MEDUSA לזיהוי גנים מווסתים למוות בנתוני פרופיל כימו-גנטי

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בשיטה האנליטית של MEDUSA כדי לכמת את השפעת ויסות המוות של כל נוקאאוט של גן. הוא כולל הוראות לקביעת תנאי ניסוי המייעלים את הרגישות והדרכה שלב אחר שלב לביצוע הניתוח.

Abstract

ניתן להשתמש בסריקה שיטתית של הפרעות גנטיות של רווח או אובדן תפקוד כדי לאפיין את התלות הגנטית ומנגנוני הוויסות עבור כל תהליך תאי מעניין. ניסויים אלה כוללים בדרך כלל פרופיל ממאגר של הפרעות בגן בודד וכיצד כל הפרעה גנטית משפיעה על הכושר היחסי של התא. כאשר מיושמים בהקשר של מחקרי יעילות תרופות, המכונים לעתים קרובות פרופיל כימו-גנטי, שיטות אלה אמורות להיות יעילות בזיהוי מנגנוני הפעולה של התרופות. למרבה הצער, מחקרי פרופיל כימו-גנטי מבוססי כושר אינם יעילים בזיהוי כל המרכיבים של תגובה לתרופה. לדוגמה, מחקרים אלה בדרך כלל אינם מצליחים לזהות אילו גנים מווסתים מוות תאי הנגרם על ידי תרופות. מספר נושאים תורמים לטשטוש ויסות המוות במסכים מבוססי כושר, כולל ההשפעות המבלבלות של שינויים בקצב ההתפשטות, שונות בתיאום המושרה על ידי תרופות בין גדילה למוות, ובמקרים מסוימים, חוסר היכולת להפריד DNA מתאים חיים ומתים. MEDUSA היא שיטה אנליטית לזיהוי גנים מווסתים למוות בנתוני פרופיל כימו-גנטי קונבנציונלי. זה עובד על ידי שימוש בסימולציות חישוביות כדי להעריך את שיעורי הצמיחה והתמותה שיצרו פרופיל כושר נצפה במקום לדרג את הכושר עצמו. שימוש יעיל בשיטה תלוי בטיטרציה אופטימלית של תנאי הניסוי, כולל מינון התרופה, גודל האוכלוסייה ההתחלתי ואורך הבדיקה. כתב יד זה יתאר כיצד להגדיר מחקר פרופיל כימו-גנטי לניתוח מבוסס MEDUSA, ונדגים כיצד להשתמש בשיטה כדי לכמת את שיעורי התמותה בנתוני פרופיל כימו-גנטי.

Introduction

בפרופיל כימו-גנטי, הפרעות גנטיות שיטתיות משמשות להבנת התרומה של כל גן לתגובה נתונה לתרופה ^1,2,3. ניסויים אלה הם בעלי ערך ויכולים לחשוף תובנות חשובות לגבי תגובות לתרופות, כולל יעד הקישור של התרופה ומנגנוני זרם/פליטת תרופות. עם זאת, מכיוון שניסויים אלה מבוצעים בדרך כלל בצורה מאוגדת המעריכה את כל הגנים בו זמנית, הפקת תובנות מכניסטיות מנתוני פרופיל כימו-גנטי יכולה להיות מאתגרת.

מנגנוני הבקרה והתלות הגנטית למוות תאים הנגרם על ידי תרופות נוטים להיות מאתגרים לפתרון בנתוני פרופיל כימו-גנטי. ישנן מספר סיבות לבעיה זו, אך רבות מהן נובעות מההשפעות של שונות בהתפשטות התאים⁴. לדוגמה, מכיוון שתאים מתרבים באופן אקספוננציאלי, להשפעה של הפרעה גנטית על קצב ההתפשטות יש השפעה גדולה יותר על גודל האוכלוסייה מאשר שינוי שיעורי התמותה של התאים. יתר על כן, מכיוון שרגישות מוטה זו מחמירה עם הזמן ומכיוון שניסויים אלה מבוצעים בדרך כלל במשך מספר שבועות, רוב המחקרים מותאמים להיות רגישים מאוד לפגמים בהתפשטות ולמעשה לא רגישים לשינויים במוות תאים הנגרם על ידי תרופות. סוגיות אחרות הקשורות להתפשטות כוללות תיאום שונה בין התפשטות למוות (למשל, כמה מהר כל שיבוט גדל תוך כדי מוות, והאם זה משתנה בין הפרעות גנטיות) והשינויים בשיעורי ההתפשטות עבור כל שיבוט בהיעדר תרופה, מה שמשנה את מספר התאים הצפוי שהיו צריכים/יכולים להתאושש אם התרופה לא הייתה יעילה. השורה התחתונה היא שניסויי פרופיל כימו-גנטי בדרך כלל מדרגים את ההשפעה של הפרעות גנטיות באמצעות מדידות פרופורציונליות לגודל האוכלוסייה היחסי, תוך השוואה בין אוכלוסיות מטופלות ולא מטופלות. מכיוון שגודל האוכלוסייה הוא תוצר של צמיחת התאים ושיעורי המוות של התאים, מנקודת המבט של מוות תאי, התפשטות מייצגת השפעה מבלבלת.

כדי לתקן בעיות אלה, יצרנו שיטה להערכת מוות באמצעות גישה בסיוע סימולציה (MEDUSA)⁵. MEDUSA פועלת על ידי פירוש נתוני גודל האוכלוסייה היחסי שנצפו דרך עדשת הסימולציות החישוביות כדי להסיק את השילוב של שיעורי צמיחה ותמותה הנגרמת על ידי תרופות שיצרו את התגובה התרופתית הנצפית עבור כל שיבוט גנטי. נתונים קודמים מצביעים על כך שהשיטה יכולה להסיק במדויק כיצד הפרעות גנטיות משפיעות על שיעור התמותה הנגרמת על ידי תרופות, אך הדיוק של שיטה זו תלוי בהבנה מפורטת של אופן התפשטות התאים ומוות התאים על ידי תרופה וכיצד שיעורים אלה משתנים לאורך זמן ^5,6. בנוסף, מסקנות מבוססות MEDUSA דורשות בדיקת תרופה במינון הגורם למוות תאי משמעותי. חשוב לציין, תנאי הסימום הללו יוצרים חששות נוספים לגבי גודל האוכלוסייה ההתחלתית ואורך הבדיקה, שיש לשקול בזהירות ולייעל אותם. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד להגדיר מחקר פרופיל כימו-גנטי לניתוח מבוסס MEDUSA ומספקים שימוש מפורט בשיטה אנליטית זו. המטרה הכוללת של MEDUSA היא לקבוע כיצד כל מחיקת גן משפיעה על שיעורי הצמיחה והתמותה הנגרמת על ידי תרופות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. אופטימיזציה של מינון התרופה כדי לגרום למוות תאי

הערה: הפרוטוקול שלהלן מיועד לאופטימיזציה של שילוב אחד של קו תאים, תרופה ומינון באמצעות בדיקת FLICK ^7,8. הנתונים לדוגמה לפרוטוקול זה מתארים את האופטימיזציה וההקרנה של 5 מיקרומטר אטופוסיד בתאי U2OS, אך ניתן ליישם את אותם שלבי אופטימיזציה על כל שילוב רצוי אחר של קו תאים ותרופה/מינון. פרוטוקול זה אינו דורש איסוף או ניתוח של תאים מתים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עבור תרביות תרחיף, בתנאי שתאים מתים מוסרים. עבור תרביות תרחיף, ניתן למיין/להפריד תאים מתים באמצעות סמן כדאיות או סמן ספציפי למוות תאי.

1. לפני ביצוע בדיקת FLICK, בצע אופטימיזציה של מספר התא, חדירות Triton-X, ריכוז SYTOX והגדרות רכישת קורא צלחות באמצעות הפרוטוקול המפורט המתואר^ב-8.
2. תאי צלחת בלוחות שחורים עם תחתית שקופה של 96 בארות. צפיפות הזריעה האופיינית היא 1500-5000 תאים לבאר, ויש לייעל את המספר הזה לכל שורת תאים. דגירה על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ ולחות למשך 16-24 שעות.
3. הכן דילול תרופות במדיה המכילה את ריכוז ה-SYTOX שזוהה כאופטימלי בשלב (1.1). תרופות נבדקות בדרך כלל על פני סדרת דילול לוג המכילה 8-12 מינונים רלוונטיים מבחינה ביולוגית או קלינית.
   הערה: תרופות מסוימות יכולות לפלוט פלואורסצנטיות באותו אורך גל כמו SYTOX, מה שהופך את הכימות בבדיקה זו לבלתי אפשרי. במקרים כאלה, שימוש בגרסאות SYTOX הפולטות פלואורסצנטיות באורכי גל שונים עשוי להועיל. בנוסף, בדיקה זו אינה יכולה להעריך את התגובה לתרופות המשפיעות על הקרינה של SYTOX או מונעות מ-SYTOX להיקשר ל-DNA.
4. ליז צלחת אחת (T0) באמצעות Triton-X בריכוז האופטימלי בשלב (1.1). לאחר ליזה של תאים, השתמש בקורא צלחות כדי למדוד את הקרינה של SYTOX ולקבוע את מספר התאים ההתחלתי הכולל על סמך הקשר שנקבע אמפירית בין הקרינה למספר התא (ראה פרוטוקול FLICK ^7,8).
5. מדוד את הקרינה של SYTOX בלוחות הניסוי ב-T0 באמצעות קורא צלחות, עם הגדרות מותאמות בשלב (1.1).
6. עקוב אחר אות ה-SYTOX לאורך זמן למשך שלושה ימים. כדי להגביל את הנתונים הקינטיים המתקבלים, השתמש לפחות בשלוש נקודות זמן ביום, כל אחת בהפרש של 4 שעות.
   הערה: פרוטוקול זה מעריך מוות וצמיחה של תאים במשך 3 ימים. משך זמן זה בדרך כלל מספיק לתרופות גורמות מוות; עם זאת, ניתן לקצר או להאריך את הבדיקה כדי להתאים לתרופות עם קינטיקה חלופית של מוות.
7. לאחר נקודת הזמן הסופית, הזן את לוחות הניסוי עם Triton-X כדי לקבוע את גודל האוכלוסייה הסופי של כל מצב.
8. חשב כדאיות חלקית (FV) והתאם נתוני נקודות קצה לעקומות מינון, כמתואר בפרוטוקול FLICK ^7,8.
9. זהה מינוני תרופות הגורמים למוות של כ-50% תאים על ידי הערכת עקומות מינון ה-FV.
   הערה: זיהוי תאים מתים על ידי SYTOX מחייב הן קרע בקרום הפלזמה והן פירוק מעטפת גרעינית. ממברנות אלו זקוקות לתחזוקה רציפה, ולכן SYTOX תזהה תאים מתים ללא קשר למנגנון המוות של התאים הנגרם על ידי התרופה. עם זאת, תהליכים אלה אינם מתרחשים באותה יעילות עבור כל צורות המוות התאי, מה שעלול להשפיע על יכולתה של SYTOX למדוד תאים מתים במדויק. בנוסף, מנגנוני מוות תאים שונים ייצרו גוויות תאים ביציבות משתנה. עם זאת, מצאנו שכל צורות המוות התאי שנבדקו עד כה גורמות ל-DNA הקשור ל-SYTOX (בתוך גרעין חדיר או במצע תרבית התא). אות SYTOX זה יציב בדרך כלל לאורך בדיקה של 72 שעות אך ניתן לנטר אותו על ידי הערכת מספר התאים הכולל בתחילת ובסוף הבדיקה.

2. בחירת אורך הבדיקה

1. באמצעות נתוני FLICK שנאספו בשלב 1, חשב את השבר הקטלני (LF) של כל מצב לאורך זמן כמתואר בפרוטוקול FLICK ^7,8. התאם נתוני LF קינטיים למודל מוות מעריכי (LED), כפי שתואר קודם לכן⁹.
2. תכננו LF לאורך זמן עבור כל מנה קטלנית שזוהתה בשלב 1. בחר מינון ונקודת זמן המייצרים ~50% LF.
   הערה: חלק קטלני של ~50% מעשיר אותות חזקים וספציפיים למוות בנתוני סינון CRISPR תוך השארת מספיק תאים חיים מאחור כדי לשמור על ייצוג הספרייה⁵. עם זאת, תרופות מסוימות יוגבלו על ידי קדימות ספרותית או טווח צר של מינונים הגורמים לפנוטיפ רצוי ספציפי. אם המינון מוגבל, יש לקצר או להרחיב את נקודת הקצה של הבדיקה כדי להבטיח שהמינון הרצוי יגיע ל~50% LF. אם קטלניות של 50% אינה אפשרית, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את גודל האוכלוסייה ההתחלתית.

3. קביעת גודל האוכלוסייה ההתחלתי

1. בחר את מינון התרופה הרצוי כדי לייעל עוד יותר את הסינון על סמך האופטימיזציה לעיל.
2. תאי צלחת על כלים בגודל 10 ס"מ במדיה שלמה. כל מצב צריך להיות מצופה במשולש טכני ומספיק שכפולים ביולוגיים כך שניתן יהיה לספור תאים כל 12-24 שעות לאורך המסך, כולל נקודת הזמן T = 0.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה של מספרי תאים מצופים בנפרד עבור תאים לא מטופלים ומטופלים, בהתחשב בקצב גידול האוכלוסייה נטו וגודל התא. בדרך כלל יש לצבוע תאים בצפיפויות המביאות למפגש שאינו פוגע בבריאות התא בנקודת הקצה של הבדיקה (כלומר, עבור סוגי תאים רבים < 80% קונפלואנט). תאים מטופלים ולא מטופלים יכולים גם להיות מצופים מחדש במהלך המסך, במידת הצורך, כל עוד ייצוג הספרייה נשמר.
3. דגירה של תאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
4. הוסף את התרופה בריכוז הרצוי לצלחות הטיפול. במקביל, קצרו תאים מ-3 צלחות לא מטופלות וספרו את מספר התאים החיים באמצעות המוציטומטר. צבעו את התאים המתים בכחול טריפן (או צבע חי דומה) כדי להבטיח שרק תאים חיים ייספרו. נתונים אלה קובעים את מספר התאים בנקודת הזמן T = 0.
5. לאחר 12-24 שעות, קצרו תאים מ-3 צלחות לא מטופלות ו-3 מטופלות וספרו את מספר התאים החיים. חזור על הקטיף עד להגעה לנקודת הסיום של הבדיקה. כדי להבין באופן מלא את קינטיקה של התרופה ומוות תאי, מומלץ לעקוב אחר תאים חיים במשך 24-48 שעות לאחר נקודת הזמן שזוהתה בשלב (2.2).
6. דמיין שינויים בכדאיות על ידי התוויית גודל האוכלוסייה (ציר y) לאורך זמן (ציר x).
   הערה: בהתבסס על מספר התאים המקסימלי שנצפה וגודל האוכלוסייה הסופי, ניתן לבצע הערכה גסה של החלק הקטלני בנקודת הקצה. יש להשוות זאת לנתוני הכדאיות החלקית והשבר הקטלני שנוצרו באמצעות מבחן FLICK (שלב 1.9 ושלב 2.2) כדי להבטיח שהכמות הצפויה של מוות תאים תושג.
7. זהה את נקודת הזמן עם גודל האוכלוסייה הקטן ביותר. בהתאם לכמות הגידול המתרחשת בנוכחות התרופה, זה יהיה בתחילת או בסוף מסך הקריספר.
8. בחר גודל אוכלוסייה התחלתי. ודא שמספר התאים ההתחלתי ממוטב כדי לשמור על כיסוי ספרייה מינימלי של 500x-1000x בכל המסך.
   הערה: לדוגמה, בספריית TKOv3 יש 70,948 sgRNAs. כדי לייצג ספרייה זו בכיסוי של פי 500, יש לשמור על לא פחות מ-35,474,000 תאים לכל שכפול לכל מצב לאורך כל הבדיקה. גודל אוכלוסיית צוואר בקבוק זה נתקל לעתים קרובות בתחילת הבדיקה או לאחר טריפסיניזציה והפחתת דגימה למצבים לא מטופלים או מתרבים. לעומת זאת, גודל האוכלוסייה של צוואר הבקבוק מוכתב לעתים קרובות על ידי גודל האוכלוסייה בנקודת הקצה של הבדיקה עבור טיפולים תרופתיים הגורמים לקטלניות משמעותית.
9. אם תרצה, חזור על האופטימיזציה לעיל על הלוחות שישמשו למסך הקריספר (למשל, צלחות 15 ס"מ) כדי לאשר שיעילות התרופה משתנה כהלכה.

4. ביצוע מסך CRISPR

הערה: ניתן לסנן תאים באמצעות שיטות סינון CRISPR מבוססות לאחר אופטימיזציה של מינון התרופה ואורך הבדיקה. פרוטוקולים מבוססים, כגון פרוטוקול סינון TKO ממעבדת מופאט^10,11, יכולים לשמש להכנת ספריית הסינון של CRISPR, לייצר וירוסים, לבצע את מסך ה-CRISPR ולהכין ספריות לריצוף (איור 1A-B). הפרוטוקול שלהלן מתאר שלבים ספציפיים לניתוח MEDUSA, שיש לבצע על נתונים ברמת הספירה לאחר ריצוף.

1. חשב את שינויי הקיפול שנצפו בניסוי עבור כל sgRNA (איור 1C) כמתואר להלן.
   1. צור טבלת ספירות ברמת sgRNA כדי להכין נתוני ריצוף לניתוח. חתוך ומפה ספריות רצף באמצעות צינורות סטנדרטיים, כמתואר ^5,12.
   2. נרמל את עומק ספריית הרצף. נרמל ספריות באופן ידני או באמצעות פונקציות מובנות כמו אלה ב-DESeq2, כמו ^ב-5,12. בצע נורמליזציה מול כל המדריכים או באמצעות הפצה של קווי יישור שאינם ממוקדים.
   3. הקצה באופן אקראי sgRNAs שאינם מכוונים לגנים שאינם מכוונים. לדוגמה, ספרייה עם ארבעה sgRNAs לכל גן צריכה להכיל ארבעה sgRNAs שאינם מכוונים לכל גן שאינו מכוון.
   4. עבור כל השוואה של עניין (לא מטופל/T0 ו/או מטופל/לא מטופל), חשב את ה-log2 (קיפול-שינוי). מומלץ לחשב זאת באמצעות התאמה פרמטרית ב-DESeq2, אם כי ניתן לבצע גם חישוב ידני של שינוי הקיפול.
   5. חתוך sgRNAs עם מספר נמוך של ספירות. אסטרטגיית החיתוך הנכונה תהיה תלויה ברמת הרעש בין שכפולים וכיצד זה משתנה על פני ספירות. תכונות אלה ישתנו בהתאם לספריית CRISPR, ויבדקו חיתוכים מרובים במקביל עבור נתונים חדשים. אסטרטגיות חיתוך נפוצות המבוססות על תקדים ספרותי כוללות הסרת 5% הנמוכים ביותר של המדריכים או הסרת מדריכים מתחת לסף נומינלי^{כלשהו 13}.
2. קבע את ההשפעה של כל נוקאאוט של גן בודד על קצב הצמיחה כמתואר להלן.
   1. חשב את קצב גידול האוכלוסייה נטו (NPG) של התאים הלא מטופלים (כלומר, זמן הכפלת האוכלוסייה שנצפה, איור 1D). ניתן לחלץ זאת מנתוני FLICK בשלב 1, ספירת תאים חיים לאורך זמן בשלב 3, או מדידות ניסיוניות קודמות עבור קו התא המעניין.
   2. MEDUSA דורשת שלושה פרמטרים כדי למדל את המצב הלא מטופל: NPG: קצב גידול אוכלוסייה נטו, בהכפלות לשעה; _התחלה T: נקודת זמן התחלה, ב-h. אפשרות זו מוגדרת כברירת מחדל של 0; Tend_unt: נקודת הזמן הסופית למצב הלא מטופל, ב-h.
   3. לדמות את כל ההפרעות האפשריות לקצב ה-NPG. השתמש בלולאת for כדי להעריך טווח של ערכי NPG אפשריים. עבור כל קצב גידול יחסי, חשב את ה-log2 (שינוי קיפול) שייצפה בנקודת הסיום של הבדיקה.
   4. עבור כל sgRNA ניסיוני בשלב 4.1.5, זהה את שינוי הקיפול המדומה הקרוב ביותר לנתונים שנצפו. הקצה את קצב הצמיחה היחסי שהביא לשינוי הקיפול המדומה לאותו sgRNA.
3. אפיינו את התיאום בין צמיחה למוות כמתואר להלן.
   הערה: ניתן לחלץ את הפרמטרים הנדרשים עבור MEDUSA מנתונים בסגנון FLICK כאשר מנתחים אותם בשיטת הניתוח GRADE¹⁴. ניתן להשתמש בנתונים מ-(1) ו-(2) לשם כך, או לבצע ניסוי פרמטריזציה נוסף.
   1. MEDUSA משתמשת בארבעה פרמטרים כדי לאפיין את התיאום בין גדילה למוות בנוכחות_{תרופה: GR drug1}: קצב גדילה הנגרמת על ידי תרופה לפני תחילת המוות, בהכפלה לשעה; _DO: זמן תחילת המוות, ב-h; _{GR drug2}: קצב גדילה המושרה על ידי תרופות לאחר הופעת המוות, בהכפלה לשעה; _תרופת DR: שיעור תמותה הנגרמת על ידי תרופות, ביחידות של שבר קטלני לשעה. כדי להגדיר פרמטרים של D_O, השתמש בקינטיקה של LF. חלץ את זמן תחילת המוות מהתאמת LED.
4. קבע_תרופת DR באמצעות קינטיקה LF. קבע את שיעור התמותה הממוצע על ידי חלוקת ה-LF הסופי בזמן שלאחר הופעת המוות (ב-h).
5. קבע_{תרופת GR 1} מנתוני ספירת התאים החיים בשלב 3. לפני תחילת המוות, קבע את קצב הצמיחה הנגרמת על ידי תרופה על ידי התאמת הנתונים למשוואה מעריכית פשוטה.
   1. קבע_{תרופת GR 2} באמצעות שילוב של נתונים משלב 3 ותרופה בדרגה¹⁴. חשב ושרטט את ה-GRADE עבור מינון התרופה שנבחר בתרשים GRADE. אם GRADE = 0, נניח_{ש-GR drug2} הוא 0; אם הפונקציה GRADE > 0, השתמש בפונקציה GRADE כדי לקבוע את קצב הגידול הממוצע של האוכלוסייה. בהתבסס על הערך שנקבע בניסוי עבור_{תרופת GR1}, קבע את הערך עבור_{תרופת GR2} המביא לקצב הצמיחה הממוצע שנצפה.
      הערה: ניתן להסיק את קצב הצמיחה הממוצע המושרה על ידי תרופה מתרשים GRADE על ידי חישוב המרחק הזוגי בין נקודת הנתונים הנצפית (כלומר, זוג נתוני GR ו-FV עבור תרופה) לבין כל נקודה המרכיבה את מרחב ה-GRADE וזיהוי הנקודה הקרובה ביותר. להוראות מפורטות, ראה אסמכתא¹⁴. שיעורי גדילה ושיעורי תמותה הנגרמת על ידי תרופות אינם ערכים קבועים לתרופה והם ספציפיים לתרופה במינון נתון בהקשר של תא נתון.
6. צור שינויי קיפול מדומים עבור כל השילובים האפשריים של קצב גדילה ושיעור תמותה כמתואר להלן.
   1. באמצעות התיאום שנקבע בניסוי של קצב הגדילה ושיעור התמותה הנגרמת על ידי תרופות, בנו מודל המדמה את גודל האוכלוסייה המושרה על ידי תרופות לאורך זמן (איור 1D). ניתן לבנות מודל זה כפונקציה חלקית המשלבת שני שלבים בלתי תלויים של תגובת התרופה (זמן לפני ואחרי הופעת המוות).
   2. למודל MEDUSA מלא, כלול את שמונת הפרמטרים הבאים: NPG: שיעור גידול אוכלוסייה נטו, בהכפלות לשעה; _{תרופת GR 1}: קצב גדילה המושרה על ידי תרופה לפני תחילת המוות, בהכפלה לשעה; _DO: זמן תחילת המוות, ב-h; _{GR drug2}: קצב גדילה המושרה על ידי תרופות לאחר הופעת המוות, בהכפלה לשעה; _תרופת DR: שיעור תמותה הנגרמת על ידי תרופות, ביחידות של שבר קטלני לשעה; _התחלה T: נקודת זמן התחלה, ב-h. אפשרות זו מוגדרת כברירת מחדל של 0; Tend_unt: נקודת הזמן הסופית עבור המצב הלא מטופל, ב-h; Tend_tr: נקודת הזמן הסופית למצב המטופל, ב-h.
   3. עבור המודל הבסיסי, דמו את כל ההפרעות האפשריות בגדילה ובשיעור התמותה. עבור כל שילוב, חשב את log2 (קיפול-שינוי) שייצפה.
      הערה: ב-MEDUSA, ההנחה היא שההפרעות בקצב הגידול הן פרופורציונליות בין NPG,_{GR drug1 ו-GR drug2}. לדוגמה, ירידה של 80% בשיעור ה-NPG מביאה גם לירידה של 80% בשיעורי הצמיחה הנגרמת על ידי תרופות.
7. להסיק את שיעור התמותה של כל נוקאאוט (איור 1D-E) כמתואר להלן.
   1. עבור כל sgRNA, משולש את שיעור התמותה הנגרם על ידי תרופה שהיה מייצר את שינוי הקפל שנצפה. ראשית, חלץ את קצב הצמיחה היחסי שנקבע בשלב (4.2.4).
   2. קבע שיעורים עבור_{תרופת GR 1 ותרופת GR 2}. החל את קצב הגידול היחסי מ-NPG כדי לחשב קצב גדילה פרופורציונלי עבור_{תרופת GR1}/GR₂.
   3. באמצעות האילוצים ל-NPG, GR_{drug1 ו-GR drug2}, זהה את שינוי הקפל המדומה הקרוב ביותר לשינוי הקפל שנצפה עבור כל sgRNA (מטופל/לא מטופל). השתמש בשילוב של תצפיות אלה כדי לחשב לאחור את שיעור התמותה הנגרמת מסמים.
8. חשב את שיעורי הגדילה ושיעורי התמותה ברמת הגן כמתואר להלן.
   1. קבע את שיעורי רמת הגן עבור כל גן בספרייה. חשב את הממוצע עבור כל קצב גדילה ושיעור תמותה עבור כל ה-sgRNAs הקשורים לגן נתון (בדרך כלל 4-10).
   2. כדי לחשב ערכי p אמפיריים, אתחל את הנתונים ברמת sgRNA. בצע תיקון FDR עם נוהל בנימיני-הוכברג.
      הערה: הוראות משלימות, כמו גם נתונים לדוגמה לניתוח נתוני סינון CRISPR באמצעות MEDUSA, כלולים במאגר GitHub שלנו (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, חקרנו את התלות הגנטית של מוות המושרה על ידי אטופוסיד בתאי U2OS. אטופוסיד היא כימותרפיה נפוצה הפוגעת ב-DNA¹⁵. ניסוי פרופיל כימו-גנטי זה בוצע באמצעות ספריית GeCKOv2¹⁶ ב-Cas9 המבטאת תאי U2OS⁵. בניסויים מסוג זה, תפקוד הגנים מוסק ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש בשיטה האנליטית של MEDUSA לכימות נתוני פרופיל כימו-גנטי כדי להעריך כיצד הפרעות גנטיות משנות את שיעורי הגדילה והתמותה הנגרמות על ידי תרופות. מכיוון שהתוצר העיקרי של ניסוי פרופיל כימו-גנטי קשור לגודל האוכלוסייה, לא לשיעורים, השיעורים הבסיסי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012924	For growing cells and optimizing population size
150mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012925	For growing cells and optimizing population size
DESeq2	R Package	v1.44.0	For calculating fold-change
DMEM	Corning	10017CV	For seeding and drugging cells
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	For seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate	Greiner	655090	For seeding and drugging cells
MATLAB	Mathworks	R2024a	For performing FLICK, GRADE, and MEDUSA
Microplate fluorescence reader	Tecan	Spark	For dead cell measurements
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	For dead cell measurements
TKOV3 CRISPR library	Addgene	125517	For performing CRISPR screen
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	For permeabilizing cells
Trypan blue	Corning	MT25900CI	For measure live/dead cells