Протокол прямой инъекции блуждающего нерва для крыс

Резюме

Мы представляем протокол прямой инъекции блуждающего нерва крысам, позволяющий доставлять лекарство непосредственно в нерв без осложнений после инъекции. Этот метод применяется в доклинических неврологических исследованиях с использованием манипуляций с вегетативной нервной системой. Его можно использовать для прямой инъекции нервов в другие нервы у крыс и других видов, с необходимыми модификациями.

Аннотация

Существует относительное изобилие стратегий и методологий, облегчающих доставку лекарств в центральную нервную систему. Тем не менее, доставка лекарств непосредственно в периферическую нервную систему менее распространена, и в помощь исследователям доступно меньше публикаций с подробными методами. Здесь мы описываем метод прямой инъекции нерва для доставки лекарств в периферическую нервную систему с использованием блуждающего нерва в качестве модельного нерва. Этот метод может быть использован в лечении нарушений вегетативной нервной системы путем нацеливания на левый блуждающий нерв, хотя этот общий метод инъекции может быть экстраполирован на инъекцию других нервов с незначительными модификациями. Этот метод объясняет все важнейшие этапы процедуры микрохирургии у взрослых крыс под наркозом под микроскопом. Описано использование отслеживающего красителя для облегчения мониторинга точности инъекции в режиме реального времени. Приведены иллюстрации успешных и неудачных инъекций. При правильном проведении прямые инъекции блуждающего нерва могут быть проведены безопасным способом, который хорошо переносится крысой без осложнений после родов. Например, после того, как хирурги были обучены этому методу, шесть из шести крыс были успешно введены без каких-либо осложнений. Этот метод прямой инъекции нервов в доклинических исследованиях на крысах способен доставлять агенты (включая, но не ограничиваясь генной терапией) к периферическим нервам.

Введение

Применение правильного метода введения препарата является одним из решающих факторов в достижении успешных терапевтических результатов. Несмотря на обилие методов доставки терапевтических агентов в центральную нервную систему (ЦНС), сообщается лишь о нескольких способах доставки в периферическую нервную систему (ПНС) путем прямого введения нервов. Прямая нервная инъекция, такая как инъекция в ганглии дорсального корешка (DRG) у крыс, была опробована в доклинических исследованиях для лучшего понимания механизмов боли, токсичности лекарств, переноса генов ^1,2,3 и разработки общего метода ^1,4. Дополнительные сообщения о прямой инъекции нерва включают инъекцию спинномозгового нерва⁴, инъекцию седалищного нерва¹ и инъекцию блуждающего нерва крысам⁵ и мышам⁶. Недавно был предложен метод супрахондриальной инъекции для лучшего распределения терапевтических средств в диске зрительного нерва^{у кроликов}.

DRG считается идеальным местом для прямой инъекции трансген-загруженных векторов, таких как аденоассоциированный вирус (AAV), из-за сенсорной функции клеточных тел в DRG². Описаны как хирургические, так и нехирургические методы инъекций DRG ^1,8. Однако были сделаны противоречивые выводы о согласованности результатов с безоперационным методом инъекции DRG¹. Хирургический метод, включающий частичную ламинэктомию, был признан на 100% успешным для инъекции DRG крысам без каких-либо изменений в поведенческих исходах³, а также метод с частичной остеотомией у мышей⁹. В нескольких исследованиях сообщается о методах доставки лекарств с помощью инъекций DRG, которые использовались в доклинических исследованиях генной терапии на крысах и мышах ^1,2,10. Исследования генной терапии на основе векторов с использованием локализованных инъекций могут иметь следующие преимущества: снижение экспрессии вне мишени, снижение системной токсичности, а также уменьшение вирусной нагрузки и объемов инъекций, снижение риска иммуногенных осложнений^11,12.

Метод прямой инъекции в седалищный нерв, самый длинный нерв тела, был опробован путем обнажения правого седалищного нерва на уровне средней части бедра крысы. В методе использовалась вытянутая стеклянная пипетка, оснащенная системой впрыска, управляемой микропроцессером, для введения общего объема 10 мкл красителя со скоростью потока 1,2 мкл/мин¹. Этот эксперимент показал недостаточное распределение красителя до уровня DRG, причем распределение было в основном ограничено вокруг места инъекции. Аналогичным образом, другие методы прямых инъекций нервов, такие как инъекции спинномозговых нервов, были опробованы с использованием красителя для оценки соответствующего объема инъекции и характера распределения красителя у крыс. Предполагается, что оптимальным для инъекции спинномозгового нерва является 2 мкл, в то время как 3 мкл красителя при введении DRG показали распределение как в дорсальных, так и в вентральных ганглиях корешков у крыс¹. Сообщалось, что объем для инъекции DRG мышам является оптимальным от 1,0 мкл до 1,5 мкл в зависимости от штамма и размера тела ^2,9.

Метод прямой инъекции блуждающего нерва был использован у крыс⁵ и мышей⁶ для оценки роли повреждения нервной системы или клеточной целостности в переносе человеческого α-синуклеина. Эти два исследования, проведенные одной и той же группой исследователей, описывают краткий метод прямого введения векторов AAV в левый блуждающий нерв в шейной области. У крыс метод включал в себя стеклянный капилляр с диаметром наконечника 60 мкм для введения вектора 2 мкл со скоростью потока 0,5 мкл/мин с помощью шприца Гамильтона объемом 5 мкл. Мышам вводили векторный раствор в общем объеме 750 нл со скоростью потока 160 нл/мин с помощью иглы из тупой стали 36-G, установленной на шприц NanoFil объемом 10 мкл⁶. Эти эксперименты показали, что трансген доставлялся и экспрессировался в аксонах в мосту и среднем мозге крыс и мышей. Аналогичным образом, дорсальное моторное ядро левого блуждающего нерва показало положительную иммунную реакцию на трансген. Эти данные свидетельствуют о том, что метод прямой инъекции блуждающего нерва может быть надежным методом в генной терапии, при которой клеточная трансдукция распространяется на несколько участков мозга, которые проецируют аксоны через блуждающий нерв. Однако эти методы не упоминают об использовании какого-либо красителя для отслеживания точности инъекции.

Здесь описан метод прямой инъекции в левый блуждающий нерв с использованием нетоксичных красителей для слежения, которые в значительной степени применимы исследователями в доклинических исследованиях. Обсуждаются потенциальные подводные камни, которые могут вызвать трудности в доставке лекарств, и пути их преодоления. Эти ситуации иллюстрируются картинками, чтобы показать, что делает доставку неудачной и как сделать ее успешной.

протокол

Следующий протокол проводится в соответствии с руководящими принципами институциональной этики и одобрением Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).

1. Подготовка жилья

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для взрослых крыс в возрасте не менее 2 месяцев. Более мелкие животные (включая мышей и молодых крыс) возможны, но не рекомендуются и будут значительно сложнее.

1. Обеспечьте вас влажным кормом или любой другой мягкой пищей (ветеринарным восстановительным гелем) за 48 часов до операции на блуждающем нерве. Поскольку животные могут испытывать трудности с приемом пищи после процедуры, познакомьте животных с этими продуктами до операции, чтобы помочь им познакомиться со вкусом этих продуктов и вызвать мотивацию к еде.
2. Домашних крыс по отдельности в клетке не менее чем за 1 неделю до операции, а также через 1 неделю после операции. Это позволит им акклиматизироваться к стрессу от одиночества и предотвратить расчесывание ран после операции однопометника.

2. Подготовка хирургических изделий и помещения

1. Заранее составьте список всех необходимых предметов и убедитесь, что все предметы доступны для операции.
2. Перед операцией простерилизуйте все предметы с помощью соответствующих методов стерилизации.
3. Установите стерильное операционное пространство под препарирующим микроскопом. Поместите грелку под микроскоп, чтобы крыса оставалась в тепле во время операции.
4. Поместите все хирургические материалы на операционный стол на стерильную простыню. Оставьте достаточно места для операции под препарирующим микроскопом. Убедитесь, что фокус микроскопа оптимален и охватывает операционную область, чтобы визуализировать нерв.
5. Поместите шприцевой насос близко к хирургическому этапу так, чтобы длина трубки была достаточной для достижения места инъекции.
6. Расположите хирургические инструменты сбоку от доминирующей руки хирурга.

3. Приготовление смеси препарата-кандидата и красителя для слежения

1. Убедитесь, что лекарственный препарат-кандидат разбавлен для достижения требуемой концентрации в рекомендуемом разбавителе таким образом, чтобы 5 мкл лекарственного препарата, смешанного с красителем, дают необходимое количество лекарственного препарата-кандидата, которое должно быть доставлено. Максимальный объем инъекции методом прямого блуждающего нерва рекомендуется составлять 5 мкл (включая отслеживающий краситель, см. шаг 3.2).
2. Смешайте совместимый краситель с препаратом-кандидатом, чтобы можно было отслеживать точность инъекции в режиме реального времени. Например, конечная концентрация 1% Luxol Fast Blue или 0,002% флуоресцеина являются совместимыми красителями для использования.
   ВНИМАНИЕ: Используйте краситель в его оптимальной концентрации в смеси красителя и потенциального препарата. Когда концентрация красителя в смеси слишком низкая, может быть не видно следа за инъекцией. Когда концентрация красителя слишком высока, это может привести к образованию слишком густой смеси с высокой вязкостью, что заблокирует иглу для инъекции.

4. Загрузка смеси препарата-кандидата и красителя в трубку

1. Подсоедините стеклянный шприц объемом 100 мкл со снятым поршнем к игле 27 G.
2. Подсоедините один конец стерилизованной полиэтиленовой трубки длиной около 45 см к игле 27 G.
3. Возьмите пластиковый шприц объемом 3 мл и установите на него иглу 27 G. Загрузите в шприц около 0,5 мл 0,9% физиологического раствора.
4. Заполните полиэтиленовую трубку 0,9% физиологическим раствором с открытого конца, чтобы заполнить трубку по всей длине и весь цилиндр стеклянного шприца до тех пор, пока он не выльется наружу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно избегать попадания пузырьков воздуха внутрь трубки.
5. Извлеките и выбросьте шприц объемом 3 мл и иглу.
6. Вставьте поршень шприца в цилиндр стеклянного шприца и слегка протолкните его вперед вверх до середины цилиндра.
7. Поместите стеклянный шприц в шприцевой насос.
8. Слегка отведите поршень назад с помощью шприцевого насоса, чтобы создать воздушное пространство около 1,5 см на открытом конце по длине трубки.
9. Пипеткой объемом 10 мкл пипетки нанесите не менее 5 мкл смеси красителя и потенциального препарата и капните ее на стерилизованный кусок парапленки.
10. Извлеките нужную лекарственную смесь в трубку, потянув поршень назад с помощью шприцевого насоса. Поддерживайте пузырь воздуха между 0,9% физиологическим раствором и раствором для инъекций, но в противном случае избегайте улавливания пузырьков воздуха внутри раствора для инъекций. Отметьте маркером уровень инъекционной смеси в трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушный зазор между смесью кандидата на лекарственный препарат и красителем и стерильным физиологическим раствором внутри трубки имеет решающее значение для предотвращения смешивания двух растворов.
11. Установите иглу 35 G на трубку. Закрепите иглу на чистой поверхности операционного этапа с помощью скотча так, чтобы игла не ослабла, не двигалась и не касалась ничего другого, а оставалась стерилизованной

5. Грунтовка инъекционной иглы

1. Установите программу шприцевого насоса на дозирование 0,5 μл/мин.
2. Запустите шприцевой насос примерно на 10-15 с, пока раствор для инъекций не начнет выходить из кончика иглы. Небольшое количество смеси на кончике иглы без утечки на стыке трубки и инъекционной иглы (или в любом другом месте по длине шприца, трубки или иглы) указывает на правильную установку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если крошечная капелька на кончике иглы не видна, это указывает на закупорку иглы. Закупорка иглы может произойти из-за высокой вязкости смеси лекарственного препарата и красителя, избытка воздуха, попавшего в систему, и неправильного расположения стеклянного шприца внутри шприцевого насоса. На рисунке 1 приведен пример утечки в месте соединения иглы и трубки. Прайминг имеет решающее значение, потому что он помогает определить, свободна ли игла и будет ли инъекция внутри нерва проходить гладко.

6. Подготовка крысы к операции

1. Получить массу тела крысы для расчета необходимой дозы анальгетиков. Например, карпрофен применяют в дозе 5 мг/кг подкожно крысам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией карпрофен рекомендуется хранить при температуре 4 °C.
2. Обезболивайте крысу искоферосом изофлурана со скоростью потока 3%-4% для индукции анестезии в течение примерно 2-3 минут. Уменьшите скорость потока изофлурана примерно до 1,75%-2% для поддержания анестезии.
3. Пересадите крысу на отдельный стол с установкой для эпиляции и подготовки участка. Убедитесь, что этот стол находится близко к операционному пространству.
4. Нанесите искусственную слезотечную мазь на оба глаза крысы, чтобы предотвратить чрезмерную сухость.
5. Вводите анальгетики в соответствии с утвержденным протоколом для животных для контроля боли, когда крыса приходит в сознание.
6. Побрейте операционную область машинкой для стрижки волос на вентральной стороне шеи в шейной области. Брейте примерно до 2 см перпендикулярно от средней линии с обеих сторон от подбородка до грудины.
7. Простерилизуйте участок с помощью 70% этилового спирта и 10% бетадина, трижды протерев участок поочередно спиртовым тампоном и повидон-йодом. Протрите от центра области к краям круговым узором.
8. Перенесите крысу в операционный этап под микроскопом в положении лежа на спине. Отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы визуализировать область операции в шейном отделе.

7. Проведение операции на крысах для введения кандидата непосредственно в левый блуждающий нерв (Рисунок 2, Рисунок 3 и Рисунок 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть метода потребует помощи хирурга со стороны второго человека.

1. Поместите крысу на грелку в лежачем положении под препарирующий микроскоп, связанный с установленным фонарем.
2. Зацепите зубы передней верхней челюсти крысы куском нерассасывающегося шовного материала и зафиксируйте открытый конец шва внутри носового конуса так, чтобы ноздря крысы всегда находилась внутри носового конуса на протяжении всего наркоза.
3. Расположите крысу так, чтобы ее голова лежала с левой стороны от хирурга-правши (или с правой стороны хирурга-левши). В таком положении лицевая сторона хирурга перпендикулярна телу крысы. Подложите под шею подушку из стерилизованного калибра и отрегулируйте угол шейного отдела крысы так, чтобы шейный отдел стал прямым. Это облегчит обнаружение левого блуждающего нерва и выполнение инъекции.
4. Накидывайте стерилизованную простыню на все тело крысы, оставляя операционное пространство открытым.
5. Закрепите четыре втягивающих штифта по отдельности с помощью 4 магнитных фиксаторов с эластомерами и разместите фиксаторы на четырех углах хирургической стадии.
6. Введите местные анестетики эпидермально по средней линии шейного отдела, где сделан разрез. Например, обычно используется смесь лидокаина и бупивакаина.
7. Сделайте продольный разрез кожи длиной около 2 см по средней линии между подбородком и грудиной лезвием скальпеля на вентральной стороне шеи в шейном отделе (рисунок 3А).
8. Тупыми отсоедините срезанные края кожи стерилизованными ватными кончиками.
9. Отведите края кожи в противоположные стороны от места разреза с помощью наконечников-ретракторов.
10. Отделите фасию ватными кончиками, чтобы углубиться. Оттолкните слюнные железы к боковой стороне.
11. Отделите грудино-сосцевидные мышцы ватными кончиками и отведите их в сторону с помощью булавок. По мере того, как отделение грудино-сосцевидной мышцы продвигается вширь, трахея оказывается посередине, покрытая грудиновидной мышцей (рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не оказывать давление на трахею.
12. Продвигайте разделение тканей на левой стороне трахеи крысы до тех пор, пока не появится сонная артерия, которая содержит общую сонную артерию, идущую вместе с левым блуждающим нервом.
13. Тонкими щипцами аккуратно проделайте небольшое точечное отверстие в каротидной оболочке, уделяя особое внимание тому, чтобы не травмировать сонную артерию под микроскопом. Отделите левый блуждающий нерв от общей сонной артерии с помощью тонких щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Операционная область является анатомически критической. Стенка сонной артерии толстая, скользкая и не легко травмируется, но острый кончик тонких щипцов может повредить ее, и может произойти кровотечение. При этом будьте внимательны, чтобы не травмировать нерв.
14. После того, как нерв будет отделен от артерии щипцами, используйте изогнутую иглу 25 G, установленную на шприце объемом 1 мл от этого отверстия, чтобы «зацепить» нерв и удерживать нерв недоминантной рукой (Рисунок 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик изогнутой иглы сделан тупым, чтобы не травмировать нерв и артерию. Угол кривизны кончика иглы изготавливается на заказ примерно до 90° с помощью гемостата (Рисунок 2).
15. Доминирующей рукой держите иглу, заряженную смесью кандидата на лекарственный препарат и краситель, и осторожно уколите нерв в том же направлении, в котором проходит нерв, так, чтобы скос иглы был направлен вверх.
    1. Для легкого укола держите нерв прямо, осторожно потянув за него с помощью крючка 25 G. Введите иглу в нерв и продвигайтесь вперед, более чем на 0,5 см, при этом держа иглу параллельно блуждающему нерву. Затем слегка оттяните назад так, чтобы внутри нерва осталось около 0,4-0,5 см иглы.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Угол иглы должен быть достаточно небольшим, чтобы проникнуть внутрь нерва, не проходя через другую сторону.
16. Могут быть случаи, когда игла беспрепятственно выходит за пределы нерва во время прайминга, но смесь препарата и красителя-кандидата не проходит гладко внутри нерва. Чтобы избежать такой ситуации, ограничьте количество уколов нерва одной иглой не более 3 раз. Если игла затупится, шансы на блокировку или иную некачественную инъекцию возрастут.
17. Убедитесь, что игла полностью находится внутри нерва. Удерживайте положение неподвижно и включите шприцевую помпу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно проверьте место инъекции, чтобы убедиться, что смесь препарата и красителя не вытекает обратно из нерва.
18. Пока идет инъекция, постоянно проверяйте, чтобы инфузия оставалась внутри нерва и протекала плавно. С помощью метки, сделанной на инфузионной трубке, следует следить за движением лекарственно-красящей смеси от начальной точки.
    1. Если смесь препарата и красителя течет неравномерно, вытащите иглу и повторите этап грунтовки (шаг 5.2). Затем снова введите иглу в нерв и возобновите инфузию.
19. Нерв начинает приобретать цвет красителя (рисунок 4B). Продолжайте инфузию со скоростью 0,5 мкл/мин в течение 10 мин, чтобы настоять все 5 мкл смеси кандидата на лекарственный препарат и краситель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется орошать открытые ткани небольшим количеством теплого 0,9% стерильного физиологического раствора по мере необходимости, чтобы предотвратить чрезмерную сухость и повреждение.
20. После того, как 5 мкл были введены и шприцевая помпа остановлена, удерживайте иглу на месте еще на 1 минуту, чтобы вся смесь потенциального препарата и красителя распространилась из места инъекции. Извлеките иглу.
21. Снимите изогнутую иглу 25 G. Используйте стерильные ватные кончики, чтобы аккуратно переместить салфетки на исходное место. Снимите кончики втягивающего устройства.
22. Закройте рану нерассасывающимся швом (также можно использовать рассасывающийся шов). При необходимости нанесите небольшое количество тканевого клея между швами, чтобы идеально закрыть рану.

8. Послеоперационный уход за крысой

1. Внесите около 3 мл 0,9% теплого физиологического раствора подкожно после закрытия раны. Это помогает крысам немедленно восстановить водный баланс.
2. Поместите крысу в источник тепла до тех пор, пока она полностью не оправится от анестезии до нормального состояния. Обратите внимание на все, что наблюдается в процессе выздоровления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: продолжительность восстановления может быть больше, если процедура инъекции нерва занимает много времени.
3. Пересадите крысу в домашнюю клетку с влажным кормом на полу клетки. Убедитесь, что вода всегда доступна. Наблюдайте за крысой после операции в течение примерно 2 часов, чтобы убедиться, что крыса не чувствует холода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите крысу в источник тепла на дополнительные часы, если она чувствует холод.
4. Наблюдайте за крысой через 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч и 72 ч после операции с письменными заметками наблюдений. Повторяйте анальгетики в соответствии с утвержденным протоколом для животных для контроля боли. Например, карпрофен вводят из расчета 5 мг/кг подкожно два раза с интервалом 24 ч. Обратитесь к ветеринару, если боль сохраняется у крысы более 48 ч.
5. Повторите подкожную инъекцию около 3 мл 0,9% теплого физиологического раствора через 24 ч в зависимости от состояния крысы.
6. Продолжайте осматривать рану. Убедитесь, что рана сухая и находится в процессе заживления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покраснение, отек и болезненное состояние раны с бездействием и тупостью крысы могут быть признаком воспаления раны и могут потребовать дополнительной консультации ветеринара. Крыса с болью будет иметь сгорбленную спину, взъерошенную шерсть, красные глаза и малоподвижное состояние. Обычно он находится в углу клетки.
7. Снимите нерассасывающиеся швы в течение 2 недель после заживления раны.

Результаты

В настоящем исследовании использовались шесть взрослых крыс (3 самца и 3 самки). Из шести крыс одну крысу вводили несколько раз, чтобы продемонстрировать состояние неудачной инъекции, которое показывает диффузию красителя вокруг места инъекции

Обсуждение

Метод прямой инъекции в левый блуждающий нерв может быть выполнен безопасно и без послеоперационных осложнений у крыс. Доставка лекарств к блуждающему нерву может быть использована для воздействия на вегетативную нервную систему (ВНС). Это включает в себя определенн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Tuberculin Syringe with Detachable 25 G x 5/8". Needle	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Used to connect with curved needle to pull the vagus nerve and hold it at the time of injection.
0.5% Bupivacaine Hydrochloride Injection	Hospira	NDC 0409-1162-19	Local anesthetics used to anesthetize local tissue.
100 mL 0.9% Sodium Chloride Irrigation USP	Stericare Solutions	Item #6240	Normal saline, used to rehydrate rat and tissue.
20 Blunt, Retractor Tips, 7.5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Used to pull apart and hold tissues at the time of surgery.
3 mL BD-Luer-Lok Syringe, Sterile, Single Use	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Used to inject saline in rat and fill the saline into the Polythene tubing.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Fluorescein dye visible within the nerve. Used to track injection fidelity.
Animal Weighing Scale	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Used to measure body weight of rat.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF Surgical Gloves	Ansell	ASTM D3577	Sterilie glove, it is used at the time of surgery by a surgeon.
Artificial Tears Ointment 3.5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Used in eyses to prevent excessive dryness of eyes.
Baby-Myxter Hemostat	Fine Science Tools	13013-14	Used to stop bleeding in case of emergency. Also used to bend the 25 G x 5/8" in needle.
BD Intramedic PE Tubing	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Used in the injection set up system to connect with Hamilton needle and NanoFil Needles. It also holds the injection mixture.
BD Precison Glide Needle, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Used to inject saline in rat, and to make a curved needle.
BD Precison Glide Needle, 27 G x ½"	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Used to fill sterile saline into the BD Intradermic tubing.
Benchmark Accuris ”NextPette” Variable Volume Pipette Micro Starter Setincludes 4 pipettes: 10/20/200/1000 μL, plus stand	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Used to pippette sterile solution.
Betadine, Povidine Iodine 10%	Honestmed	67618015017	Used to disinfect the surgical area.
Carprofen Injectable solution 50 mg/mL	Supplied by Covtrus (6451506845)	SKU 591149	In our case, we used diluted carprofen at the dose rate of 5 mg/kg provided by the Animal Resource Center of University of Texas Southwestern Medical Center.
Curved needle (custom made)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in needle is curved to 90 degrees with the help of a hemostat. The tip of the needle is made blunt. It needs to be sterilized before use. It is used to hook the vagus nerve and hold it at the time of separation and injection.
Dissecting microscope	Motic	SMZ-171-BLED (Binocular with Lights)	Used to magnify the crifical anatomical area at the time of vagus nerve separation, injeciton, and to check injection leakage.
Drape sheet	Dynarex	Reorder#8122	Used as drape after sterilization.
Dukal Cotton Tip Applicators, Non-Sterile	Dukal	Item 9003	Used to blunt separation of tissue, needs to sterilize before use.
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Used to separate the left vagus nerve from common carotid artery. It is curved so easy to use.
Ethicon PDS II Undyed Monofilament Suture - SUTURE, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Used in suturing the wound.
Ethilon Nylon Suture Black Monofilament	Ethicon	1856G	Used in suturing the wound if non-absorbale suture is used. Also used to hook the rat tooth to fix nose inside the nose cone.
Fine Forceps - Mirror Finish	Fine Science Tools	11412-11	Used at the time of vagus nerve separation from the common carotid artery. This is straight.
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Ued to cut tissue.
Hamilton cleaning solution	Hamilton	HT18311	Used to clean the Hamilton after use.
Hamilton Needle, 27G, Small Hub RN Needle, 2”, PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Used to connect BD Intramedic™ PE Tubing.
Hamilton Syringe , 710RN	Hamilton	7638-01	Used to hold drug at the time of vagus nerve injection.
Insulin Syringe	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	Used to inject carprofen and local anesthetics.
Lidocaine 2% Injection	Covetrus	Reorder#002468	Used to mix with Bupivacaine and inject at the site of incision.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Dye visible within the nerve, used to mix with drug so that injection mixture is visible.
Micro Bead Sterilizer with Glass Beads	Fine Science Tools	Item No. 18090-46	Used to sterilize surgical tools in between the rat surgery.
NanoFil Needles-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	Used to inject drug - dye mixture inside the vagus nerve.
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-12	Used in wound suturing.
Parafilm M Laboratory Wrapping Film, 4 Inches x 125 Feet, 1 Roll per Box, 12 Count	Honestmed	PM#996	Used to hold the aliquoted 5 uL of drug-dye mixture so that loading of drug-dye mixture into the BDTM intradermic tubing is accurate.
PDI Alcohol Prep Pads	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Used to disinfect the surgical area.
Premium Care Sterile Type VII Gauze Sponges, 8-Ply, 2" x 2"	Dukal	Item C5119	Used as cushon under the neck of rat at the time of surgery.
Press’n Seal Cling Film	Glad		Used to cover a rat at the time of surgery like a drape.
Rat Retractor Set	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Used to keep the incision open so that it is easy to separate the vagus nerve from the carotid artery.
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20.3 cm W x 25.4 cm L (8 in W x 10 in L), used to keep rat warm.
S&T Forceps - SuperGrip Tips	Fine Science Tools	00632-11	Used at the time of suturing to hold tissue without damage.
S&T Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13	Used to tight the suture.
Scalpel blade #15	Fine Science Tools	10015-00	Used to make an incision in the skin at the ventral side of neck.
Scalpel Handle-#7	Fine Science Tools	10007-12	Used to hold the scalpel blade.
Syringe Pump	KD Scientific	78-81-8052GL	Serial #D107034, Model#LEGATO-180, is a programmable pump that can pump small volume of mixture under a program.
TipOne Filter Tip Refill Starter Systems	USA Scientific	Item #1120-3510	Used to pipette the drug and dye mixture.
Vaporizer for Isoflurane, Funnel Filled	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Used to anesthetize rats.
Vetbond Tissue Adhesives	3M Science Applied to Life	ID B00016067	Used to seal tissue at the site of cut wound if suturing is not perfect.
Wahl BravMini+ Professional Cordless Clipper Kit	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Used to cut hair of rat.