MEDUSA zur Identifizierung von todregulatorischen Genen in chemogenetischen Profiling-Daten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie die MEDUSA-Analysemethode verwendet wird, um die todesregulatorische Wirkung jedes Gen-Knockouts zu quantifizieren. Es enthält Anweisungen zur Bestimmung von Versuchsbedingungen, die die Empfindlichkeit optimieren, und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung der Analyse.

Zusammenfassung

Das systematische Screening von genetischen Störungen durch Funktionsgewinn oder -verlust kann verwendet werden, um die genetischen Abhängigkeiten und Regulationsmechanismen für praktisch jeden zellulären Prozess von Interesse zu charakterisieren. Diese Experimente beinhalten in der Regel die Erstellung von Profilen aus einem Pool einzelner Genstörungen und wie sich jede genetische Störung auf die relative Zellfitness auswirkt. Wenn diese Methoden im Rahmen von Wirksamkeitsstudien von Arzneimitteln angewendet werden, die oft als chemogenetisches Profiling bezeichnet werden, sollten sie bei der Identifizierung von Wirkmechanismen von Arzneimitteln wirksam sein. Leider sind fitnessbasierte chemogenetische Profiling-Studien unwirksam, wenn es darum geht, alle Komponenten einer Arzneimittelreaktion zu identifizieren. Zum Beispiel können diese Studien in der Regel nicht identifizieren, welche Gene den medikamenteninduzierten Zelltod regulieren. Mehrere Probleme tragen dazu bei, die Todesregulation in fitnessbasierten Screenings zu verschleiern, darunter die verwirrenden Effekte der Variation der Proliferationsrate, die Variation der medikamenteninduzierten Koordination zwischen Wachstum und Tod und in einigen Fällen die Unfähigkeit, DNA von lebenden und toten Zellen zu trennen. MEDUSA ist eine analytische Methode zur Identifizierung todregulatorischer Gene in herkömmlichen chemogenetischen Profiling-Daten. Es funktioniert mit Hilfe von Computersimulationen, um die Wachstums- und Sterberaten zu schätzen, die ein beobachtetes Fitnessprofil erstellt haben, anstatt die Fitness selbst zu bewerten. Die effektive Anwendung der Methode hängt von der optimalen Stimulation der experimentellen Bedingungen ab, einschließlich der Wirkstoffdosis, der Größe der Ausgangspopulation und der Länge des Assays. In diesem Manuskript wird beschrieben, wie eine chemogenetische Profiling-Studie für die MEDUSA-basierte Analyse eingerichtet wird, und wir werden zeigen, wie die Methode zur Quantifizierung der Sterblichkeitsraten in chemogenetischen Profiling-Daten verwendet werden kann.

Einleitung

Bei der chemogenetischen Profilerstellung werden systematische genetische Störungen verwendet, um den Beitrag jedes Gens zu einer gegebenen Arzneimittelreaktion zu verstehen ^1,2,3. Diese Experimente sind wertvoll und können wichtige Erkenntnisse über das Ansprechen von Medikamenten liefern, einschließlich des Bindungsziels des Medikaments und der Mechanismen des Wirkstoffeinflusses/-ausflusses. Da diese Experimente jedoch in der Regel gepoolt durchgeführt werden, bei denen alle Gene gleichzeitig ausgewertet werden, kann die Generierung mechanistischer Erkenntnisse aus chemogenetischen Profiling-Daten eine Herausforderung darstellen.

Die Kontrollmechanismen und genetischen Abhängigkeiten für den medikamenteninduzierten Zelltod sind in chemogenetischen Profiling-Daten in der Regel schwer zu klären. Es gibt mehrere Gründe für dieses Problem, aber viele davon sind auf die Auswirkungen der Variation der Zellproliferation zurückzuführen⁴. Da sich Zellen exponentiell vermehren, hat der Effekt einer genetischen Störung auf die Proliferationsrate einen größeren Einfluss auf die Populationsgröße als die sich ändernde Zelltodrate. Da sich diese verzerrte Sensitivität im Laufe der Zeit verschlimmert und diese Experimente in der Regel über mehrere Wochen durchgeführt werden, sind die meisten Studien so optimiert, dass sie hochempfindlich auf Proliferationsdefekte und im Wesentlichen unempfindlich auf Veränderungen des medikamenteninduzierten Zelltods reagieren. Zu den weiteren Fragen im Zusammenhang mit der Proliferation gehören die unterschiedliche Koordination zwischen Proliferation und Tod (z. B. wie schnell jeder Klon wächst und gleichzeitig stirbt, und variiert dies zwischen genetischen Störungen) und die Variation der Proliferationsraten für jeden Klon in Abwesenheit des Medikaments, was die erwartete Anzahl von Zellen verändert, die hätten gewonnen werden sollen/können, wenn das Medikament nicht wirksam gewesen wäre. Die Quintessenz ist, dass chemogenetische Profiling-Experimente im Allgemeinen die Auswirkungen genetischer Störungen mit Messungen bewerten, die proportional zu den relativen Populationsgrößen sind, indem behandelte und unbehandelte Populationen verglichen werden. Da die Populationsgröße ein Produkt sowohl der Zellwachstums- als auch der Zelltodrate ist, stellt die Proliferation aus der Perspektive des Zelltods einen verwirrenden Einfluss dar.

Um diese Probleme zu beheben, haben wir eine Methode zur Bewertung des Todes mit einem simulationsgestützten Ansatz (MEDUSA)⁵ entwickelt. MEDUSA interpretiert die beobachteten relativen Populationsgrößendaten durch die Linse von Computersimulationen, um die Kombination aus arzneimittelinduziertem Wachstum und Todesraten abzuleiten, die die beobachtete Arzneimittelreaktion für jeden genetischen Klon hervorgerufen hat. Frühere Daten deuten darauf hin, dass die Methode genau ableiten kann, wie sich genetische Störungen auf die arzneimittelinduzierte Sterblichkeitsrate auswirken, aber die Genauigkeit dieser Methode hängt von einem detaillierten Verständnis ab, wie Zellproliferation und Zelltod durch ein Medikament koordiniert werden und wie sich diese Raten im Laufe der Zeit ändern ^5,6. Darüber hinaus erfordern MEDUSA-basierte Inferenzen, dass ein Medikament in einer Dosis getestet wird, die einen erheblichen Zelltod verursacht. Wichtig ist, dass diese Bedingungen bei der Verabreichung zusätzliche Bedenken hinsichtlich der Ausgangspopulationsgrößen und Assay-Längen aufwerfen, die sorgfältig abgewogen und optimiert werden sollten. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie eine chemogenetische Profiling-Studie für die MEDUSA-basierte Analytik eingerichtet wird und geben eine detaillierte Anwendung dieser Analysemethode. Das übergeordnete Ziel von MEDUSA ist es, zu bestimmen, wie sich jede Gendeletion auf das medikamenteninduzierte Wachstum und die Todesraten auswirkt.

Protokoll

1. Optimierung der Medikamentendosis zur Induktion des Zelltods

HINWEIS: Das folgende Protokoll dient zur Optimierung einer Kombination aus Zelllinie, Arzneimittel und Dosis unter Verwendung des FLICK-Assays ^7,8. Die Beispieldaten für dieses Protokoll beschreiben die Optimierung und das Screening von 5 μM Etoposid in U2OS-Zellen, aber die gleichen Optimierungsschritte könnten auf jede andere gewünschte Kombination von Zelllinie und Wirkstoff/Dosis angewendet werden. Dieses Protokoll erfordert keine Entnahme oder Analyse toter Zellen. Dieses Protokoll kann für Suspensionskulturen verwendet werden, sofern abgestorbene Zellen entfernt werden. Für Suspensionskulturen können tote Zellen mit einem Viabilitätsmarker oder einem spezifischen Marker für den Zelltod sortiert/getrennt werden.

1. Optimieren Sie vor der Durchführung eines FLICK-Assays die Zellzahl, die Triton-X-Permeabilisierung, die SYTOX-Konzentration und die Erfassungseinstellungen des Platten-Readers mithilfe des in^{Abschnitt 8} beschriebenen detaillierten Protokolls.
2. Plattenzellen in schwarzen 96-Well-Platten mit klarem Boden. Typische Seeding-Dichten liegen bei 1500-5000 Zellen pro Well, und diese Anzahl sollte pro Zelllinie optimiert werden. Die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und Feuchtigkeit 16-24 h inkubieren.
3. Die Arzneimittelverdünnungen werden in Medien hergestellt, die die Konzentration von SYTOX enthalten, die in Schritt (1.1) als optimal identifiziert wurde. Die Medikamente werden in der Regel über eine logarithmisch verdünnungsreihenweise getestet, die 8-12 biologisch oder klinisch relevante Dosen enthält.
   HINWEIS: Bestimmte Arzneimittel können Fluoreszenz bei der gleichen Wellenlänge wie SYTOX emittieren, was eine Quantifizierung mit diesem Assay unmöglich macht. In solchen Fällen kann die Verwendung von SYTOX-Varianten, die Fluoreszenz bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, von Vorteil sein. Darüber hinaus kann dieser Assay die Reaktion auf Arzneimittel nicht beurteilen, die die SYTOX-Fluoreszenz beeinflussen oder die Bindung von SYTOX an die DNA verhindern.
4. Eine Platte (T0) wird mit Triton-X in der in Schritt (1.1) optimierten Konzentration lysiert. Nach der Zelllyse wird mit einem Plattenreader die SYTOX-Fluoreszenz gemessen und die Gesamtausgangszellzahl auf Basis des empirisch festgestellten Zusammenhangs zwischen Fluoreszenz und Zellzahl bestimmt (siehe FLICK-Protokoll ^7,8).
5. Messen Sie die SYTOX-Fluoreszenz in den experimentellen Platten bei T0 mit einem Platten-Reader, wobei die Einstellungen in Schritt (1.1) optimiert werden.
6. Überwachen Sie das SYTOX-Signal über einen Zeitraum von drei Tagen. Um die resultierenden kinetischen Daten einzuschränken, verwenden Sie mindestens drei Zeitpunkte pro Tag im Abstand von jeweils 4 Stunden.
   HINWEIS: Dieses Protokoll bewertet den Zelltod und das Zellwachstum über einen Zeitraum von 3 Tagen. Diese Zeitspanne ist in der Regel ausreichend für todbringende Medikamente; Der Assay kann jedoch verkürzt oder verlängert werden, um Arzneimittel mit alternativer Todeskinetik aufzunehmen.
7. Nach dem letzten Zeitpunkt lysieren Sie die Versuchsplatte(n) mit Triton-X, um die endgültige Populationsgröße jeder Bedingung zu bestimmen.
8. Berechnen Sie die fraktionale Viabilität (FV) und passen Sie die Endpunktdaten an Dosiskurven an, wie im FLICK-Protokoll ^7,8 beschrieben.
9. Identifizieren Sie Arzneimitteldosen, die einen Zelltod von etwa 50 % induzieren, indem Sie die FV-Dosiskurven auswerten.
   HINWEIS: Die Identifizierung toter Zellen durch SYTOX erfordert sowohl einen Plasmamembranbruch als auch einen Abbau der Kernhülle. Diese Membranen müssen kontinuierlich gepflegt werden, so dass SYTOX tote Zellen unabhängig vom durch das Medikament induzierten Zelltodmechanismus identifizieren kann. Diese Prozesse laufen jedoch nicht bei allen Formen des Zelltods mit der gleichen Wirksamkeit ab, was die Fähigkeit von SYTOX beeinflussen könnte, tote Zellen genau zu messen. Darüber hinaus werden durch unterschiedliche Zelltodmechanismen Zellleichen mit unterschiedlichen Stabilitäten hervorgebracht. Wir haben jedoch festgestellt, dass alle bisher getesteten Formen des Zelltods zu SYTOX-gebundener DNA führen (entweder in einem permeabilisierten Zellkern oder in den Zellkulturmedien). Dieses SYTOX-Signal ist im Allgemeinen über einen 72-stündigen Assay stabil, kann aber durch Auswertung der Gesamtzellzahl zu Beginn und am Ende des Assays überwacht werden.

2. Auswahl der Assay-Länge

1. Berechnen Sie unter Verwendung der in Schritt 1 gesammelten FLICK-Daten den letalen Anteil (LF) jeder Bedingung über die Zeit, wie im FLICK-Protokoll ^7,8 beschrieben. Passen Sie kinetische LF-Daten an ein LED-Modell (Lag-Exponential Death) an, wie zuvor beschrieben⁹.
2. Plotten Sie die LF im Zeitverlauf für jede in Schritt 1 identifizierte letale Dosis. Wählen Sie eine Dosis und einen Zeitpunkt, der ~50% LF erzeugt.
   HINWEIS: Ein letaler Anteil von ~50% reichert starke, todesspezifische Signale in CRISPR-Screening-Daten an, während genügend lebende Zellen zurückbleiben, um die Repräsentation in der Bibliothek aufrechtzuerhalten⁵. Einige Arzneimittel sind jedoch durch den Präzedenzfall in der Literatur oder einen engen Bereich von Dosen eingeschränkt, die einen bestimmten gewünschten Phänotyp induzieren. Wenn die Dosis eingeschränkt ist, sollte der Assay-Endpunkt verkürzt oder erweitert werden, um sicherzustellen, dass die gewünschte Dosis ~50 % LF erreicht. Wenn eine Letalität von 50 % nicht möglich ist, muss die Startpopulation möglicherweise vergrößert werden.

3. Bestimmung der Ausgangspopulationsgröße

1. Wählen Sie die gewünschte Arzneimitteldosis aus, um das Screening auf der Grundlage der obigen Optimierung weiter zu optimieren.
2. Plattenzellen auf 10 cm Schalen in kompletten Medien. Jede Bedingung sollte mit technischen Triplikaten und genügend biologischen Replikaten plattiert werden, so dass die Zellen alle 12-24 Stunden über die Länge des Bildschirms gezählt werden können, einschließlich des Zeitpunkts T = 0.
   HINWEIS: Die Anzahl der plattierten Zellen muss möglicherweise separat für unbehandelte und behandelte Zellen optimiert werden, wobei die Wachstumsrate der Nettopopulation und die Zellgröße zu berücksichtigen sind. Die Zellen sollten im Allgemeinen mit Dichten plattiert werden, die zu einer Konfluenz führen, die die Zellgesundheit am Assay-Endpunkt nicht beeinträchtigt (d. h. bei vielen Zelltypen < 80 % konfluent). Behandelte und unbehandelte Zellen können bei Bedarf auch während des Screenings neu plattiert werden, solange die Bibliotheksdarstellung erhalten bleibt.
3. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂.
4. Geben Sie das Medikament in der gewünschten Konzentration auf die Behandlungsplatten. Parallel dazu werden Zellen von 3 unbehandelten Platten entnommen und die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Hämozytometer gezählt. Färben Sie die abgestorbenen Zellen mit Trypanblau (oder einem vergleichbaren Viabilitätsfarbstoff), um sicherzustellen, dass nur lebende Zellen gezählt werden. Diese Daten ermitteln die Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt T = 0.
5. Nach 12-24 h werden Zellen von 3 unbehandelten und 3 behandelten Platten entnommen und die Anzahl der lebenden Zellen gezählt. Wiederholen Sie die Entnahme, bis der Endpunkt des Assays erreicht ist. Um die Kinetik des Arzneimittels und des Zelltods vollständig zu verstehen, wird empfohlen, lebende Zellen 24-48 Stunden lang nach dem in Schritt (2.2) identifizierten Zeitpunkt zu überwachen.
6. Visualisieren Sie Änderungen der Lebensfähigkeit, indem Sie die Populationsgröße (y-Achse) im Zeitverlauf (x-Achse) darstellen.
   HINWEIS: Basierend auf der maximal beobachteten Zellzahl und der endgültigen Populationsgröße kann eine grobe Schätzung der letalen Fraktion am Endpunkt vorgenommen werden. Dies sollte mit den mit dem FLICK-Assay (Schritt 1.9 und Schritt 2.2) erzeugten Daten zur fraktionellen Viabilität und zur letalen Fraktion verglichen werden, um sicherzustellen, dass die erwartete Menge an Zelltod erreicht wird.
7. Identifizieren Sie den Zeitpunkt mit der geringsten Bevölkerungsgröße. Abhängig von der Menge des Wachstums, das in Gegenwart des Medikaments auftritt, befindet sich dies entweder am Anfang oder am Ende des CRISPR-Screenings.
8. Wählen Sie eine anfängliche Populationsgröße aus. Stellen Sie sicher, dass die Startanzahl der Zellen optimiert ist, um eine mindestens 500- bis 1000-fache Bibliotheksabdeckung auf dem gesamten Bildschirm zu gewährleisten.
   HINWEIS: Die TKOv3-Bibliothek verfügt beispielsweise über 70.948 sgRNAs. Um diese Bibliothek bei 500-facher Abdeckung darzustellen, sollten während des gesamten Assays nicht weniger als 35.474.000 Zellen pro Replikat und Bedingung beibehalten werden. Dieser Engpass bei der Populationsgröße tritt häufig zu Beginn des Assays oder nach Trypsinisierung und Downsampling bei unbehandelten oder proliferierenden Erkrankungen auf. Im Gegensatz dazu wird die Engpasspopulationsgröße bei medikamentösen Behandlungen, die eine erhebliche Letalität induzieren, oft durch die Populationsgröße am Assay-Endpunkt bestimmt.
9. Falls gewünscht, wiederholen Sie die obige Optimierung auf den Platten, die für den CRISPR-Bildschirm verwendet werden (z. B. 15-cm-Platten), um zu bestätigen, dass die Wirksamkeit des Medikaments korrekt skaliert.

4. Durchführung des CRISPR-Screenings

HINWEIS: Zellen können mit etablierten CRISPR-Screening-Methoden gescreent werden, nachdem die Wirkstoffdosis und die Assay-Länge optimiert wurden. Etablierte Protokolle, wie z. B. das TKO-Screening-Protokoll aus dem Moffat-Labor^10,11, können verwendet werden, um die CRISPR-Screening-Bibliothek vorzubereiten, Viren zu produzieren, das CRISPR-Screening durchzuführen und Bibliotheken für die Sequenzierung vorzubereiten (Abbildung 1A-B). Das folgende Protokoll beschreibt die spezifischen Schritte für die MEDUSA-Analyse, die nach der Sequenzierung an Daten auf Zählebene durchgeführt werden sollten.

1. Berechnen Sie die experimentell beobachteten Faltungsänderungen für jede sgRNA (Abbildung 1C), wie unten beschrieben.
   1. Generieren Sie eine Zähltabelle auf sgRNA-Ebene, um Sequenzierungsdaten für die Analyse vorzubereiten. Trimmen und Mappen von Sequenzierungsbibliotheken mithilfe von Standardpipelines, wie beschrieben ^5,12.
   2. Normalisieren Sie die Tiefe der Sequenzierungsbibliothek. Normalisieren Sie Bibliotheken entweder manuell oder mit integrierten Funktionen, wie z. B. in DESeq2, wie in ^5,12. Führen Sie die Normalisierung für alle Hilfslinien oder mithilfe der Verteilung von Hilfslinien ohne Targeting durch.
   3. Weisen Sie nicht-targeting-sgRNAs nach dem Zufallsprinzip nicht-targeting-Genen zu. Zum Beispiel sollte eine Bibliothek mit vier sgRNAs pro Gen vier nicht-targeting-sgRNAs pro nicht-targeting-Gen haben.
   4. Berechnen Sie für jeden Vergleich des Interesses (unbehandelt/T0 und/oder behandelt/unbehandelt) den log2(fold-change). Es wird empfohlen, dies mit einer parametrischen Passung in DESeq2 zu berechnen, obwohl auch eine manuelle Berechnung der Faltenänderung durchgeführt werden kann.
   5. Trimmen Sie sgRNAs mit einer geringen Anzahl von Zählungen. Die richtige Trimmstrategie hängt vom Rauschpegel zwischen den Replikationen ab und davon, wie sich dieser im Laufe der Zählungen ändert. Diese Funktionen variieren je nach CRISPR-Bibliothek und testen mehrere Cutoffs parallel für neue Daten. Zu den gängigen Cut-off-Strategien, die auf Präzedenzfällen in der Literatur basieren, gehören das Entfernen der untersten 5 % der Leitfäden oder das Entfernen von Leitfäden unterhalb eines nominalen Schwellenwerts¹³.
2. Bestimmen Sie den Einfluss jedes einzelnen Gen-Knockouts auf die Wachstumsrate, wie unten beschrieben.
   1. Berechnen Sie die Netto-Populationswachstumsrate (NPG) der unbehandelten Zellen (d. h. die beobachtete Verdopplungszeit der Population, Abbildung 1D). Dies kann aus den FLICK-Daten in Schritt 1, der Anzahl lebender Zellen im Zeitverlauf in Schritt 3 oder früheren experimentellen Messungen für die interessierende Zelllinie extrahiert werden.
   2. MEDUSA benötigt drei Parameter, um die unbehandelte Erkrankung zu modellieren: NPG: Net Population Growth Rate, in Verdoppelungen/h; T_start: Startzeitpunkt in h. Dies ist auf den Standardwert 0 festgelegt. Tend_unt: Endzeitpunkt für den unbehandelten Zustand, in h.
   3. Simulieren Sie alle möglichen Störungen der NPG-Rate. Verwenden Sie eine for-Schleife, um einen Bereich möglicher NPG-Werte auszuwerten. Berechnen Sie für jede relative Wachstumsrate die log2(fold-change), die am Assay-Endpunkt beobachtet würde.
   4. Identifizieren Sie für jede experimentelle sgRNA in Schritt 4.1.5 die simulierte Faltungsänderung, die den beobachteten Daten am nächsten kommt. Weisen Sie dieser sgRNA die relative Wachstumsrate zu, die zu der simulierten Faltungsänderung geführt hat.
3. Charakterisieren Sie die Koordination zwischen Wachstum und Tod, wie unten beschrieben.
   HINWEIS: Die für MEDUSA erforderlichen Parameter können aus FLICK-Daten extrahiert werden, wenn sie mit der GRADE-Analysemethode¹⁴ analysiert werden. Hierfür können Daten aus (1) und (2) verwendet werden, oder es kann ein zusätzliches Parametrisierungsexperiment durchgeführt werden.
   1. MEDUSA verwendet vier Parameter, um die Koordination zwischen Wachstum und Tod in Gegenwart eines Medikaments zu charakterisieren:_{GR-Medikament1}: Arzneimittelinduzierte Wachstumsrate vor Beginn des Todes, in Verdopplungen/h; D_O: Zeitpunkt des Beginns des Todes, in h; _{GR-Medikament2}: Arzneimittelinduzierte Wachstumsrate nach Sterbebeginn, in Verdopplungen/h; _{DR-Medikament}: Arzneimittelinduzierte Todesrate in Einheiten der letalen Fraktion/h. Verwenden Sie zum Parametrisieren von D_O die LF-Kinetik. Extrahieren Sie die Zeit des Todesbeginns aus der LED-Passung.
4. Bestimmen Sie_{das DR-Medikament} mit Hilfe der LF-Kinetik. Bestimmen Sie die durchschnittliche Sterberate, indem Sie die endgültige LF durch die Zeit nach Eintritt des Todes dividieren (in h).
5. Bestimmen Sie GR_drug1 aus den Lebendzellzähldaten in Schritt 3. Bestimmen Sie vor dem Einsetzen des Todes die medikamenteninduzierte Wachstumsrate, indem Sie die Daten an eine einfache Exponentialgleichung anpassen.
   1. Bestimmen Sie GR_Drug2 anhand einer Kombination aus Daten aus Schritt 3 und Drug GRADE¹⁴. Berechnen Sie die GRADE für die ausgewählte Arzneimitteldosis und stellen Sie sie in einem GRADE-Diagramm dar. Wenn GRADE = 0, wird angenommen, dass GR_Medikament2 0 ist; Wenn GRADE > 0 ist, verwenden Sie GRADE, um die durchschnittliche Wachstumsrate der Grundgesamtheit zu bestimmen. Bestimmen Sie basierend auf dem experimentell ermittelten Wert für_{GR-Medikament1} den Wert für_{GR-Medikament2} , der sich aus der beobachteten durchschnittlichen Wachstumsrate ergibt.
      HINWEIS: Die durchschnittliche arzneimittelinduzierte Wachstumsrate kann aus einem GRADE-Diagramm abgeleitet werden, indem der paarweise Abstand zwischen dem beobachteten Datenpunkt (d. h. dem Paar von GR- und FV-Daten für ein Medikament) und jedem Punkt, aus dem der GRADE-Raum besteht, berechnet und der nächstgelegene Punkt identifiziert wird. Detaillierte Anweisungen finden Sie in Ref¹⁴. Arzneimittelinduzierte Wachstumsraten und Todesraten sind keine festen Werte pro Medikament, sondern spezifisch für ein Medikament in einer bestimmten Dosis in einem bestimmten Zellkontext.
6. Erzeugen Sie simulierte Faltungsänderungen für alle möglichen Kombinationen von Wachstumsrate und Sterberate, wie unten beschrieben.
   1. Unter Verwendung der experimentell ermittelten Koordination von drogeninduzierter Wachstumsrate und Sterberate wird ein Modell erstellt, das die drogeninduzierte Populationsgröße im Zeitverlauf simuliert (Abbildung 1D). Dieses Modell kann als stückweise Funktion aufgebaut werden, die zwei unabhängige Phasen des Wirkstoffansprechens (Zeit vor und nach dem Tod) kombiniert.
   2. Für ein vollständiges MEDUSA-Modell schließen Sie diese acht Parameter ein: NPG: Netto-Bevölkerungswachstumsrate in Verdoppelungen/h; _{GR-Medikament1}: Arzneimittelinduzierte Wachstumsrate vor Beginn des Todes, in Verdopplungen/h; D_O: Zeitpunkt des Beginns des Todes, in h; _{GR-Medikament2}: Arzneimittelinduzierte Wachstumsrate nach Sterbebeginn, in Verdopplungen/h; _{DR-Medikament}: Arzneimittelinduzierte Todesrate in Einheiten der letalen Fraktion/h; T_start: Startzeitpunkt in h. Dies ist auf den Standardwert 0 festgelegt. Tend_unt: Endzeitpunkt für den unbehandelten Zustand, in h; Tendenz_tr: Endzeitpunkt für den behandelten Zustand, in h.
   3. Simulieren Sie für das Basismodell alle möglichen Störungen des Wachstums und der Sterberate. Berechnen Sie für jede Kombination den log2(fold-change), der beobachtet würde.
      HINWEIS: In MEDUSA wird davon ausgegangen, dass Störungen der Wachstumsrate zwischen NPG,_{GR-Medikament1} und_{GR-Medikament2} proportional sind. Zum Beispiel führt eine 80%ige Reduktion der NPG-Rate auch zu einer 80%igen Reduktion beider medikamenteninduzierter Wachstumsraten.
7. Leiten Sie die Sterblichkeitsrate jedes Knockouts ab (Abbildung 1D-E), wie unten beschrieben.
   1. Triangulieren Sie für jede sgRNA die medikamenteninduzierte Sterblichkeitsrate, die die beobachtete Faltungsänderung hervorgerufen hätte. Extrahieren Sie zunächst die in Schritt (4.2.4) ermittelte relative Wachstumsrate.
   2. Bestimmen Sie die Raten für_{GR-Medikament1} und_{GR-Medikament2}. Wenden Sie die relative Wachstumsrate von NPG an, um eine proportionale Wachstumsrate für_{GR-Medikament1}/_{GR-Medikament2} zu berechnen.
   3. Unter Verwendung der Einschränkungen für NPG,_{GR-Medikament1} und_{GR-Medikament2} identifizieren Sie für jede sgRNA (behandelt/unbehandelt) die simulierte Faltungsänderung, die der beobachteten Faltungsänderung am nächsten kommt. Verwenden Sie eine Kombination dieser Beobachtungen, um die drogeninduzierte Todesrate zurückzuberechnen.
8. Berechnen Sie die Wachstumsraten auf Genebene und die Sterberaten wie unten beschrieben.
   1. Bestimmen Sie die Raten auf Genebene für jedes Gen in der Bibliothek. Berechnen Sie den Mittelwert für jede Wachstumsrate und Sterberate für alle sgRNAs, die mit einem bestimmten Gen assoziiert sind (typischerweise 4-10).
   2. Um empirische p-Werte zu berechnen, bootstrappen Sie die Daten auf sgRNA-Ebene. Führen Sie eine FDR-Korrektur mit dem Benjamini-Hochberg-Verfahren durch.
      HINWEIS: Ergänzende Anweisungen sowie Beispieldaten für die Analyse von CRISPR-Screening-Daten mit MEDUSA finden Sie in unserem GitHub-Repository (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

Ergebnisse

Mit Hilfe dieses Protokolls untersuchten wir die genetischen Abhängigkeiten des Etoposid-induzierten Todes in U2OS-Zellen. Etoposid ist eine häufig verwendete DNA-schädigende Chemotherapie¹⁵. Dieses chemogenetische Profiling-Experiment wurde unter Verwendung der GeCKOv2-Bibliothek¹⁶ in Cas9 durchgeführt, die U2OS-Zellen^{exprimieren 5}. Bei dieser Art von Experimenten wird die Genfunktion typischerweise aus der rela...

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung der MEDUSA-Analysemethode zur Quantifizierung chemogenetischer Profiling-Daten, um zu bewerten, wie genetische Störungen das arzneimittelinduzierte Wachstum und die Sterberaten verändern. Da das primäre Ergebnis eines chemogenetischen Profiling-Experiments mit der Populationsgröße und nicht mit den Raten zusammenhängt, werden die zugrunde liegenden Raten mit Hilfe von Simulationen abgeleitet. Daher sind die kritischen Schritte in d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012924	For growing cells and optimizing population size
150mm Fisherbrand TC Dishes	Fisher Scientific	FB012925	For growing cells and optimizing population size
DESeq2	R Package	v1.44.0	For calculating fold-change
DMEM	Corning	10017CV	For seeding and drugging cells
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	For seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate	Greiner	655090	For seeding and drugging cells
MATLAB	Mathworks	R2024a	For performing FLICK, GRADE, and MEDUSA
Microplate fluorescence reader	Tecan	Spark	For dead cell measurements
Sytox Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	For dead cell measurements
TKOV3 CRISPR library	Addgene	125517	For performing CRISPR screen
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	For permeabilizing cells
Trypan blue	Corning	MT25900CI	For measure live/dead cells