JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מקימים שיטה פרוטאומית מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי עניין מבודדים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין. פרוטוקול זה משמש לניתוח פרוטאום מאזורי רקמה ספציפיים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

Abstract

פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS) מאפשרת ניתוח מקיף של פרוטאום על פני מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל תאים, רקמות ונוזלי גוף. קטעי רקמה קבועים פורמלין, משובצים בפרפין (FFPE), המשמשים בדרך כלל לארכיון ארוך טווח, התגלו כמשאבים יקרי ערך למחקרים פרוטאומיים. מעבר ליתרונות האחסון שלהם, חוקרים יכולים לבודד אזורי עניין (ROI) מאזורי רקמה רגילים באמצעות מאמצים משותפים עם פתולוגים. למרות פוטנציאל זה, עדיין חסרה גישה יעילה לניסויים פרוטאומיים הכוללים בידוד ROI, הכנת דגימות פרוטאומיות וניתוח טרשת נפוצה. בפרוטוקול זה מוצגת זרימת עבודה משולבת המשלבת מקרודיסקציה של החזר ROI, הכנת דגימה מבוססת מלכודת מתלים וניתוח MS בתפוקה גבוהה. באמצעות גישה זו, החזר ה-ROI של רקמות ה-FFPE של המטופלים, המורכב מניאופלזמות ציסטיות סרוזיות שפירות (SCN) וניאופלזמות ריריות פפילריות תוך-צינוריות טרום סרטניות (IPMN) שאובחנו על ידי פתולוגים, נותחו, נאספו ונותחו, וכתוצאה מכך כיסוי פרוטאום גבוה. יתר על כן, זוהו בהצלחה הבדלים מולקולריים בין שתי הניאופלזמות הציסטיות הנפרדות של הלבלב, ובכך הדגימו את הישימות של גישה זו לקידום מחקר פרוטאומי עם רקמות FFPE.

Introduction

במשך עשרות שנים, רקמות אנושיות שנכרתו בניתוח נשמרו בארכיון כבלוקים קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין (FFPE). גושי רקמה אלה משמרים בתחילה את המבנה התלת מימדי (תלת מימדי) המוטבע בפרפין. הרקמות נחתכות לאחר מכן באמצעות מיקרוטומים, מותקנות על שקופיות, ומוכתמות - בדרך כלל בהמטוקסילין ואאוזין (HE) או אימונוהיסטוכימיה (IHC) - כדי להקל על אבחון היסטופתולוגי על ידי פתולוגים מנוסים 1,2. רקמות FFPE מציעות יתרונות מובהקים לאחסון לטווח ארוך בשל קישור החלבון המושרה על ידי פורמלין, שעוצר את הפעילות האנזימטית והפרוטאוליטית3. מכיוון שהן תומכות בבניית ערכות דגימות גדולות ומאוחסנות היטב, רקמות FFPE נחשבו כאבן פינה לגילוי סמנים ביולוגיים בתחומים מגוונים, כולל גנומיקה 4,5,6,7.

עם זאת, היישום שלהם בפרוטאומיקה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS) הציב אתגרים היסטוריים. מגבלה מרכזית היא קישור החלבון המושרה על ידי פורמלין, המפריע לעיכול טריפטי - שלב קריטי בניתוח פרוטאום גלובלי8. יתר על כן, הכמות הקטנה של חלבון הניתנת לאחזור משקופיות רקמות הופכת לעתים קרובות את שיטות הכנת הדגימה הקונבנציונליות ללא מתאימות. למרות אתגרים אלה, ההתקדמות הוכיחה כי ניתן להפוך קישורים צולבים של חלבונים באמצעות טיפול ממושך בטמפרטורה גבוהה 9,10,11. במקביל, שיטות הכנת דגימות המותאמות לדגימות חלבון בכמות נמוכה הרחיבו את השימוש ברקמות FFPE במחקר פרוטאומיקה 12,13,14,15.

יתרון משמעותי אחד של שימוש בשקופיות רקמה FFPE בפרוטאומיקה טמון ביכולתן לאפשר ניתוח ספציפי לאזור. שקופיות FFPE מכילות בדרך כלל גם נגעים וגם רקמה תקינה סמוכה (ANT). ניתוח הרקמה כולה ללא הבחנה מסתכן בתוצאות מבלבלות עקב חתימות מולקולריות מעורבות. לעומת זאת, בידוד וניתוח אזורי עניין (ROIs) - נגעים לעומת ANT - מאפשר אפיון מדויק יותר של תכונות מולקולריות ספציפיות לאזורים פתולוגיים. כתוצאה מכך, גישות מבוססות FFPE הפכו פופולריות יותר ויותר במחקרי פרוטאומיקה 16,17,18,19,20. למרות היישום ההולך וגדל שלהם, זרימת עבודה יעילה המתארת את כל הניסוי הפרוטאומי צעד אחר צעד עדיין נדירה. בפרט, פרוטוקול מבוסס וידאו לא פורסם.

במחקר זה, הוקם זרימת עבודה פרוטאומיקה חזקה מבוססת LC-MS המותאמת לפרופיל מדויק של שינויים מולקולריים באזורים ספציפיים לנגע. באמצעות רקמות FFPE שאובחנו על ידי שני פתולוגים, החזר ה-ROI מניאופלזמות ציסטיות סרוזיות שפירות (SCN) וניאופלזמות ריריות פפילריות תוך-צינוריות טרום סרטניות (IPMN) נותחו, נאספו ונותחו. הפרוטוקול משלב מקרודיסקציה של החזר ROI, הכנת דגימה מבוססת לכידת השעיה המותאמת לכניסות חלבון מינימליות, וניתוח רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA)-MS בטווח צר. שיטה זו אפשרה זיהוי של למעלה מ-9,000 חלבונים מאזורי רקמה בגודל של כ-1 סמ"ר, תוך פענוח חתימות פרוטאומיות מובהקות הקשורות ל-SCN ו-IPMN.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה נבדק ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של סיאול (IRB מס' 1904-114-1028). כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב להשתתף במחקר. מידע מפורט על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה מוצג בטבלת החומרים.

1. אחזור אנטיגן רקמות FFPE להכנת דגימות פרוטאומיקה

הערה: ודא שהאזמלים וכל החומרים, כגון הצינור המשמש, סטריליים כדי למנוע זיהום צולב. ניתן להתאים את הפרוטוקולים של מחקר זה לכל רקמת FFPE עם שינויים קלים בהתבסס על הגדרת המעבדה.

  1. חותכים קטעי רקמה FFPE של 10 מיקרומטר מגושי רקמות FFPE בהרכבה שלמה ומניחים אותם על שקופיות זכוכית.
    הערה: במחקר זה, נעשה שימוש ברקמת FFPE של ציסטה בלבלב אנושי (שני סוגים שונים של רקמה ציסטית-SCN ו-IPMN) להכנת דגימות פרוטאומיקה.
  2. הסר בזהירות שעוות פרפין מרקמת FFPE (דה-פרפיניזציה) בשתי שטיפות בקסילן: אחת למשך 5 דקות והשנייה למשך 2 דקות.
  3. לחות את הרקמה באמצעות שטיפה סדרתית עם תערובת אתנול מדורגת: 3 דקות כל אחת ב-100%, 85%, 70% ו-50% אתנול, ולאחר מכן שטיפה במים נטולי יונים.
    הערה: ודא שקסילן ואתנול מטופלים במכסה אדים כימי.

2. מיצוי חלבון רקמת FFPE

  1. הכן שקופית רקמה מוכתמת HE- או IHC שעליה מצוין החזר ROI על ידי פתולוגים.
  2. הנח את שקופית הרקמה הלא מוכתמת ואת מגלשת הרקמה המוכתמת כשהצדדים האחוריים שלהם פונים זה לזה, מיישרים אותם יחד. ודא שהחזר ה-ROI נצפה דרך שקופית הזכוכית.
  3. הסר אזורי רקמה שאינם מעניינים באמצעות האזמל.
    הערה: אם יש לנתח את הרקמה הנורמלית הסמוכה, אסוף אותם בצינורות האחרים.
  4. מגרדים את החזר ה-ROI של הרקמה למרכז השקופית באמצעות האזמל ומעבירים אותם לצינורות הקישור הנקיים של 1.5 מ"ל חלבון נמוך.
  5. הוסף 180 מיקרוליטר של מאגר ליזה נתרן דודציל סולפט (SDS) (5% SDS, 2 מ"מ טריס (2-קרבוקסיאתיל)פוספין) [TCEP], 300 מ"מ pH 8.5 Tris-HCl במים נטולי יונים) לכל צינור.
    הערה: ודא שנפח מאגר הליזיס מספיק כדי להמיס את הרקמה במהלך סוניקציה ולהשעות את החלבונים המופקים. חיץ לא מספיק יכול להוביל לליזה לא שלמה של רקמות, בעוד שמאגר מוגזם עלול לדלל את ליזט החלבון.
  6. בצע סוניקציה של בדיקה במשרעת של 20%, תוך הפעלת 10 מחזורים של 5 שניות הפעלה ו-5 שניות כבוי.
  7. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 3.5 שעות עם 1,000 x גרם.
    הערה: בצע סוניקציה במים של הדגימות למשך דקה אחת בכל שעה במהלך הדגירה למיצוי חלבון יעיל.
  8. לאחר הדגירה, יש לקרר את הדגימה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות. צנטריפוגה של הדגימות ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-RT כדי להפריד פסולת רקמה מהסופרנטנט.
  9. יש לאסוף את הסופרנטנט לתוך שפופרת נקייה עם תווית ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

3. כימות חלבון של ליזאט רקמת FFPE

הערה: רוב שלבי בדיקת החומצה הביצינכונית לכימות חלבון מבוססים על הוראות היצרן עם שינויים קלים. מומלץ להכין ריאגנטים בהתאם להנחיות היצרן.

  1. הכן תקני אלבומין בסרום בקר (BSA) בריכוז משתנה על ידי דילול סדרתי של תמיסת המלאי (2 מ"ג/מ"ל של BSA). במידת הצורך, יש לדלל דגימות עם מקדם דילול של 20 או 40.
  2. הכן את המים נטולי היונים כריק ואת מאגר הליזיס SDS כבקרת דגימה.
  3. פיפטה 9 מיקרוליטר של תקנים, ריק, בקרת דגימה ודגימות למרכז באר המיקרופלייט.
  4. הוסף 4 מיקרוליטר של תמיסת ריאגנט תאימות לדגימה בכל באר.
  5. מכסים את הצלחת ומערבבים על שייקר צלחת במהירות בינונית למשך דקה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. הוסף 260 מיקרוליטר של מגיב העבודה BCA לכל באר, ולאחר מכן דגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  7. מצננים את הצלחת ב-RT למשך 3 דקות.
  8. מדוד את ספיגת הבארות ב-562 ננומטר בקורא צלחות.
  9. הפחיתו את ערך הספיגה של 562 ננומטר של הריק מזה של כל הדגימות ובקרת הדגימה.
  10. יתר על כן, הפחיתו את ערך הספיגה של 562 ננומטר של בקרת דגימה מופחתת ריקה מזה של כל הדגימות.
  11. שרטט והשתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את ריכוז החלבון של כל דגימה.
    הערה: ודא ש-200-250 מיקרוגרם של חלבונים מופקים משלוש שקופיות זכוכית של רקמות FFPE, כל אחת בשטח משוער של 1 ס"מ2.

4. משקעי אצטון של חלבון

הערה: ודא שבסך הכל 100-300 מיקרוגרם חלבון משמש למשקעי אצטון ועיכול חלבון מבוסס לכידת תרחיף.

  1. הנח את דגימת החלבון (המתאימה ל-100-300 מיקרוגרם) בצינור תואם אצטון.
  2. הוסף -20 מעלות צלזיוס אצטון בנפח פי חמישה מנפח הדגימה לצינור.
  3. דוגרים את התערובת בחום של -20 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
  4. צנטריפוגה את הצינור ב-16,000 x גרם למשך 15 דקות.
  5. השלך בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור החלבון.
  6. הוסף 500 מיקרוליטר של -20 מעלות צלזיוס אצטון וחזור על שלבים 4.4-4.5.
  7. יבש את הדגימה באוויר.

5. עיכול חלבון מבוסס לכידת השעיה

הערה: הליך עיכול החלבון המבוסס על מסנן לכידת מתלים הותאם מהוראות היצרן עם שינויים קלים.

  1. הכן מאגר ליזיס לכידת מתלים (5% SDS, 5 מ"מ TCEP, 50 מ"מ pH 8.5 TEAB במים נטולי יונים).
  2. הוסף 40 מיקרוליטר של המאגר לצינור הדגימה ומערבולת היטב כדי להמיס את גלולת החלבון המיובשת באוויר.
  3. דגרו את הדגימה ב-100 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-1,000 x גרם למשך 35 דקות.
  4. הוסף לדגימה 10 מיקרוליטר של המגיב האלקילציה (100 מ"מ כלורואצטמיד [CAA] ב-100 מ"מ pH 8.5 טטרה-אתילאמוניום ברומיד [TEAB]).
  5. דגירה ב-RT עם טלטול ב-300 x גרם למשך שעה.
  6. הכן בזהירות חומר מחמצן (10% חומצה טריפלואורואצטית [TFA] במים נטולי יונים). ודא ש-TFA, חומצה חזקה, מטופלת במכסה אדים כימי.
  7. הוסף 5 מיקרוליטר של מחמצן לדגימה כדי להשיג ריכוז סופי של 1% TFA (נפח הדגימה הסופי: 55 מיקרוליטר).
  8. בדוק את ה-pH של הדגימה באמצעות נייר pH. ודא שה-pH נמוך מ-1.
  9. הוסף לדגימה 350 מיקרוליטר של מאגר קשירה/שטיפה-1 (0.1 M pH 8.5 TEAB ב-90% MeOH) כדי ללכוד חלבונים.
    הערה: הימנע ממערבולת וצנטריפוגה במהלך לכידת החלבון (שלב 5.9) כדי למנוע אובדן דגימה. כמויות מספיקות של חלבון מבטיחות היווצרות חלקיקי חלבון קולואידים גלויים בעלי מראה שקוף.
  10. הנח את עמוד לכידת המתלים לתוך צינור של 2 מ"ל והעביר את כל הדגימה, כולל כל חומר בלתי מסיס, לתוך עמוד לכידת המתלים.
  11. צנטריפוגה של העמודה ב-4,000 x g למשך 50 שניות כדי ללכוד חלבונים.
    הערה: ודא שכל הדגימה עוברת דרך העמודה; אם לא, חזור על הצנטריפוגה עד לסינון מלא.
  12. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר הכביסה-2 (50% CHCl3/50% MeOH) לעמודה, צנטריפוגה ב-4000 x גרם למשך 50 שניות, והשליך את הזרימה.
  13. חזור על שלב 5.12 שלוש פעמים.
  14. הוסף 400 מיקרוליטר של המאגר-1, צנטריפוגה ב-4000 x גרם למשך 50 שניות, והשליך את הזרימה.
  15. חזור על שלב 5.14 שלוש פעמים.
  16. צנטריפוגה ב-4000 x גרם למשך 1.25 דקות כדי להבטיח את כל המעבר של מאגר-1.
  17. העבר את עמוד לכידת המתלים לצינור דגימה חדש לעיכול אנזימטי.
  18. הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר עיכול (0.16 מיקרוגרם/מיקרוליטר של טריפסין/Lys-C ב-50 מ"מ pH 8.5 TEAB) לעמוד לכידת המתלים ומכסה אותו כדי למנוע אידוי.
    הערה: יחס הטריפסין/Lys-C צריך להיות 1:10 (משקל/משקל). יש לוודא מינימום של 10 מיקרוגרם של טריפסין/Lys-C לעיכול יעיל.
  19. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות ללא ניעור.
  20. הכן את מאגרי הפליטה הבאים: מאגר-1 (50 מ"מ pH 8.5 TEAB במים נטולי יונים), מאגר-2 (0.2% FA במים נטולי יונים) ומאגר-3 (50% אצטוניטריל [ACN] במים נטולי יונים).
  21. הוסף 80 מיקרוליטר של מאגר פליטה-1 לעמודת הלכידת המתלים והצנטריפוגה ב-4000 x גרם למשך 1.25 דקות.
  22. חזור על שלב 5.20 עם 80 מיקרוליטר של מאגר פליטה-2 ומאגר-3.
  23. אסוף פפטידים והעביר אותם לצינור נקי וחדש.

6. כימות פפטידים

הערה: רוב השלבים של בדיקת פפטיד קולורימטרי כמותי מותאמים מהוראות היצרן עם שינויים קלים. מומלץ להכין ריאגנטים בהתאם להנחיות היצרן.

  1. הכן סדרת תקנים על ידי דילול סדרתי של תמיסת המלאי של התקן (1 מ"ג/מ"ל). במידת הצורך, יש לדלל דגימות באמצעות מקדם דילול של 4 או 5.
  2. הכן את המים נטולי היונים כריק ותערובת של מאגר פליטה-1, מאגר-2 ומאגר-3 בפרופורציות שוות כבקרת דגימה.
  3. הנח 20 מיקרוליטר של תקנים, ריקים, בקרת דגימה ודגימות במרכז כל באר מיקרופלייט.
  4. מוסיפים 180 מיקרוליטר מהמגיב העובד לכל באר ומערבבים היטב את הצלחת על שייקר צלחת למשך דקה.
  5. מכסים את הצלחת ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  6. הניחו לצלחת להתקרר ב-RT למשך 3 דקות.
  7. מדוד את ספיגת הבארות ב-480 ננומטר באמצעות קורא צלחות.
  8. הפחיתו את ערך הספיגה של 480 ננומטר של הריק מזה של כל הדגימות ובקרת הדגימה.
  9. יתר על כן, הפחיתו את ערך הספיגה של 480 ננומטר של בקרת דגימה מופחתת ריקה מזה של כל הדגימות.
  10. שרטט והשתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לחשב את ריכוז הפפטיד עבור כל דגימה.

7. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה

  1. לאחר כימות פפטידים, ליופיליזציה של 20 מיקרוגרם של פפטידים.
  2. ממיסים מחדש פפטידים ב-40 מיקרוליטר של חוצץ מימי (3% ACN ב-0.1% חומצה פורמית [FA]) מים) למשך 10 דקות באמבט סוניקציה. ריכוז הפפטיד המתקבל יהיה 0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
  3. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 x גרם למשך 60 דקות והעבירו את הדגימות לבקבוקונים לניתוח טרשת נפוצה.
  4. הזרקו 2 מיקרוליטר מכל דגימה באמצעות הדגימה האוטומטית של מערכת הננו LC-MS/MS.
  5. הפרד פפטידים על עמודה הפוכה (0.075 מ"מ קוטר פנימי x עמודה 150 מ"מ, ארוז בחומר C18 של 3 מיקרומטר, תוך שימוש בשיפוע של 127 דקות של 5%-35% אצטוניטריל ב-100 ננוטר/דקה. יינון הפפטידים באמצעות מקור יונים ננו-ספריי והעברתם לספקטרומטר מסה מבוסס אורביטרפ.
  6. לנתח פפטידים באמצעות שיטת רכישה צרת טווח בלתי תלויה בנתונים21.
  7. החל את הגדרת הפרמטר הבאה של MS: טווח MS m/z: 495-745, יעד רזולוציה: 15000, יעד AGC: 3 x 10E6, זמן הזרקה מקסימלי: אוטומטי, חלון MS/MS: מוגדר על ידי המשתמש (קובץ משלים 1), יעד רזולוציה: 45000, יעד AGC 3 x 10E6, זמן הזרקה מקסימלי: אוטומטי, אנרגיית התנגשות HCD: 22%, 26%, 30%.
    הערה: מומלץ לבצע בדיקת איכות ראשונית של המכשיר על ידי ניתוח דגימות סטנדרטיות לפני הניתוח. השתמש בתוכנת רכישת הנתונים של MS כדי להגדיר פרמטרים (עיין בטבלת החומרים).

8. ניתוח נתונים לחיפוש פרוטאומיקה

הערה: לחיפוש פרוטאומי של נתונים גולמיים של MS, נעשה שימוש בכלי קוד פתוח להמרת פורמט נתונים LC-MS ולביצוע חיפוש פרוטאום (עיין בטבלת החומרים). הפרמטרים המשמשים לניתוח הנתונים מפורטים בקובץ משלים 2. להוראות שימוש בסיסיות עבור כלי קוד פתוח, עיין בקישור הכלול בטבלת החומרים.

  1. הסתר את קבצי הספקטרום הגולמיים של MS/MS (*.raw) המתקבלים מ-LC-MS לפורמט *.mzML באמצעות תוכנת קוד פתוח.
  2. השתמש בקבצים הגולמיים שהומרו בפורמט (*.mzML) כקלט עבור מנוע חיפוש בקוד פתוח כדי לבצע את חיפוש הפרוטאום.
  3. התחל חיפוש פרוטאומי על סמך הפרמטרים המפורטים בקובץ משלים 2.

9. ניתוח סטטיסטי

הערה: לניתוח סטטיסטי לזיהוי חלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, נעשה שימוש בכלי קוד פתוח לביצוע ניתוח חד-משתני (למשל, מבחן t של סטודנט; עיין בטבלת החומרים). מומלץ לעיין בהוראות השימוש הבסיסיות של כלי הקוד הפתוח באמצעות הקישור המופיע בטבלת החומרים.

  1. ייבא את רשימת החלבונים המזוהים (*.txt) לכלי הקוד הפתוח.
  2. סווג דגימות לקבוצות. למחקר זה יועדו שתי קבוצות: SCN ו-IPMN.
  3. בצע טרנספורמציה של לוג2 של ערכי השפע כדי להתאים את התפלגות הנתונים להתפלגות נורמלית משוערת.
  4. החל שלב סינון כדי להסיר חלבונים עם ערכים חסרים. במחקר זה, נדרשו לפחות שני ערכים תקפים בכל קבוצה להכללה.
  5. ייחוס ערכים חסרים באמצעות גישה מבוססת התפלגות נורמלית כדי ליצור רשימה מקיפה של חלבונים כמותיים לניתוח חד-משתני לאחר מכן.
  6. בצע מבחן t של סטודנט לזיהוי חלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין שתי הקבוצות. במחקר זה, יושם תיקון שיעור גילוי שווא (FDR) של בנימיני-הוכברג.
  7. חלץ את החלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי העומדים בקריטריונים הבאים: Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 ו- |fold- change| ≥ 2.

10. ניתוח ביואינפורמטי

הערה: כלי ביואינפורמטיקה מסחרי שימש לניתוח ייצוג יתר (למשל, ניתוח מסלול ההמצאה, עיין בטבלת החומרים). לפני השימוש בכלי זה, מומלץ לעיין בהוראות היצרן.

  1. ייבא את רשימת ה- DEP (*.txt) לכלי המסחרי.
  2. ליזום ניתוח ליבה לביצוע ניתוח ייצוג יתר.
  3. ייצוא מסלולים קנוניים משמעותיים המועשרים מה-DEP באמצעות המבחן המדויק של פישר (ערך p מתואם < 0.05). זהה מסלולים מעניינים הרלוונטיים למחקר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הכנת דגימת פרוטאומיקה מבוססת מסנן לכידת תרחיף מבוססת, בשילוב עם כימות ללא תווית באמצעות רכישה בלתי תלויה בנתונים בזריקה אחת, יושמו על רקמות FFPE ציסטיות בלבלב (איור 1). בידוד מדויק של החזר ROI במהלך עיבוד רקמת FFPE הושג על פני רקמות FFPE ציסטיות שונות בלבלב (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטת פרוטאומיקה מהירה ויעילה המשתמשת ב-ROIs המבודדים מקטעי רקמת FFPE המותקנים על שקופיות זכוכית לאבחון פתולוגי. כאשר התערבות כירורגית מועילה, ניאופלזמות מוצקות כגון סרטן וציסטות נכרתות בניתוח ונשמרות להערכה פתולוגית. לאחסון לטווח ארוך, הרקמות מקובעות בפו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר

Acknowledgements

כל הדמויות במאמר זה נוצרו באמצעות BioRender (http://www.biorender.com). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) (מענק מס. RS-2023-00253403 ו-RS-2024-00454407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% FA in ACN (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS120-212
0.1% FA in Water (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS118-4
0.5M TCEPThermo Scientific77720
10% SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8.5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8.5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14C centrifugeSatorious167709
Acetone (HPLC grade)Fisher ScientificA949-4
ACN (HPLC grade)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (HPLC grade)Thermo Scientific022920.k2
CR paperADVANTEC70406001
DIA-NN ver 1.9 Open source https://github.com/vdemichev/DiaNNProteomics Search Engine 
EPOCH2 microplate readerAgilent 2106208
EthanolMERCKK50505283 836
FA (LC-MS grade)Fisher ChemicalA117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)QIAGEN830018Bioinformatics tool
Lyophilizer (SRF110R+vaper trap)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (HPLC grade)MERCKUN1230
Microplate BCA protein Assay kit-Reducing Agent CompatibleThermo Scientific23252
MSConvert Open source http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlMS data transformation software
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 separation column Thermo ScientificES903
PerseusOpen sourcehttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlStatistical tool
PIERCE chloroacetamide No-Weigh FormatThermo ScientificA39270
PIERCE Quantitative colorimetric peptide AssayThermo Scientific23275
Plate shaker Green SSerikerVS-202D
Probe sonicatorVibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431081
QSP 10 µL pipette TipThermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µL pipette TipThermo ScientificTLR106RS-Q
ScalpelBard-Parker372615
S-Trap: Rapid Universal MS sample PrepPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsin/Lys-C (LC-MS grade)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (HPLC grade)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS data acquisition software
XyleneSigma-Aldrich102033629

References

  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved