MEDUSA для идентификации генов, регулирующих смертность, в данных химиогенетического профилирования

Резюме

В этом протоколе описывается, как использовать аналитический метод MEDUSA для количественной оценки смертельного регуляторного эффекта каждого нокаута гена. Он включает в себя инструкции по определению экспериментальных условий, оптимизирующих чувствительность, и пошаговое руководство по проведению анализа.

Аннотация

Систематический скрининг генетических возмущений, приводящих к приобретению или потере функции, может быть использован для характеристики генетических зависимостей и механизмов регуляции практически любого клеточного процесса, представляющего интерес. Эти эксперименты обычно включают в себя профилирование на основе пула возмущений одного гена и того, как каждое генетическое возмущение влияет на относительную приспособленность клетки. При применении в контексте исследований эффективности лекарств, часто называемых химико-генетическим профилированием, эти методы должны быть эффективными для выявления механизмов действия лекарств. К сожалению, исследования химиогенетического профилирования, основанные на физической подготовке, неэффективны для идентификации всех компонентов лекарственного ответа. Например, эти исследования, как правило, не могут определить, какие гены регулируют гибель клеток, вызванную лекарствами. Несколько проблем способствуют сокрытию регуляции смертности в скринингах, основанных на физической подготовке, в том числе сбивающие с толку эффекты изменения скорости пролиферации, вариации в вызванной лекарствами координации между ростом и смертью и, в некоторых случаях, неспособность отделить ДНК от живых и мертвых клеток. MEDUSA — это аналитический метод идентификации генов, регулирующих смерть, в обычных данных химико-генетического профилирования. Он работает с использованием вычислительного моделирования для оценки темпов роста и смертности, которые создали наблюдаемый профиль физической формы, а не для оценки самой физической формы. Эффективность использования метода зависит от оптимального титрования условий эксперимента, включая дозу препарата, начальный размер популяции и продолжительность анализа. В этой рукописи будет описано, как организовать исследование химико-генетического профилирования для анализа на основе MEDUSA, и мы продемонстрируем, как использовать этот метод для количественной оценки смертности в данных химико-генетического профилирования.

Введение

В химико-генетическом профилировании систематические генетические возмущения используются для понимания вклада каждого гена в данный ответ на лекарственное средство ^1,2,3. Эти эксперименты являются ценными и могут раскрыть важную информацию о реакциях лекарств, в том числе о мишени связывания препарата и механизмах притока/оттока лекарств. Однако, поскольку эти эксперименты обычно проводятся в объединенном режиме, который оценивает все гены одновременно, получение механистических идей из данных химико-генетического профилирования может быть сложной задачей.

Механизмы контроля и генетические зависимости от лекарственно-индуцированной гибели клеток, как правило, сложно определить в данных химико-генетического профилирования. Существует несколько причин этой проблемы, но многие из них проистекают из влияния вариаций в клеточной пролиферации^. Например, поскольку клетки пролиферируют экспоненциально, влияние генетического возмущения на скорость пролиферации оказывает большее влияние на размер популяции, чем изменение скорости гибели клеток. Кроме того, поскольку эта смещенная чувствительность со временем усугубляется и поскольку эти эксперименты обычно проводятся в течение нескольких недель, большинство исследований оптимизированы таким образом, чтобы быть высокочувствительными к дефектам пролиферации и по существу нечувствительными к изменениям в клеточной смерти, вызванной лекарственными препаратами. Другие вопросы, связанные с пролиферацией, включают в себя различную координацию между пролиферацией и смертью (например, как быстро растет каждый клон, одновременно умирая, и варьируется ли это в зависимости от генетических возмущений) и вариации в темпах пролиферации для каждого клона в отсутствие лекарства, что изменяет ожидаемое количество клеток, которые должны были / могли бы быть восстановлены, если бы препарат не был эффективным. Суть в том, что эксперименты по химико-генетическому профилированию обычно оценивают влияние генетических возмущений, используя измерения, пропорциональные относительным размерам популяции, сравнивая обработанные и необработанные популяции. Поскольку размер популяции является продуктом как роста клеток, так и скорости их гибели, с точки зрения клеточной смерти, пролиферация представляет собой искажающее влияние.

Чтобы решить эти проблемы, мы создали метод оценки смерти с использованием симуляционного подхода (MEDUSA)⁵. MEDUSA интерпретирует наблюдаемые данные об относительном размере популяции через призму компьютерного моделирования, чтобы сделать вывод о комбинации вызванного лекарствами роста и смертности, которые вызвали наблюдаемый ответ на лекарство для каждого генетического клона. Предварительные данные свидетельствуют о том, что метод может точно определить, как генетические возмущения влияют на уровень смертности, вызванной лекарствами, но точность этого метода зависит от детального понимания того, как пролиферация и гибель клеток координируются препаратом и как эти показатели изменяются^{с течением времени.} Кроме того, выводы на основе MEDUSA требуют, чтобы лекарство тестировалось в дозе, вызывающей значительную гибель клеток. Важно отметить, что эти условия приема лекарств создают дополнительные опасения по поводу начальных размеров популяции и длины анализов, которые следует тщательно учитывать и оптимизировать. В этом протоколе мы описываем, как организовать химико-генетическое профилирующее исследование для анализа на основе MEDUSA, и подробно описываем использование этого аналитического метода. Общая цель MEDUSA состоит в том, чтобы определить, как делеция каждого гена влияет на рост и смертность, вызванные лекарствами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Оптимизация дозы препарата для индуцирования гибели клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол предназначен для оптимизации одной комбинации клеточной линии, препарата и дозы с использованием анализа FLICK ^7,8. Пример данных для этого протокола описывает оптимизацию и скрининг 5 мкМ этопозида в клетках U2OS, но те же этапы оптимизации могут быть применены к любой другой желаемой комбинации клеточной линии и лекарственного средства/дозы. Этот протокол не требует сбора или анализа мертвых клеток. Этот протокол может быть использован для суспензионных культур при условии удаления мертвых клеток. Для суспензионных культур мертвые клетки могут быть отсортированы/отделены с помощью маркера жизнеспособности или маркера, специфичного для гибели клеток.

1. Перед проведением анализа FLICK оптимизируйте количество клеток, пермеабилизацию Triton-X, концентрацию SYTOX и параметры сбора данных с помощью планшетного ридера, используя подробный протокол, описанный в^{пункте 8}.
2. Пластинчатые ячейки черного цвета, 96-луночные планшеты с прозрачным дном. Типичная плотность посева составляет 1500-5000 ячеек на лунку, и это число должно быть оптимизировано на линию ячеек. Инкубировать клетки при 37 °C с 5%_CO2 и влажности в течение 16-24 часов.
3. Готовьте разведения лекарственных средств в средах, содержащих концентрацию SYTOX, которая была определена как оптимальная на этапе (1.1). Лекарства обычно тестируются в рамках серии логарифмического разведения, содержащей 8-12 биологически или клинически значимых доз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые препараты могут излучать флуоресценцию на той же длине волны, что и SYTOX, что делает невозможным количественное определение с помощью этого анализа. В таких случаях может быть полезно использовать варианты SYTOX, которые излучают флуоресценцию на разных длинах волн. Кроме того, этот анализ не может оценить реакцию на препараты, которые влияют на флуоресценцию SYTOX или препятствуют связыванию SYTOX с ДНК.
4. Лизировать один планшет (T0) с помощью Triton-X при концентрации, оптимизированной на шаге (1.1). После лизиса клеток используйте планшетный ридер для измерения флуоресценции SYTOX и определения общего количества начальных клеток на основе эмпирически установленной взаимосвязи между флуоресценцией и количеством клеток (см. протокол FLICK ^7,8).
5. Измерьте флуоресценцию SYTOX в экспериментальных планшетах при T0 с помощью считывателя планшетов с настройками, оптимизированными на шаге (1.1).
6. Отслеживайте сигнал SYTOX с течением времени в течение трех дней. Чтобы ограничить полученные кинетические данные, используйте по крайней мере три временные точки в день, каждая с интервалом в 4 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оценивает гибель и рост клеток в течение 3 дней. Этот период времени обычно достаточен для препаратов, вызывающих смерть; Тем не менее, анализ может быть сокращен или удлинен для размещения препаратов с альтернативной кинетикой смерти.
7. После получения окончательного временного момента лизируйте экспериментальную пластину (пластины) с помощью Triton-X, чтобы определить окончательный размер популяции для каждого состояния.
8. Рассчитайте фракционную жизнеспособность (ФВ) и подогните данные конечной точки к кривым дозы, как описано в протоколе FLICK ^7,8.
9. Определите дозы лекарств, которые вызывают гибель примерно 50% клеток, оценив кривые дозы ФВ.
   Примечание: Идентификация мертвых клеток с помощью SYTOX требует как разрыва плазматической мембраны, так и разрушения ядерной оболочки. Эти мембраны нуждаются в постоянном уходе, поэтому SYTOX будет идентифицировать мертвые клетки независимо от механизма гибели клеток, вызванного препаратом. Тем не менее, эти процессы не происходят с одинаковой эффективностью для всех форм клеточной смерти, что может повлиять на способность SYTOX точно измерять мертвые клетки. Кроме того, различные механизмы клеточной смерти будут производить клеточные трупы различной стабильности. Тем не менее, мы обнаружили, что все формы клеточной смерти, протестированные до сих пор, приводят к SYTOX-связанной ДНК (либо внутри пермеабилизированного ядра, либо в среде клеточных культур). Этот сигнал SYTOX обычно стабилен в течение 72 часов анализа, но его можно контролировать, оценивая общее количество клеток в начале и в конце анализа.

2. Выбор длины пробы

1. Используя данные FLICK, собранные на шаге 1, рассчитайте летальную фракцию (LF) каждого условия с течением времени, как описано в протоколе FLICK ^7,8. Подгонка кинетических данных НЧ к модели запаздывающей экспоненциальной смерти (LED), как описано ранее⁹.
2. Составьте график LF во времени для каждой смертельной дозы, определенной на шаге 1. Выберите дозу и временную точку, которая производит ~50% НЧ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Летальная фракция ~50% обогащает сильные, специфичные для смерти сигналы в данных скрининга CRISPR, оставляя после себя достаточное количество живых клеток для поддержания представления библиотеки⁵. Тем не менее, некоторые препараты будут ограничены литературным прецедентом или узким диапазоном доз, которые индуцируют определенный желаемый фенотип. Если доза ограничена, конечная точка анализа должна быть сокращена или продлена, чтобы желаемая доза достигла ~50% LF. Если 50% летальность невозможна, возможно, потребуется увеличить численность начальной популяции.

3. Определение начального размера популяции

1. Выберите желаемую дозу препарата для дальнейшей оптимизации скрининга на основе вышеуказанной оптимизации.
2. Тарелки ячеек на 10 см посуду в готовом виде. Каждое условие должно быть покрыто техническими тройками и достаточным количеством биологических репликатов, чтобы клетки можно было подсчитывать каждые 12-24 часа на протяжении всего экрана, включая временную точку T = 0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество пластинчатых клеток может потребоваться оптимизировать отдельно для необработанных и обработанных клеток, учитывая скорость чистого роста популяции и размер клеток. Как правило, клетки должны быть покрыты с плотностью, которая приводит к слиянию, не ставящему под угрозу здоровье клеток в конечной точке анализа (т.е. для многих типов клеток < 80% конфлюентности). Обработанные и необработанные клетки также могут быть повторно покрыты во время экрана, если это необходимо, при условии сохранения представления библиотеки.
3. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C с 5%_CO2.
4. Добавьте препарат в нужной концентрации в лечебные пластины. Параллельно собирают клетки из 3 необработанных пластин и подсчитывают количество живых клеток с помощью гемоцитометра. Окрашивайте мертвые клетки трипановым синим (или аналогичным красителем для жизнеспособности), чтобы убедиться, что подсчитываются только живые клетки. Эти данные устанавливают количество клеток в момент времени T = 0.
5. Через 12-24 ч соберите клетки с 3 необработанных и 3 обработанных планшетов и подсчитайте количество живых клеток. Повторяйте сбор до тех пор, пока не будет достигнута конечная точка анализа. Для полного понимания лекарственного препарата и кинетики клеточной смерти рекомендуется осуществлять мониторинг живых клеток в течение 24-48 часов после момента времени, указанного в шаге (2.2).
6. Визуализируйте изменения жизнеспособности путем построения графика размера популяции (ось y) во времени (ось x).
   Примечание: Основываясь на максимальном наблюдаемом количестве клеток и окончательном размере популяции, можно сделать грубую оценку летальной фракции в конечной точке. Их следует сравнить с данными о фракционной жизнеспособности и летальной фракции, полученными с помощью анализа FLICK (шаг 1.9 и шаг 2.2), чтобы убедиться в достижении ожидаемого количества клеточной гибели.
7. Определите временную точку с наименьшим размером популяции. В зависимости от степени роста, который происходит в присутствии препарата, это будет либо в начале, либо в конце скрининга CRISPR.
8. Выберите начальный размер популяции. Убедитесь, что начальное количество ячеек оптимизировано для поддержания минимального охвата библиотеки в 500–1000 раз по всему экрану.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, библиотека TKOv3 содержит 70 948 sgРНК. Чтобы представить эту библиотеку с 500-кратным охватом, необходимо поддерживать не менее 35 474 000 клеток на репликацию на одно условие на протяжении всего анализа. Этот размер популяции узких мест часто встречается в начале анализа или после трипсинизации и понижения отбора проб при нелеченных или пролиферирующих состояниях. В отличие от этого, размер популяции «бутылочного горлышка» часто продиктован размером популяции в конечной точке анализа для лечения препаратами, которые вызывают значительную летальность.
9. При желании повторите описанную выше оптимизацию на планшетах, которые будут использоваться для скрининга CRISPR (например, 15-сантиметровые планшеты), чтобы подтвердить, что эффективность препарата масштабируется правильно.

4. Выполнение скрининга CRISPR

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть проверены с использованием установленных методов скрининга CRISPR после оптимизации дозы препарата и длины анализа. Установленные протоколы, такие как протокол скрининга TKO из лаборатории Моффата^10,11, могут быть использованы для подготовки библиотеки скрининга CRISPR, производства вирусов, выполнения скрининга CRISPR и подготовки библиотек к секвенированию (рисунок 1A-B). В приведенном ниже протоколе описаны шаги, специфичные для анализа MEDUSA, который должен быть выполнен на данных на уровне подсчета после секвенирования.

1. Рассчитайте экспериментально наблюдаемые изменения складки для каждой sgРНК (рис. 1C), как описано ниже.
   1. Сгенерируйте таблицу подсчетов на уровне sgRNA, чтобы подготовить данные секвенирования для анализа. Библиотека секвенирования обрезки и сопоставления с использованием стандартных конвейеров, как описано ^5,12.
   2. Нормализация глубины библиотеки секвенирования. Нормализуйте библиотеки вручную или с помощью встроенных функций, таких как в DESeq2, как в ^5,12. Выполните нормализацию по всем направляющим или с помощью распределения нецелевых направляющих.
   3. Случайным образом назначайте нецелевые sgРНК нецелевым генам. Например, библиотека с четырьмя sgRNA на ген должна иметь четыре нецелевые sgRNA на каждый ген, не являющийся мишенью.
   4. Для каждого интересующего вас сравнения (необработанное/T0 и/или обработанное/необработанное) рассчитайте log2 (кратное изменение). Рекомендуется рассчитывать это с использованием параметрической аппроксимации в DESeq2, хотя можно также выполнить ручной расчет изменения сгиба.
   5. Обрезайте sgРНК с малым числом отсчетов. Правильная стратегия обрезки будет зависеть от уровня шума между репликациями и от того, как он меняется при подсчете. Эти функции будут варьироваться в зависимости от библиотеки CRISPR и тестировать несколько отсечек параллельно для новых данных. Распространенные стратегии отсечения, основанные на литературных прецедентах, включают в себя удаление нижних 5% руководств или удаление руководств ниже некоторого номинального порога¹³.
2. Определите влияние нокаута каждого отдельного гена на скорость роста, как описано ниже.
   1. Рассчитайте чистый темп роста популяции (NPG) необработанных клеток (т.е. наблюдаемое время удвоения популяции, рисунок 1D). Это может быть извлечено из данных FLICK на шаге 1, подсчета живых клеток с течением времени на шаге 3 или предыдущих экспериментальных измерений для интересующей клеточной линии.
   2. MEDUSA требует трех параметров для моделирования нелеченного состояния: NPG: Чистый темп роста популяции, в удвоениях/ч; _{T start}: Начальная временная точка, в час. По умолчанию установлено значение 0; Tend_unt: Конечная временная точка для нелеченного состояния, в час.
   3. Моделируем все возможные возмущения к скорости NPG. Используйте цикл for для вычисления диапазона возможных значений NPG. Для каждой относительной скорости роста рассчитайте log2 (кратное изменение), которое будет наблюдаться в конечной точке анализа.
   4. Для каждой экспериментальной sgРНК на шаге 4.1.5 определите смоделированное изменение складки, наиболее близкое к наблюдаемым данным. Присвойте этой sgРНК относительную скорость роста, которая привела к смоделированному изменению кратности.
3. Охарактеризуйте координацию между ростом и смертью, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, необходимые для MEDUSA, могут быть извлечены из данных в стиле FLICK при анализе с помощью метода анализа GRADE¹⁴. Для этого можно использовать данные из пунктов (1) и (2) или провести дополнительный эксперимент по параметризации.
   1. MEDUSA использует четыре параметра для характеристики координации между ростом и смертностью в присутствии препарата: GR_{препарат1}: Вызванный лекарством темп роста до наступления смерти, в удвоениях/ч; D_O: Время наступления смерти, в ч; GR_drug2: Лекарственно-индуцированная скорость роста после наступления смерти, в удвоении/ч; DR_{препарат}: Уровень смертности, вызванной лекарственным средством, в единицах летальной фракции/ч. Для параметризации D_O используйте кинетику НЧ. Извлеките время наступления смерти из посадки светодиода.
4. Определение_{ДР препарата} с помощью ЛЧ кинетики. Определите средний коэффициент смертности, разделив итоговый ЛФ на время после наступления смерти (в часах).
5. Определите_{лекарственный препарат GR1} по данным подсчета живых клеток на шаге 3. Перед наступлением смерти определите темпы роста, вызванные лекарственными препаратами, подогнав данные к простому экспоненциальному уравнению.
   1. Определите_{GR drug2} , используя комбинацию данных из шага 3 и препарата GRADE¹⁴. Рассчитайте и нанесите график GRADE для выбранной дозы препарата на графике GRADE. Если GRADE = 0, предположим, что GR_drug2 равно 0; Если GRADE > 0, используйте GRADE для определения среднего темпа роста популяции. На основе экспериментально определенного значения_{для препарата ГР1} определите значение_{для препарата ГР2} , которое приводит к наблюдаемому среднему темпу роста.
      Примечание: Средняя скорость роста, вызванная лекарственным препаратом, может быть выведена из графика GRADE путем вычисления попарного расстояния между наблюдаемой точкой данных (т.е. парой данных GR и FV для лекарственного препарата) и каждой точкой, составляющей пространство GRADE, и определения ближайшей точки. Подробные инструкции см. в ссылке¹⁴. Темпы роста и смертности, вызванные лекарственными препаратами, не являются фиксированными значениями для каждого препарата и специфичны для препарата при данной дозе в данном клеточном контексте.
6. Смоделируйте изменения складки для всех возможных комбинаций скорости роста и смертности, как описано ниже.
   1. Используя экспериментально определенную координацию темпов роста, вызванных лекарствами, и смертности, построить модель, которая имитирует размер популяции, вызванной лекарственными препаратами, с течением времени (рисунок 1D). Эта модель может быть построена как кусочно-функциональная функция, объединяющая две независимые фазы лекарственного ответа (до и после наступления смерти).
   2. Для полной модели MEDUSA включите следующие восемь параметров: NPG: Чистый темп прироста населения, в удвоениях/ч; GR_drug1: Лекарственно-индуцированная скорость роста до наступления смерти, в удвоении/ч; D_O: Время наступления смерти, в ч; GR_drug2: Лекарственно-индуцированная скорость роста после наступления смерти, в удвоении/ч; _{Лекарственный препарат}: Уровень смертности, вызванной лекарственными препаратами, в единицах летальной фракции/ч; _{T start}: Начальная временная точка, в час. По умолчанию установлено значение 0; Tend_unt: Конечная временная точка для невылеченного состояния, в час; Tend_tr: Конечная временная точка для обработанного состояния, в часах.
   3. Для базовой модели смоделируйте все возможные возмущения роста и смертности. Для каждой комбинации вычислите log2(fold-change), которое будет наблюдаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В MEDUSA предполагается, что возмущения скорости роста пропорциональны НПГ,_{препарату ГР1} и_{препарату ГР2}. Например, 80%-ное снижение уровня NPG также приводит к 80%-ному снижению темпов роста, вызванных лекарственными препаратами.
7. Сделайте вывод о смертности каждого нокаута (Рисунок 1D-E), как описано ниже.
   1. Для каждой гРНК триангулируйте уровень смертности, вызванной лекарственным препаратом, который привел бы к наблюдаемому изменению кратности. Во-первых, извлеките относительный темп роста, определенный на шаге (4.2.4).
   2. Определите ставки на_{препарат ГР1} и_{препарат ГР2}. Примените относительный темп роста от NPG для расчета пропорционального темпа роста_{для препарата GR1}/_{препарата GR2}.
   3. Используя ограничения для НПГ,_{препарата ГР1} и_{препарата ГР2}, определите смоделированное изменение складки, ближайшее к наблюдаемому изменению складки для каждой сгРНК (обработанной/необработанной). Используйте комбинацию этих наблюдений для обратного расчета коэффициента смертности, вызванной лекарственными препаратами.
8. Рассчитайте темпы роста и смертность на уровне генов, как описано ниже.
   1. Определите показатели на уровне генов для каждого гена в библиотеке. Рассчитайте среднее значение для каждой скорости роста и смертности для всех sgRNA, связанных с данным геном (обычно 4-10).
   2. Чтобы вычислить эмпирические p-значения, выполните начальную загрузку данных на уровне sgRNA. Выполните коррекцию FDR с помощью процедуры Беньямини-Хохберга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные инструкции, а также образцы данных для анализа данных скрининга CRISPR с помощью MEDUSA включены в наш репозиторий GitHub (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя этот протокол, мы изучили генетические зависимости смерти, вызванной этопозидами в клетках U2OS. Этопозид является широко используемым химиотерапией, повреждающей ДНК¹⁵. Этот эксперимент по химико-генетическому профилированию был проведен с исп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем использование аналитического метода MEDUSA для количественной оценки данных химико-генетического профилирования для оценки того, как генетические нарушения влияют на рост и смертность, вызванные лекарственными препаратами. Поскольку пер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012924	For growing cells and optimizing population size
150mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012925	For growing cells and optimizing population size
DESeq2	R Package	v1.44.0	For calculating fold-change
DMEM	Corning	10017CV	For seeding and drugging cells
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	For seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate	Greiner	655090	For seeding and drugging cells
MATLAB	Mathworks	R2024a	For performing FLICK, GRADE, and MEDUSA
Microplate fluorescence reader	Tecan	Spark	For dead cell measurements
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	For dead cell measurements
TKOV3 CRISPR library	Addgene	125517	For performing CRISPR screen
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	For permeabilizing cells
Trypan blue	Corning	MT25900CI	For measure live/dead cells