Kemo-genetik Profilleme Verilerinde Ölüm Düzenleyici Genlerin Tanımlanması için MEDUSA

Özet

Bu protokol, her bir gen nakavtının ölüm düzenleyici etkisini ölçmek için MEDUSA analitik yönteminin nasıl kullanılacağını açıklar. Hassasiyeti optimize eden deneysel koşulların belirlenmesine ilişkin talimatlar ve analizin gerçekleştirilmesine ilişkin adım adım bir eğitim içerir.

Özet

Kazanç veya fonksiyon kaybı genetik bozulmalarının sistematik olarak taranması, esasen herhangi bir hücresel ilgilenilen süreç için genetik bağımlılıkları ve düzenleme mekanizmalarını karakterize etmek için kullanılabilir. Bu deneyler tipik olarak, tek gen bozulmalarından oluşan bir havuzdan profil oluşturmayı ve her bir genetik bozulmanın göreceli hücre uygunluğunu nasıl etkilediğini içerir. Genellikle kemo-genetik profilleme olarak adlandırılan ilaç etkinliği çalışmaları bağlamında uygulandığında, bu yöntemler ilaç etki mekanizmalarını belirlemede etkili olmalıdır. Ne yazık ki, kondisyon temelli kemo-genetik profilleme çalışmaları, bir ilaç yanıtının tüm bileşenlerini tanımlamada etkisizdir. Örneğin, bu çalışmalar genellikle hangi genlerin ilaca bağlı hücre ölümünü düzenlediğini belirlemede başarısız olur. Proliferasyon hızı değişiminin kafa karıştırıcı etkileri, büyüme ve ölüm arasındaki ilaca bağlı koordinasyondaki varyasyon ve bazı durumlarda DNA'yı canlı ve ölü hücrelerden ayıramama dahil olmak üzere, fitness temelli ekranlarda ölüm düzenlemesinin gizlenmesine katkıda bulunan çeşitli sorunlar vardır. MEDUSA, konvansiyonel kemo-genetik profilleme verilerinde ölüm düzenleyici genleri tanımlamak için analitik bir yöntemdir. Zindeliğin kendisini puanlamak yerine, gözlemlenen bir fitness profili oluşturan büyüme ve ölüm oranlarını tahmin etmek için hesaplamalı simülasyonlar kullanarak çalışır. Yöntemin etkili kullanımı, ilaç dozu, başlangıç popülasyon büyüklüğü ve testin uzunluğu dahil olmak üzere deneysel koşulların optimal şekilde adlandırılmasına bağlıdır. Bu makale, MEDUSA tabanlı analiz için bir kemo-genetik profilleme çalışmasının nasıl kurulacağını açıklayacak ve kemo-genetik profilleme verilerindeki ölüm oranlarını ölçmek için yöntemin nasıl kullanılacağını göstereceğiz.

Giriş

Kemo-genetik profillemede, her bir genin belirli bir ilaç yanıtına^katkısını anlamak için sistematik genetik bozulmalar kullanılır ^1,2,3. Bu deneyler değerlidir ve ilacın bağlanma hedefi ve ilaç akış/akış mekanizmaları dahil olmak üzere ilaç yanıtları hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, bu deneyler tipik olarak tüm genleri aynı anda değerlendiren bir havuzda gerçekleştirildiğinden, kemo-genetik profilleme verilerinden mekanik içgörüler üretmek zor olabilir.

İlaca bağlı hücre ölümü için kontrol mekanizmaları ve genetik bağımlılıklar, kemo-genetik profilleme verilerinde çözülmesi zor olma eğilimindedir. Bu sorunun birkaç nedeni vardır, ancak bunların çoğu hücre çoğalmasındaki varyasyonun etkilerinden kaynaklanmaktadır⁴. Örneğin, hücreler katlanarak çoğaldığı için, genetik bir bozulmanın çoğalma hızı üzerindeki etkisi, popülasyon büyüklüğü üzerinde hücre ölüm oranlarını değiştirmekten daha büyük bir etkiye sahiptir. Ayrıca, bu önyargılı duyarlılık zamanla şiddetlendiğinden ve bu deneyler tipik olarak birkaç hafta boyunca gerçekleştirildiğinden, çoğu çalışma proliferasyon kusurlarına karşı oldukça hassas ve ilaca bağlı hücre ölümündeki değişikliklere esasen duyarsız olacak şekilde optimize edilmiştir. Proliferasyonla ilgili diğer konular arasında proliferasyon ve ölüm arasındaki çeşitli koordinasyon (örneğin, her bir klonun ölürken ne kadar hızlı büyüdüğü ve bu genetik bozulmalar arasında farklılık gösterip göstermediği) ve ilacın yokluğunda her klon için proliferasyon oranlarındaki varyasyonlar yer alır, bu da ilacın etkili olmaması durumunda kurtarılması gereken / kurtarılabilecek beklenen hücre sayısını değiştirir. Sonuç olarak, kemo-genetik profilleme deneyleri genellikle, tedavi edilen ve tedavi edilmeyen popülasyonları karşılaştırarak, göreceli popülasyon büyüklükleriyle orantılı ölçümler kullanarak genetik bozulmaların etkisini puanlar. Popülasyon büyüklüğü hem hücre büyümesinin hem de hücre ölüm oranlarının bir ürünü olduğundan, hücre ölümü perspektifinden bakıldığında, proliferasyon kafa karıştırıcı bir etkiyi temsil eder.

Bu sorunları çözmek için, Simülasyon Destekli Bir Yaklaşım Kullanarak Ölümü Değerlendirme Yöntemi (MEDUSA) ^oluşturduk5. MEDUSA, her bir genetik klon için gözlemlenen ilaç yanıtını oluşturan ilaca bağlı büyüme ve ölüm oranlarının kombinasyonunu anlamak için gözlemlenen nispi popülasyon büyüklüğü verilerini hesaplamalı simülasyonlar merceği aracılığıyla yorumlayarak çalışır. Önceki veriler, yöntemin genetik bozulmaların ilaca bağlı ölüm oranını nasıl etkilediğini doğru bir şekilde çıkarabildiğini göstermektedir, ancak bu yöntemin doğruluğu, hücre çoğalmasının ve hücre ölümünün bir ilaç tarafından nasıl koordine edildiğinin ve bu oranların zaman içinde nasıl değiştiğinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasına bağlıdır ^5,6. Ek olarak, MEDUSA'ya dayalı çıkarımlar, önemli hücre ölümüne neden olan bir dozda test edilen bir ilacın kullanılmasını gerektirir. Daha da önemlisi, bu uyuşturucu koşulları, dikkatli bir şekilde düşünülmesi ve optimize edilmesi gereken başlangıç popülasyon büyüklükleri ve tahlil uzunlukları hakkında ek endişeler yaratmaktadır. Bu protokolde, MEDUSA tabanlı analizler için kemo-genetik profilleme çalışmasının nasıl kurgulanacağını anlatıyor ve bu analitik yöntemin detaylı bir şekilde kullanılmasını sağlıyoruz. MEDUSA'nın genel amacı, her bir gen delesyonunun ilaca bağlı büyüme ve ölüm oranlarını nasıl etkilediğini belirlemektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hücre ölümünü indüklemek için ilaç dozunun optimizasyonu

NOT: Aşağıdaki protokol, FLICK testi ^7,8 kullanılarak hücre hattı, ilaç ve dozun bir kombinasyonunu optimize etmek içindir. Bu protokol için örnek veriler, U2OS hücrelerinde 5 μM etopositin optimizasyonunu ve taranmasını açıklar, ancak aynı optimizasyon adımları, istenen diğer herhangi bir hücre hattı ve ilaç / doz kombinasyonuna uygulanabilir. Bu protokol ölü hücrelerin toplanmasını veya analiz edilmesini gerektirmez. Bu protokol, ölü hücrelerin uzaklaştırılması şartıyla süspansiyon kültürleri için kullanılabilir. Süspansiyon kültürleri için, ölü hücreler bir canlılık belirteci veya hücre ölümüne özgü bir belirteç kullanılarak sıralanabilir/ayrılabilir.

1. Bir FLICK testi gerçekleştirmeden önce,^8'de açıklanan ayrıntılı protokolü kullanarak hücre sayısını, Triton-X geçirgenliğini, SYTOX konsantrasyonunu ve plaka okuyucu edinme ayarlarını optimize edin.
2. Siyah, şeffaf tabanlı 96 oyuklu plakalarda plaka hücreleri. Tipik tohumlama yoğunlukları oyuk başına 1500-5000 hücredir ve bu sayı hücre hattı başına optimize edilmelidir. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve nem ile 16-24 saat inkübe edin.
3. Adım (1.1)'de optimal olarak tanımlanan SYTOX konsantrasyonunu içeren ortamda ilaç seyreltmelerini hazırlayın. İlaçlar tipik olarak biyolojik veya klinik olarak anlamlı 8-12 doz içeren bir log seyreltme serisinde test edilir.
   NOT: Bazı ilaçlar SYTOX ile aynı dalga boyunda floresan yayabilir ve bu da bu testle miktar tayinini imkansız hale getirir. Bu gibi durumlarda, farklı dalga boylarında floresan yayan SYTOX varyantlarının kullanılması faydalı olabilir. Ek olarak, bu tahlil, SYTOX floresansını etkileyen veya SYTOX'un DNA'ya bağlanmasını önleyen ilaçlara verilen reaksiyonu değerlendiremez.
4. Adım (0)'de optimize edilmiş konsantrasyonda Triton-X kullanarak bir plakayı (T1.1) parçalayın. Hücre lizizinden sonra, SYTOX floresansını ölçmek ve floresan ile hücre sayısı arasında ampirik olarak kurulan ilişkiye dayalı olarak toplam başlangıç hücre sayısını belirlemek için bir plaka okuyucu kullanın (bkz. FLICK protokolü ^7,8).
5. Bir plaka okuyucu kullanarak T0'daki deney plakalarındaki SYTOX floresansını ölçün ve ayarlar adım (1.1)'da optimize edilmiştir.
6. SYTOX sinyalini zaman içinde üç gün boyunca izleyin. Elde edilen kinetik verileri sınırlamak için, her biri 4 saat aralıklarla günde en az üç zaman noktası kullanın.
   NOT: Bu protokol 3 gün boyunca hücre ölümünü ve büyümesini değerlendirir. Bu süre genellikle ölüme neden olan ilaçlar için yeterlidir; Bununla birlikte, tahlil, alternatif ölüm kinetiğine sahip ilaçları barındırmak için kısaltılabilir veya uzatılabilir.
7. Son zaman noktasından sonra, her bir koşulun nihai popülasyon boyutunu belirlemek için deney plakalarını Triton-X ile parçalayın.
8. Fraksiyonel Canlılığı (FV) hesaplayın ve FLICK protokolü ^7,8'de açıklandığı gibi uç nokta verilerini doz eğrilerine uygun hale getirin.
9. FV doz eğrilerini değerlendirerek kabaca% 50 hücre ölümüne neden olan ilaç dozlarını tanımlayın.
   NOT: Ölü hücrelerin SYTOX ile tanımlanması, hem plazma zarının yırtılmasını hem de nükleer zarfın parçalanmasını gerektirir. Bu zarların sürekli bakıma ihtiyacı vardır, bu nedenle SYTOX, ilacın neden olduğu hücre ölüm mekanizmasından bağımsız olarak ölü hücreleri tanımlayacaktır. Bununla birlikte, bu süreçler, SYTOX'un ölü hücreleri tam olarak ölçme kapasitesini etkileyebilecek tüm hücre ölümü biçimleri için aynı etkinlikle gerçekleşmez. Ek olarak, farklı hücre ölüm mekanizmaları, değişen stabilitelere sahip hücre cesetleri üretecektir. Bununla birlikte, şimdiye kadar test edilen tüm hücre ölümü biçimlerinin SYTOX'a bağlı DNA ile sonuçlandığını bulduk (ya geçirgenleştirilmiş bir çekirdeğin içinde ya da hücre kültürü ortamında). Bu SYTOX sinyali genellikle 72 saatlik bir test boyunca stabildir, ancak testin başında ve sonunda toplam hücre sayısı değerlendirilerek izlenebilir.

2. Tahlil uzunluğunun seçimi

1. 1. adımda toplanan FLICK verilerini kullanarak, FLICK protokolü ^7,8'de açıklandığı gibi her koşulun zaman içindeki Ölümcül Fraksiyonunu (LF) hesaplayın. Kinetik LF verilerini, daha önce açıklandığı gibi gecikmeli üstel ölüm (LED) modeline^{sığdırın 9}.
2. Adım 1'de tanımlanan her öldürücü doz için zaman içinde LF'yi çizin. ~% 50 LF üreten bir doz ve zaman noktası seçin.
   NOT: ~%50'lik öldürücü bir fraksiyon, CRISPR tarama verilerindeki güçlü, ölüme özgü sinyalleri zenginleştirirken, kütüphane temsilini sürdürmek için yeterli canlı hücreyi geride bırakır⁵. Bununla birlikte, bazı ilaçlar literatür önceliği veya istenen belirli bir fenotipi indükleyen dar bir doz aralığı ile kısıtlanacaktır. Doz kısıtlanırsa, istenen dozun ~% 50 LF'ye ulaşmasını sağlamak için test son noktası kısaltılmalı veya uzatılmalıdır. % 50 ölümcüllük mümkün değilse, başlangıç popülasyonunun büyüklüğünün arttırılması gerekebilir.

3. Başlangıç popülasyon büyüklüğünün belirlenmesi

1. Yukarıdaki optimizasyona dayalı olarak taramayı daha da optimize etmek için istenen ilaç dozunu seçin.
2. Komple ortamda 10 cm'lik tabaklarda plaka hücreleri. Her koşul, T = 0 zaman noktası da dahil olmak üzere, ekranın uzunluğu boyunca her 12-24 saatte bir hücrelerin sayılabilmesi için teknik üçlüler ve yeterli biyolojik kopyalarla kaplanmalıdır.
   NOT: Plakalı hücre sayılarının, net popülasyon büyüme hızı ve hücre boyutu göz önünde bulundurularak, tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücreler için ayrı ayrı optimize edilmesi gerekebilir. Hücreler genellikle, tahlil uç noktasında hücre sağlığını tehlikeye atmayan bir birleşme ile sonuçlanan yoğunluklarda kaplanmalıdır (yani, birçok hücre tipi için% 80 birleşimli <). İşlenmiş ve işlenmemiş hücreler, kütüphane temsili korunduğu sürece, gerekirse ekran sırasında yeniden kaplanabilir.
3. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
4. İlacı istenen konsantrasyonda tedavi plakalarına ekleyin. Paralel olarak, işlenmemiş 3 plakadan hücreleri toplayın ve bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın. Yalnızca canlı hücrelerin sayıldığından emin olmak için ölü hücreleri tripan mavisi (veya karşılaştırılabilir bir canlı boya) ile boyayın. Bu veriler, T = 0 zaman noktasındaki hücre sayısını belirler.
5. 12-24 saat sonra, 3 işlenmemiş ve 3 işlenmiş plakadan hücreleri toplayın ve canlı hücrelerin sayısını sayın. Tahlil son noktasına ulaşılana kadar hasadı tekrarlayın. İlaç ve hücre ölümü kinetiğini tam olarak anlamak için, canlı hücrelerin adım (2.2)'de tanımlanan zaman noktasını takip eden 24-48 saat boyunca izlenmesi önerilir.
6. Zaman içinde popülasyon boyutunu (y ekseni) (x ekseni) çizerek canlılıktaki değişiklikleri görselleştirin.
   NOT: Gözlemlenen maksimum hücre sayısına ve nihai popülasyon boyutuna dayanarak, son noktadaki ölümcül fraksiyonun kabaca bir tahmini yapılabilir. Bu, beklenen hücre ölümü miktarına ulaşıldığından emin olmak için FLICK testi (adım 1.9 ve adım 2.2) kullanılarak oluşturulan fraksiyonel canlılık ve öldürücü fraksiyon verileriyle karşılaştırılmalıdır.
7. En küçük popülasyon büyüklüğüne sahip zaman noktasını belirleyin. İlacın varlığında meydana gelen büyüme miktarına bağlı olarak, bu CRISPR ekranının başında veya sonunda olacaktır.
8. Bir başlangıç popülasyon boyutu seçin. Ekran boyunca en az 500x-1000x kitaplık kapsamını korumak için başlangıç hücre sayısının optimize edildiğinden emin olun.
   NOT: Örneğin, TKOv3 kütüphanesinde 70.948 sgRNA vardır. Bu kitaplığı 500x kapsama alanında temsil etmek için, test boyunca koşul başına çoğaltma başına en az 35.474.000 hücre korunmalıdır. Bu darboğaz popülasyon büyüklüğü genellikle testin başlangıcında veya tedavi edilmemiş veya çoğalan koşullar için tripsinizasyon ve aşağı örneklemeyi takiben karşılaşılır. Buna karşılık, darboğaz popülasyon büyüklüğü genellikle önemli ölçüde ölümcüllüğe neden olan ilaç tedavileri için tahlil son noktasındaki popülasyon büyüklüğü tarafından belirlenir.
9. İstenirse, ilaç etkinliğinin doğru şekilde ölçeklendiğini doğrulamak için CRISPR ekranı için kullanılacak plakalarda (örneğin, 15 cm'lik plakalar) yukarıdaki optimizasyonu tekrarlayın.

4. CRISPR ekranının gerçekleştirilmesi

NOT: Hücreler, ilaç dozu ve tahlil uzunluğunun optimizasyonunu takiben yerleşik CRISPR tarama yöntemleri kullanılarak taranabilir. Moffat laboratuvarı^10,11'den alınan TKO tarama protokolü gibi yerleşik protokoller, CRISPR tarama kütüphanesini hazırlamak, virüs üretmek, CRISPR taramasını gerçekleştirmek ve dizileme için kütüphaneleri hazırlamak için kullanılabilir (Şekil 1A-B). Aşağıdaki protokol, sıralamayı takiben sayım düzeyindeki veriler üzerinde gerçekleştirilmesi gereken MEDUSA analizine özgü adımları açıklamaktadır.

1. Aşağıda açıklandığı gibi her bir sgRNA için deneysel olarak gözlemlenen kıvrım değişikliklerini hesaplayın (Şekil 1C).
   1. Sıralama verilerini analize hazırlamak için bir sgRNA düzeyinde sayım tablosu oluşturun. ^{5,12'de açıklandığı gibi} standart işlem hatlarını kullanarak sıralama kitaplıklarını kırpın ve eşleyin.
   2. Sıralama kitaplığı derinliğini normalleştirin. Kitaplıkları manuel olarak veya ^2'deki gibi DESeq5,12'dekiler gibi yerleşik işlevleri kullanarak normalleştirin. Tüm kılavuzlara karşı veya hedeflemeyen kılavuzların dağıtımını kullanarak normalleştirme gerçekleştirin.
   3. Hedeflemeyen genlere hedeflemeyen sgRNA'ları rastgele atayın. Örneğin, gen başına dört sgRNA'ya sahip bir kütüphane, hedeflemeyen gen başına dört hedeflemeyen sgRNA'ya sahip olmalıdır.
   4. İlgilenilen her karşılaştırma için (tedavi edilmemiş/T0 ve/veya tedavi edilmiş/tedavi edilmemiş), log2'yi (kat değişimi) hesaplayın. Bunun DESeq2'de bir parametrik uyum kullanılarak hesaplanması önerilir, ancak katlama değişikliğinin manuel olarak hesaplanması da yapılabilir.
   5. Düşük sayıda sayımla sgRNA'ları kesin. Doğru kırpma stratejisi, kopyalar arasındaki gürültü düzeyine ve bunun sayımlar arasında nasıl değiştiğine bağlı olacaktır. Bu özellikler, CRISPR kütüphanesine bağlı olarak değişecek ve yeni veriler için paralel olarak birden fazla kesmeyi test edecektir. Literatür emsallerine dayanan yaygın kesme stratejileri arasında, kılavuzların en düşük %5'inin kaldırılması veya kılavuzların bazı nominal eşiğin¹³ altına çıkarılması yer alır.
2. Her bir gen nakavtının büyüme hızı üzerindeki etkisini aşağıda açıklandığı gibi belirleyin.
   1. Tedavi edilmeyen hücrelerin net popülasyon büyüme oranını (NPG) hesaplayın (yani, gözlemlenen popülasyon iki katına çıkma süresi, Şekil 1D). Bu, 1. adımdaki FLICK verilerinden, 3. adımdaki zaman içindeki canlı hücre sayımlarından veya ilgilenilen hücre hattı için önceki deneysel ölçümlerden çıkarılabilir.
   2. MEDUSA, tedavi edilmeyen durumu modellemek için üç parametreye ihtiyaç duyar: NPG: Net Nüfus Artış hızı, iki kat/saat cinsinden; T_başlangıç: Başlangıç zaman noktası, h cinsinden. Bu, varsayılan olarak 0 olarak ayarlanmıştır; Tend_unt: Tedavi edilmeyen durum için son zaman noktası, h cinsinden.
   3. NPG hızında olası tüm bozulmaları simüle edin. Bir dizi olası NPG değerini değerlendirmek için bir for döngüsü kullanın. Her nispi büyüme oranı için, tahlil uç noktasında gözlemlenecek log2'yi (kat değişimi) hesaplayın.
   4. Adım 4.1.5'teki her deneysel sgRNA için, gözlemlenen verilere en yakın simüle edilmiş kat değişimini tanımlayın. Simüle edilmiş kat değişimiyle sonuçlanan nispi büyüme oranını bu sgRNA'ya atayın.
3. Büyüme ve ölüm arasındaki koordinasyonu aşağıda açıklandığı gibi karakterize edin.
   NOT: MEDUSA için gerekli parametreler, GRADE analiz yöntemi¹⁴ ile analiz edildiğinde FLICK tarzı verilerden çıkarılabilir. Bunun için (1) ve (2)'den gelen veriler kullanılabilir veya ek bir parametrelendirme deneyi yapılabilir.
   1. MEDUSA, ilacın varlığında büyüme ve ölüm arasındaki koordinasyonu karakterize etmek için dört parametre kullanır: GR_ilaç1: Ölüm başlangıcından önce ilaca bağlı büyüme hızı, iki kat/saat cinsinden; D_O: Ölüm başlangıç zamanı, h cinsinden; GR_ilaç2: Ölüm başlangıcından sonra ilaca bağlı büyüme hızı, iki katına / saat cinsinden; DR_ilacı: İlaca bağlı ölüm oranı, Öldürücü Fraksiyon/saat birimi cinsinden. D_O'yu parametreleştirmek için LF kinetiğini kullanın. LED uyumundan ölüm başlangıç zamanını çıkarın.
4. LF kinetiği kullanarak DR_ilacını belirleyin. Son LF'yi ölüm başlangıcını takip eden zamana (h cinsinden) bölerek ortalama ölüm oranını belirleyin.
5. Adım 3'teki canlı hücre sayımı verilerinden GR_ilacını1 belirleyin. Ölüm başlangıcından önce, verileri basit bir üstel denkleme uydurarak ilaca bağlı büyüme oranını belirleyin.
   1. Adım 3 ve ilaç GRADE^14'ten elde edilen verilerin bir kombinasyonunu kullanarak GR_ilacını2 belirleyin. Seçilen ilaç dozu için GRADE'i bir GRADE grafiği üzerinde hesaplayın ve çizin. GRADE = 0 ise, GR_ilac2'nin 0 olduğunu varsayalım; GRADE > 0 ise, popülasyonun ortalama büyüme oranını belirlemek için GRADE'i kullanın. GR_ilacı1 için deneysel olarak belirlenen değere dayanarak, gözlemlenen ortalama büyüme oranıyla sonuçlanan GR_ilac2 değerini belirleyin.
      NOT: İlacın neden olduğu ortalama büyüme hızı, gözlemlenen veri noktası (yani, bir ilaç için GR ve FV veri çifti) ile GRADE uzayını oluşturan her nokta arasındaki ikili mesafenin hesaplanması ve en yakın noktanın belirlenmesi yoluyla bir GRADE grafiğinden çıkarılabilir. Ayrıntılı talimatlar için ref^14'e bakın. İlaca bağlı büyüme oranları ve ölüm oranları, ilaç başına sabit değerler değildir ve belirli bir hücre bağlamında belirli bir dozdaki bir ilaca özgüdür.
6. Aşağıda açıklandığı gibi tüm olası büyüme oranı ve ölüm oranı kombinasyonları için simüle edilmiş kat değişiklikleri oluşturun.
   1. İlaca bağlı büyüme hızı ve ölüm oranının deneysel olarak belirlenmiş koordinasyonunu kullanarak, zaman içinde ilaca bağlı popülasyon büyüklüğünü simüle eden bir model oluşturun (Şekil 1D). Bu model, ilaç yanıtının iki bağımsız aşamasını (ölüm öncesi ve sonrası başlangıç zamanı) birleştiren parça bazında bir fonksiyon olarak oluşturulabilir.
   2. Tam bir MEDUSA modeli için şu sekiz parametreyi dahil edin: NPG: Net Nüfus Artış hızı, iki kat/saat cinsinden; GR_ilaç1: Ölüm başlangıcından önce ilaca bağlı büyüme hızı, iki katına / saat cinsinden; D_O: Ölüm başlangıç zamanı, h cinsinden; GR_ilaç2: Ölüm başlangıcından sonra ilaca bağlı büyüme hızı, iki katına / saat cinsinden; DR_ilacı: İlaca bağlı ölüm oranı, Öldürücü Fraksiyon/saat birimlerinde; T_başlangıç: Başlangıç zaman noktası, h cinsinden. Bu, varsayılan olarak 0 olarak ayarlanmıştır; Eğilim_unt: Tedavi edilmeyen durum için son zaman noktası, h cinsinden; Eğilim_tr: Tedavi edilen durum için h cinsinden son zaman noktası.
   3. Temel model için, olası tüm büyüme ve ölüm oranı bozulmalarını simüle edin. Her kombinasyon için, gözlemlenecek log2'yi (katlama değişimi) hesaplayın.
      NOT: MEDUSA'da, büyüme hızındaki bozulmaların NPG, GR_ilacı1 ve GR_ilacı2 arasında orantılı olduğu varsayılmaktadır. Örneğin, NPG oranındaki %80'lik bir azalma, ilaca bağlı büyüme oranlarının her ikisinde de %80'lik bir azalmaya neden olmaktadır.
7. Her bir nakavtın ölüm oranını (Şekil 1D-E) aşağıda açıklandığı gibi çıkarın.
   1. Her sgRNA için, gözlemlenen kıvrım değişikliğini üretecek olan ilaca bağlı ölüm oranını üçgenleyin. İlk olarak, adım (4.2.4)'te belirlenen nispi büyüme oranını çıkarın.
   2. GR_ilacı1 ve GR_ilacı2 için oranları belirleyin. GR_ilacı1/GR_ilacı2 için orantılı bir büyüme oranı hesaplamak için NPG'den nispi büyüme oranını uygulayın.
   3. NPG, GR_ilacı1 ve GR_ilacı2 ile ilgili kısıtlamaları kullanarak, her bir sgRNA (tedavi edilmiş/tedavi edilmemiş) için gözlemlenen kıvrım değişikliğine en yakın simüle edilmiş kıvrım değişimini belirleyin. İlaca bağlı ölüm oranını geriye doğru hesaplamak için bu gözlemlerin bir kombinasyonunu kullanın.
8. Gen düzeyinde büyüme oranlarını ve ölüm oranlarını aşağıda açıklandığı gibi hesaplayın.
   1. Kütüphanedeki her gen için gen düzeyi oranlarını belirleyin. Belirli bir genle ilişkili tüm sgRNA'lar için her büyüme hızı ve ölüm oranı için ortalamayı hesaplayın (tipik olarak 4-10).
   2. Ampirik p değerlerini hesaplamak için sgRNA düzeyindeki verileri önyükleyin. Benjamini-Hochberg prosedürü ile bir FDR düzeltmesi yapın.
      NOT: MEDUSA kullanarak CRISPR tarama verilerini analiz etmek için tamamlayıcı talimatların yanı sıra örnek veriler GitHub depomuzda (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA) yer almaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, U2OS hücrelerinde etoposid kaynaklı ölümün genetik bağımlılıklarını araştırdık. Etoposid, yaygın olarak kullanılan DNA'ya zarar veren bir kemoterapidir¹⁵. Bu kemo-genetik profilleme deneyi, Cas9'da U2OS hücreleri^5'i eksprese eden GeCKOv2 kütüphanesi¹⁶ kullanılarak gerçekleştirildi. Bu tür deneylerde, gen fonksiyonu tipik olarak, ilaçla tedavi edilen ve tedavi edilmeye...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolde, genetik bozulmaların ilaca bağlı büyüme ve ölüm oranlarını nasıl değiştirdiğini puanlamak için kemo-genetik profilleme verilerini ölçmek için MEDUSA analitik yönteminin kullanımını açıklıyoruz. Bir kemo-genetik profilleme deneyinin birincil çıktısı, oranlarla değil, popülasyon büyüklüğü ile ilgili olduğundan, altta yatan oranlar simülasyonlar kullanılarak çıkarılır. Bu nedenle, yöntemdeki kritik adımlar, tedavi edilmemiş hücre ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012924	For growing cells and optimizing population size
150mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012925	For growing cells and optimizing population size
DESeq2	R Package	v1.44.0	For calculating fold-change
DMEM	Corning	10017CV	For seeding and drugging cells
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	For seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate	Greiner	655090	For seeding and drugging cells
MATLAB	Mathworks	R2024a	For performing FLICK, GRADE, and MEDUSA
Microplate fluorescence reader	Tecan	Spark	For dead cell measurements
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	For dead cell measurements
TKOV3 CRISPR library	Addgene	125517	For performing CRISPR screen
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	For permeabilizing cells
Trypan blue	Corning	MT25900CI	For measure live/dead cells