas modificações. Este método explica todas as etapas críticas envolvidas no procedimento envolvendo microcirurgia em ratos adultos anestesiados sob um microscópio de dissecação. O uso de um corante de rastreamento é descrito para facilitar o monitoramento da fidelidade da injeção em tempo real. São fornecidas ilustrações de injeções bem-sucedidas e fracassadas. Se realizadas corretamente, as injeções diretas do nervo vago podem ser conduzidas de maneira segura e bem tolerada pelo rato, sem complicações pós-parto. Por exemplo, uma vez que os cirurgiões foram treinados neste método, seis dos seis ratos foram injetados com sucesso sem complicações. Este método de injeção direta de nervos para estudos pré-clínicos em ratos é capaz de fornecer agentes (incluindo, mas não se limitando à terapia genética) aos nervos periféricos.

Introdução

A aplicação do método correto de administração de medicamentos é um dos fatores críticos para alcançar resultados terapêuticos bem-sucedidos. Apesar da abundância de métodos para entrega de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC), apenas alguns métodos são relatados para entrega do sistema nervoso periférico (SNP) por injeção direta no nervo. A injeção direta do nervo, como a injeção nos gânglios da raiz dorsal (DRG) em ratos, foi testada em estudos pré-clínicos para melhor compreensão dos mecanismos de dor, toxicidade de drogas, transferência de genes ^1,2,3 e desenvolvimento de métodos gerais ^1,4. Relatos adicionais sobre injeção direta do nervo incluem injeção do nervo espinhal⁴, injeção do nervo ciático¹ e injeção do nervo vago em ratos⁵ e camundongos⁶. Recentemente, um método de injeção supracondrial foi proposto para a melhor distribuição da terapêutica na cabeça do nervo óptico em coelhos⁷.

O DRG é considerado o local ideal para injeção direta de vetores carregados de transgenes, como o vírus adeno-associado (AAV), devido à função sensorial dos corpos celulares no DRG². Métodos cirúrgicos e não cirúrgicos de injeções de DRG foram descritos ^1,8. No entanto, conclusões controversas foram encontradas sobre a consistência dos resultados com o método não cirúrgico de injeção de DRG¹. Um método cirúrgico envolvendo uma laminectomia parcial foi sugerido como 100% bem-sucedido para injeção de DRG em ratos sem qualquer alteração nos resultados comportamentais³, bem como um método envolvendo osteotomia parcial em camundongos⁹. Vários estudos relatam os métodos de injeção de DRG de drug delivery, que têm sido utilizados na pesquisa pré-clínica de terapia gênica em ratos e camundongos ^1,2,10. Estudos de terapia gênica baseados em vetores envolvendo injeções localizadas podem incluir os seguintes benefícios: diminuição da expressão fora do alvo, redução da toxicidade sistêmica e menores cargas virais e volumes de injeção, diminuição do risco de complicações imunogênicas^11,12.

O método de injeção direta no nervo ciático, o nervo mais longo do corpo, foi tentado expondo o nervo ciático direito no nível médio da coxa de um rato. O método utilizou uma pipeta de vidro puxado equipada com um sistema de injeção controlado por microprocessador para injetar um volume total de 10 μL de corante com uma taxa de fluxo de 1,2 μL/min¹. Este experimento mostrou uma falta de distribuição de corante ao nível de DRG, e a distribuição foi limitada principalmente em torno do local da injeção. Da mesma forma, outros métodos de injeções diretas de nervos, como injeções de nervos espinhais, foram testados com corante para avaliar a quantidade apropriada de volume de injeção e padrão de distribuição de corante em ratos. Sugere-se que 2 μL sejam ideais para injeção no nervo espinhal, enquanto 3 μL de corante por injeção de DRG mostraram a distribuição nos gânglios da raiz dorsal e ventral em ratos¹. O volume para injeção de DRG em camundongos foi relatado como ideal de 1,0 μL a 1,5 μL com base na cepa e no tamanho do corpo ^2,9.

O método de injeção direta do nervo vago foi usado em ratos⁵ e camundongos⁶ para avaliar o papel da lesão neural ou integridade celular na transferência de α-sinucleína humana. Esses dois estudos, conduzidos pelo mesmo grupo de pesquisadores, descrevem um breve método de injeção direta de vetores AAV no nervo vago esquerdo na região cervical. Em ratos, o método envolveu um capilar de vidro com um diâmetro de ponta de 60 μm para injetar 2 μL de vetor a uma taxa de fluxo de 0,5 μL / min com uma seringa Hamilton de 5 μL. Em camundongos, um volume total de solução vetorial de 750 nL foi injetado a uma taxa de fluxo de 160 nL / min usando uma agulha de aço rombo de 36 G encaixada em uma seringa NanoFil de 10 μL⁶. Esses experimentos mostraram que o transgene foi entregue e expresso em axônios na ponte e no mesencéfalo dos ratos e camundongos. Da mesma forma, o núcleo motor dorsal do nervo vago esquerdo mostrou imunorreação positiva com o transgene. Essas evidências ilustram que o método de injeção direta do nervo vago pode ser um método confiável em terapia genética, onde a transdução celular é estendida para vários locais do cérebro, que projetam axônios através do nervo vago. No entanto, esses métodos não mencionam o uso de nenhum corante para rastrear a fidelidade da injeção.

Aqui, é descrito um método para injeção direta no nervo vago esquerdo usando corantes de rastreamento não tóxicos amplamente aplicáveis a pesquisadores em estudos pré-clínicos. Armadilhas potenciais que podem causar dificuldades na entrega de medicamentos e as formas de superá-las são discutidas. Essas situações são ilustradas com fotos para mostrar o que torna a entrega malsucedida e a maneira de torná-la bem-sucedida.

Protocolo

O protocolo a seguir é conduzido de acordo com as diretrizes de ética institucional e a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Preparação da habitação

NOTA: Este protocolo é para ratos adultos com pelo menos 2 meses. Animais menores (incluindo camundongos e ratos mais jovens) são possíveis, mas não são recomendados e serão consideravelmente mais difíceis.

1. Forneça ração úmida ou qualquer outro alimento macio (gel de recuperação veterinária) por 48 h antes da cirurgia do nervo vago. Como os animais podem enfrentar dificuldade para comer após o procedimento, apresente esses itens aos animais antes da cirurgia para ajudá-los a se familiarizar com o sabor desses itens e induzir a motivação alimentar.
2. Ratos domésticos individualmente em uma gaiola pelo menos 1 semana antes da cirurgia, bem como 1 semana após a cirurgia. Isso permitirá que eles se acostumem com o estresse de estar sozinhos e evitem arranhões nas feridas após a cirurgia por um companheiro de ninhada.

2. Preparação dos itens cirúrgicos e espaço

1. Faça uma lista de todos os itens necessários com antecedência e verifique novamente se todos os itens estão disponíveis para a cirurgia.
2. Esterilize todos os itens com métodos apropriados de esterilização antes da cirurgia.
3. Configure o espaço cirúrgico estéril sob o microscópio de dissecação. Coloque uma almofada de aquecimento sob o microscópio para manter o rato aquecido durante a cirurgia.
4. Coloque todos os materiais cirúrgicos em uma mesa cirúrgica sobre uma cortina estéril. Mantenha espaço suficiente para a cirurgia sob o microscópio de dissecação. Certifique-se de que o foco do microscópio seja ideal e abranja a área cirúrgica para visualizar o nervo.
5. Coloque a bomba de seringa perto do estágio cirúrgico para que o comprimento do tubo seja suficiente para alcançar o local da injeção.
6. Coloque as ferramentas cirúrgicas ao lado da mão dominante do cirurgião.

3. Preparando uma mistura do medicamento candidato e do corante de rastreamento

1. Certifique-se de que o medicamento candidato seja diluído para atingir a concentração necessária no diluente recomendado, de modo que 5 μL do medicamento misturado com corante forneçam a quantidade necessária do medicamento candidato a ser administrado. Recomenda-se que um volume máximo de injeção pelo método do nervo vago direto seja de 5 μL (incluindo o corante de rastreamento, consulte a etapa 3.2).
2. Misture um corante compatível com o medicamento candidato para permitir o rastreamento da fidelidade da injeção em tempo real. Por exemplo, uma concentração final de 1% de Luxol Fast Blue ou 0,002% de fluoresceína são corantes compatíveis a serem usados.
   CUIDADO: Use o corante em sua concentração ideal na mistura de corante e medicamento candidato. Quando a concentração de corante na mistura é muito baixa, pode não ser visível rastrear a injeção. Quando a concentração de corante é muito alta, pode resultar em uma mistura muito espessa e com alta viscosidade, o que bloqueará a agulha de injeção.

4. Carregando a mistura candidata de medicamento e corante na tubulação

1. Ligue uma seringa de vidro de 100 μL com o êmbolo removido a uma agulha de 27 G.
2. Conecte uma extremidade de aproximadamente 45 cm de tubo de polietileno esterilizado à agulha de 27 G.
3. Pegue uma seringa de plástico de 3 mL e encaixe-a com uma agulha de 27 G. Carregue a seringa com cerca de 0,5 mL de solução salina normal a 0,9%.
4. Encha o tubo de polietileno com solução salina normal a 0,9% da extremidade aberta para preencher todo o comprimento do tubo e todo o cilindro da seringa de vidro até que transborde.
   NOTA: É fundamental evitar que bolhas de ar fiquem presas dentro da tubulação.
5. Remova e descarte a seringa e a agulha de 3 mL.
6. Insira o êmbolo da seringa no cilindro da seringa de vidro e empurre-o ligeiramente para a frente até o meio do cilindro.
7. Coloque a seringa de vidro na bomba de seringa.
8. Puxe o êmbolo ligeiramente para trás usando a bomba de seringa para criar um espaço de ar de cerca de 1.5 cm na extremidade aberta do comprimento do tubo.
9. Pipete pelo menos 5 μL de corante e mistura de medicamento candidato com uma micropipeta de 10 μL e coloque-a em um pedaço esterilizado de parafilme.
10. Retire a mistura de medicamentos candidatos para a tubulação puxando o êmbolo para trás através da bomba de seringa. Mantenha a bolha de ar entre a solução salina a 0,9% e a solução de injeção, mas, caso contrário, evite prender bolhas de ar dentro da solução de injeção. Marque o nível da mistura de injeção na tubulação com um marcador.
    NOTA: O espaço de ar entre a mistura candidata de corante medicamentoso e a solução salina estéril dentro da tubulação é fundamental para evitar a mistura das duas soluções.
11. Encaixe a agulha de 35 G com o tubo. Fixe a agulha na superfície limpa do estágio cirúrgico com fita adesiva para que a agulha não fique solta, não se mova e toque em mais nada e permaneça esterilizada.

5. Escorva da agulha de injeção

1. Defina o programa da bomba de seringa para dispensar 0.5 μL/min.
2. Ligue a bomba de seringa por cerca de 10-15 s, até que a solução de injeção comece a sair da ponta da agulha. Uma pequena quantidade da mistura na ponta da agulha sem vazamento na junta do tubo e da agulha de injeção (ou em qualquer outro lugar ao longo do comprimento da seringa, tubo ou agulha) indica que a configuração está correta.
   NOTA: Se uma pequena gota na ponta da agulha não for vista, isso indica um bloqueio da agulha. O bloqueio da agulha pode ocorrer devido à alta viscosidade do medicamento candidato e da mistura de corante, excesso de ar preso no sistema e a seringa de vidro não está encaixada corretamente dentro da bomba da seringa. Consulte a Figura 1 para obter um exemplo de vazamento na junção entre a agulha e o tubo. O priming é fundamental porque ajuda a identificar se a agulha está desobstruída e se a injeção dentro do nervo passaria suavemente.

6. Preparação do rato para a cirurgia

1. Obter o peso corporal do rato para calcular a dose necessária de analgésicos. Por exemplo, o carprofeno é usado na dose de 5 mg / kg por via subcutânea em ratos.
   NOTA: Recomenda-se armazenar o carprofeno a 4 °C antes da injeção.
2. Anestesiar o rato com um vaporizador de isoflurano usando uma taxa de fluxo de 3% -4% para indução da anestesia por cerca de 2-3 min. Reduza a taxa de fluxo de isoflurano para cerca de 1,75% -2% para manutenção da anestesia.
3. Transfira o rato para uma mesa separada com uma configuração para depilação e preparação do local. Certifique-se de que esta mesa esteja próxima ao espaço cirúrgico.
4. Aplique pomada lacrimal artificial em ambos os olhos do rato para evitar o ressecamento excessivo.
5. Administre analgésicos de acordo com o protocolo institucional aprovado para controlar a dor quando o rato voltar à consciência.
6. Depile a área cirúrgica com uma máquina de cortar cabelo no lado ventral do pescoço, na região cervical. Faça a barba até cerca de 2 cm de distância perpendicular da linha média em ambos os lados, do queixo ao esterno.
7. Esterilize a área com álcool etílico 70% e betadina 10%, limpando a área três vezes alternadamente com um cotonete embebido em álcool e iodopovidona. Limpe do centro da área para fora em um padrão circular.
8. Transferir o rato para a fase cirúrgica ao microscópio em decúbito dorsal. Ajuste o foco do microscópio para visualizar a área da cirurgia na região cervical.

7. Realização de cirurgia em ratos para injetar o medicamento candidato diretamente no nervo vago esquerdo (Figura 2, Figura 3 e Figura 4)

NOTA: Esta parte do método exigirá uma segunda pessoa para auxiliar o cirurgião.

1. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento em decúbito dorsal sob o microscópio de dissecação associado a uma luz montada.
2. Prenda os dentes da mandíbula superior frontal do rato com um pedaço de sutura não absorvível e fixe a extremidade aberta da sutura dentro do cone do nariz para que a narina do rato fique sempre dentro do cone do nariz durante a anestesia.
3. Posicione o rato de forma que sua cabeça fique no lado esquerdo do cirurgião destro (ou no lado direito de um cirurgião canhoto). Nesta posição, a parte frontal do cirurgião é perpendicular ao corpo do rato. Coloque uma almofada de calibre esterilizado sob o pescoço e ajuste o ângulo da região cervical do rato para que a região cervical fique reta. Isso facilitará a localização do nervo vago esquerdo e a realização da injeção.
4. Cubra todo o corpo do rato com um campo esterilizado, mantendo o espaço cirúrgico aberto.
5. Fixe quatro pinos retratores individualmente com 4 fixadores magnéticos com elastômeros e coloque os fixadores nos quatro cantos do estágio cirúrgico.
6. Injete anestésicos locais epidérmicos na linha média da região cervical onde a incisão é feita. Por exemplo, geralmente é usada uma mistura de lidocaína e bupivacaína.
7. Faça uma incisão longitudinal na pele com cerca de 2 cm de comprimento na linha média entre o queixo e o esterno com uma lâmina de bisturi no lado ventral do pescoço na região cervical (Figura 3A).
8. Separe as bordas cortadas da pele com pontas de algodão esterilizadas.
9. Retraia as bordas da pele em direções opostas do local da incisão com a ajuda de pontas retratoras.
10. Separe o painel com pontas de algodão para ir mais fundo. Empurre as glândulas salivares para o lado lateral.
11. Separe os músculos esternomastóideos com pontas de algodão e retraia-os com os pinos. À medida que a separação do músculo esternomastóideo avança, a traqueia aparece no meio, coberta por músculo esterno-hióideo (Figura 3B).
    NOTA: Tenha cuidado para não exercer pressão sobre a traqueia.
12. Avance a separação do tecido no lado esquerdo da traqueia do rato até que apareça a bainha carotídea, que contém a artéria carótida comum correndo junto com o nervo vago esquerdo.
13. Faça cuidadosamente um pequeno orifício na bainha carotídea com uma pinça fina, prestando atenção para não ferir a artéria carótida ao microscópio. Separe o nervo vago esquerdo da artéria carótida comum com uma pinça fina.
    NOTA: A área cirúrgica é anatomicamente crítica. A parede da artéria carótida é espessa, escorregadia e não se machuca facilmente, mas a ponta afiada de uma pinça fina pode machucá-la e pode ocorrer sangramento. Ao mesmo tempo, preste atenção para não ferir o nervo.
14. Uma vez que o nervo é separado da artéria pela pinça, use uma agulha curva de 25 G encaixada em uma seringa de 1 mL desse orifício para "enganchar" e segurar o nervo pela mão não dominante (Figura 4A).
    NOTA: A ponta da agulha curva é cega para não ferir o nervo e a artéria. O ângulo de curvatura da ponta da agulha é feito sob medida para cerca de 90° usando um hemostático (Figura 2).
15. Com a mão dominante, segure a agulha carregada com a mistura candidata de corante medicamentoso e pique suavemente o nervo na mesma direção em que o nervo corre, de modo que o chanfro da agulha fique voltado para cima.
    1. Para uma picada fácil, mantenha o nervo reto puxando suavemente usando o gancho de 25 G. Insira a agulha no nervo e avance para frente, mais de 0,5 cm, mantendo a agulha paralela ao nervo vago. Em seguida, puxe ligeiramente para trás para que cerca de 0,4-0,5 cm da agulha permaneça dentro do nervo.
       NOTA: O ângulo da agulha deve ser raso o suficiente para penetrar dentro do nervo sem passar para o outro lado.
16. Pode haver ocasiões em que a agulha está desobstruída fora do nervo no momento da preparação, mas a mistura candidata de corante medicamentoso não passa suavemente dentro do nervo. Para evitar essa situação, limite o número de picadas nervosas com uma única agulha não mais do que 3 vezes. Se a agulha ficar embotada, as chances de bloqueio ou injeção inadequada aumentarão.
17. Certifique-se de que a agulha esteja completamente dentro do nervo. Mantenha a posição imóvel e ligue a bomba da seringa.
    NOTA: Verifique cuidadosamente no local da injeção para ver se a mistura candidata de corante medicamentoso não está refluindo para fora do nervo.
18. Enquanto a injeção estiver em andamento, examine constantemente se a infusão permanece dentro do nervo e flui suavemente. Use a marca feita no tubo de infusão para monitorar o movimento da mistura de corante a partir do ponto de partida.
    1. Se a mistura candidata de corante medicamentoso não estiver fluindo suavemente, puxe a agulha para fora e repita a etapa de primer (etapa 5.2). Em seguida, reinsira a agulha no nervo e retome a infusão.
19. O nervo começa a desenvolver a cor do corante (Figura 4B). Continue a infusão a 0,5 μL / min por 10 min para infundir todos os 5 μL da mistura candidata de medicamento e corante.
    NOTA: Recomenda-se irrigar os tecidos expostos com uma pequena quantidade de solução salina estéril quente a 0,9%, conforme necessário, para evitar ressecamento excessivo e danos.
20. Depois que os 5 μL forem infundidos e a bomba da seringa parada, mantenha a agulha no lugar por mais 1 minuto para permitir que toda a mistura candidata de medicamento e corante se espalhe do local da injeção. Remova a agulha.
21. Remova a agulha curva de 25 G. Use pontas de algodão estéreis para mover suavemente os lenços de volta ao seu local original. Remova as pontas do retrator.
22. Feche a ferida com uma sutura não absorvível (sutura absorvível também pode ser usada). Aplique uma pequena quantidade de cola de tecido entre os pontos, se necessário, para fechar a ferida perfeitamente.

8. Cuidados pós-operatórios de um rato

1. Infundir cerca de 3 mL de solução salina morna a 0,9% por via subcutânea após o fechamento da ferida. Isso ajuda os ratos a se reidratarem imediatamente.
2. Coloque o rato em uma fonte de calor até que ele se recupere totalmente da anestesia para a condição normal. Observe qualquer coisa observada que seja anormal durante o processo de recuperação.
   NOTA: a duração da recuperação pode ser maior se o procedimento de injeção nervosa demorar muito.
3. Transfira o rato para sua gaiola doméstica com ração úmida no chão da gaiola. Certifique-se de que a água esteja disponível o tempo todo. Observe o rato no pós-operatório por cerca de 2 h para garantir que o rato não esteja sentindo frio.
   NOTA: Coloque o rato em uma fonte de calor por mais horas se sentir frio.
4. Monitore o rato em 12 h, 24 h, 36 h, 48 h e 72 h após a cirurgia com notas escritas de observações. Repita os analgésicos de acordo com o protocolo institucional aprovado para controlar a dor. Por exemplo, o carprofeno é administrado a uma taxa de 5 mg / kg por via subcutânea duas vezes no intervalo de 24 h. Consulte um veterinário se a dor permanecer no rato por mais de 48 h.
5. Repita a injeção subcutânea de cerca de 3 mL de solução salina morna a 0,9% em 24 h com base nas condições do rato.
6. Continue a avaliar a ferida. Certifique-se de que a ferida esteja seca e em processo de cicatrização.
   NOTA: Vermelhidão, inchaço e condição dolorosa da ferida com inatividade e embotamento do rato podem ser uma indicação de inflamação da ferida e podem justificar uma consulta veterinária adicional. Um rato com dor mostrará costas curvadas, pelagem com babados, olhos vermelhos e condição inativa. Geralmente é encontrado em um canto da gaiola.
7. Remova as suturas não absorvíveis dentro de 2 semanas após a cicatrização da ferida.

Resultados

Seis ratos adultos (3 machos e 3 fêmeas) foram utilizados no presente estudo. De seis, um rato foi injetado várias vezes para demonstrar uma condição de falha na injeção que mostra uma difusão de corante ao redor do local da injeção Figura 5A. Todos os outros ratos apresentaram injeção lisa e coloração nervosa, conforme mostrado na Figura 4B e na Figura 5B

Discussão

O método de injeção direta no nervo vago esquerdo pode ser feito com segurança e sem complicações pós-cirúrgicas em ratos. A administração de medicamentos ao nervo vago pode ser usada para atingir o sistema nervoso autônomo (SNA). Isso envolve certas etapas críticas que exigem prática e um grau moderado a alto de habilidade cirúrgica.

Este procedimento cirúrgico requer anestesia geral balanceada em ratos. O cirurgião pretende terminar a cirurg...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Tuberculin Syringe with Detachable 25 G x 5/8". Needle	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Used to connect with curved needle to pull the vagus nerve and hold it at the time of injection.
0.5% Bupivacaine Hydrochloride Injection	Hospira	NDC 0409-1162-19	Local anesthetics used to anesthetize local tissue.
100 mL 0.9% Sodium Chloride Irrigation USP	Stericare Solutions	Item #6240	Normal saline, used to rehydrate rat and tissue.
20 Blunt, Retractor Tips, 7.5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Used to pull apart and hold tissues at the time of surgery.
3 mL BD-Luer-Lok Syringe, Sterile, Single Use	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Used to inject saline in rat and fill the saline into the Polythene tubing.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Fluorescein dye visible within the nerve. Used to track injection fidelity.
Animal Weighing Scale	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Used to measure body weight of rat.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF Surgical Gloves	Ansell	ASTM D3577	Sterilie glove, it is used at the time of surgery by a surgeon.
Artificial Tears Ointment 3.5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Used in eyses to prevent excessive dryness of eyes.
Baby-Myxter Hemostat	Fine Science Tools	13013-14	Used to stop bleeding in case of emergency. Also used to bend the 25 G x 5/8" in needle.
BD Intramedic PE Tubing	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Used in the injection set up system to connect with Hamilton needle and NanoFil Needles. It also holds the injection mixture.
BD Precison Glide Needle, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Used to inject saline in rat, and to make a curved needle.
BD Precison Glide Needle, 27 G x ½"	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Used to fill sterile saline into the BD Intradermic tubing.
Benchmark Accuris ”NextPette” Variable Volume Pipette Micro Starter Setincludes 4 pipettes: 10/20/200/1000 μL, plus stand	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Used to pippette sterile solution.
Betadine, Povidine Iodine 10%	Honestmed	67618015017	Used to disinfect the surgical area.
Carprofen Injectable solution 50 mg/mL	Supplied by Covtrus (6451506845)	SKU 591149	In our case, we used diluted carprofen at the dose rate of 5 mg/kg provided by the Animal Resource Center of University of Texas Southwestern Medical Center.
Curved needle (custom made)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in needle is curved to 90 degrees with the help of a hemostat. The tip of the needle is made blunt. It needs to be sterilized before use. It is used to hook the vagus nerve and hold it at the time of separation and injection.
Dissecting microscope	Motic	SMZ-171-BLED (Binocular with Lights)	Used to magnify the crifical anatomical area at the time of vagus nerve separation, injeciton, and to check injection leakage.
Drape sheet	Dynarex	Reorder#8122	Used as drape after sterilization.
Dukal Cotton Tip Applicators, Non-Sterile	Dukal	Item 9003	Used to blunt separation of tissue, needs to sterilize before use.
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Used to separate the left vagus nerve from common carotid artery. It is curved so easy to use.
Ethicon PDS II Undyed Monofilament Suture - SUTURE, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Used in suturing the wound.
Ethilon Nylon Suture Black Monofilament	Ethicon	1856G	Used in suturing the wound if non-absorbale suture is used. Also used to hook the rat tooth to fix nose inside the nose cone.
Fine Forceps - Mirror Finish	Fine Science Tools	11412-11	Used at the time of vagus nerve separation from the common carotid artery. This is straight.
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Ued to cut tissue.
Hamilton cleaning solution	Hamilton	HT18311	Used to clean the Hamilton after use.
Hamilton Needle, 27G, Small Hub RN Needle, 2”, PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Used to connect BD Intramedic™ PE Tubing.
Hamilton Syringe , 710RN	Hamilton	7638-01	Used to hold drug at the time of vagus nerve injection.
Insulin Syringe	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	Used to inject carprofen and local anesthetics.
Lidocaine 2% Injection	Covetrus	Reorder#002468	Used to mix with Bupivacaine and inject at the site of incision.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Dye visible within the nerve, used to mix with drug so that injection mixture is visible.
Micro Bead Sterilizer with Glass Beads	Fine Science Tools	Item No. 18090-46	Used to sterilize surgical tools in between the rat surgery.
NanoFil Needles-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	Used to inject drug - dye mixture inside the vagus nerve.
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-12	Used in wound suturing.
Parafilm M Laboratory Wrapping Film, 4 Inches x 125 Feet, 1 Roll per Box, 12 Count	Honestmed	PM#996	Used to hold the aliquoted 5 uL of drug-dye mixture so that loading of drug-dye mixture into the BDTM intradermic tubing is accurate.
PDI Alcohol Prep Pads	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Used to disinfect the surgical area.
Premium Care Sterile Type VII Gauze Sponges, 8-Ply, 2" x 2"	Dukal	Item C5119	Used as cushon under the neck of rat at the time of surgery.
Press’n Seal Cling Film	Glad		Used to cover a rat at the time of surgery like a drape.
Rat Retractor Set	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Used to keep the incision open so that it is easy to separate the vagus nerve from the carotid artery.
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20.3 cm W x 25.4 cm L (8 in W x 10 in L), used to keep rat warm.
S&T Forceps - SuperGrip Tips	Fine Science Tools	00632-11	Used at the time of suturing to hold tissue without damage.
S&T Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13	Used to tight the suture.
Scalpel blade #15	Fine Science Tools	10015-00	Used to make an incision in the skin at the ventral side of neck.
Scalpel Handle-#7	Fine Science Tools	10007-12	Used to hold the scalpel blade.
Syringe Pump	KD Scientific	78-81-8052GL	Serial #D107034, Model#LEGATO-180, is a programmable pump that can pump small volume of mixture under a program.
TipOne Filter Tip Refill Starter Systems	USA Scientific	Item #1120-3510	Used to pipette the drug and dye mixture.
Vaporizer for Isoflurane, Funnel Filled	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Used to anesthetize rats.
Vetbond Tissue Adhesives	3M Science Applied to Life	ID B00016067	Used to seal tissue at the site of cut wound if suturing is not perfect.
Wahl BravMini+ Professional Cordless Clipper Kit	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Used to cut hair of rat.