JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы создали протеомный метод, основанный на масс-спектрометрии, с использованием изолированных областей интереса в фиксированных формалином и залитых парафином срезах ткани. Этот протокол используется для анализа протеома из определенных областей тканей в архивных фиксированных формалином и залитых парафином срезах ткани.

Аннотация

Протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) позволяет проводить комплексный протеомный анализ широкого спектра биологических образцов, включая клетки, ткани и жидкости организма. Фиксированные формалином, залитые парафином (FFPE) срезы тканей, обычно используемые для долгосрочного архивирования, стали ценным ресурсом для протеомных исследований. Помимо преимуществ хранения, исследователи могут изолировать области интереса (ROI) от нормальных областей тканей благодаря совместным усилиям с патологоанатомами. Несмотря на этот потенциал, оптимизированный подход к протеомным экспериментам, включающий выделение ROI, протеомную пробоподготовку и анализ МС, по-прежнему отсутствует. В этом протоколе представлен интегрированный рабочий процесс, сочетающий макродиспарирование ROI, подготовку образцов на основе захвата суспензии и высокопроизводительный анализ МС. С помощью этого подхода были макродиспарированы, собраны и проанализированы ROI тканей FFPE пациентов, состоящих из доброкачественных серозных кистозных новообразований (СХН) и предраковых внутрипротоковых папиллярных муцинозных новообразований (ИПМН), диагностированных патологоанатомами, что привело к высокому покрытию протеома. Кроме того, были успешно идентифицированы молекулярные различия между двумя различными кистозными новообразованиями поджелудочной железы, что продемонстрировало применимость этого подхода для продвижения протеомных исследований с тканями FFPE.

Введение

На протяжении десятилетий хирургически удаленные человеческие ткани архивировались в виде фиксированных формалином и залитых парафином блоков (FFPE). Эти тканевые блоки изначально сохраняют трехмерную (3D) структуру, встроенную в парафин. Затем ткани разрезают с помощью микротомов, насаживают на предметные стекла и окрашивают — обычно гематоксилином и эозином (ПЭ) или иммуногистохимией (ИГХ) — для облегчения гистопатологической диагностики опытными патологоанатомами 1,2. Ткани FFPE обладают явными преимуществами для длительного хранения благодаря индуцированной формалином сшивке белков, которая останавливает ферментативную и протеолитическую активность3. Поскольку они поддерживают создание больших, хорошо архивированных наборов образцов, ткани FFPE считаются краеугольным камнем для открытия биомаркеров в различных областях, включая геномику 4,5,6,7.

Тем не менее, их применение в протеомике на основе жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС) исторически создавало проблемы. Ключевым ограничением является индуцированная формалином сшивка белков, которая препятствует триптическому перевариванию, что является критическим шагом вглобальном анализе протеома. Кроме того, небольшое количество белка, извлекаемого из предметных стекол, часто делает традиционные методы подготовки образцов непригодными. Несмотря на эти проблемы, достижения показали, что белковые сшивки могут быть обращены вспять с помощью длительной высокотемпературной обработки 9,10,11. В то же время, методы пробоподготовки, оптимизированные для образцов с низким содержанием белка, расширили использование тканей FFPE в исследованиях протеомики 12,13,14,15.

Одним из существенных преимуществ использования тканевых стекол FFPE в протеомике является их способность проводить анализ, специфичный для региона. Предметные стекла FFPE обычно содержат как поражения, так и прилегающие нормальные ткани (ANT). Анализ всей ткани без разбора рискует исказить результаты из-за смешанных молекулярных сигнатур. Напротив, выделение и анализ областей интереса (ROI) — поражения в сравнении с ANT — позволяет более точно охарактеризовать молекулярные особенности, специфичные для патологических областей. Следовательно, подходы, основанные на FFPE, становятся все более популярными в исследованиях протеомики 16,17,18,19,20. Несмотря на растущее их применение, оптимизированный рабочий процесс, который бы описывал весь протеомный эксперимент шаг за шагом, все еще остается дефицитным. В частности, не был опубликован протокол на основе видео.

В этом исследовании был разработан надежный протеомный рабочий процесс на основе ЖХ-МС, предназначенный для точного профилирования молекулярных изменений в областях, специфичных для поражения. С использованием тканей FFPE, диагностированных двумя патологоанатомами, были макродиспарированы, собраны и проанализированы ROI доброкачественных серозных кистозных новообразований (SCN) и предраковых внутрипротоковых папиллярных муцинозных новообразований (IPMN). Протокол включает в себя макроанализ ROI, подготовку образцов на основе захвата суспензии, оптимизированную для минимального ввода белка, и анализ с помощью узкого диапазона, независимого от сбора данных (DIA)-MS. Этот метод позволил идентифицировать более 9000 белков из областей тканей размером около 1 см², расшифровав отчетливые протеомные сигнатуры, связанные с SCN и IPMN.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Это исследование было рассмотрено и одобрено Институциональным наблюдательным советом больницы Сеульского национального университета (IRB No 1904-114-1028). Все участники предоставили письменное информированное согласие на участие в исследовании. Подробная информация обо всех материалах, использованных в данном протоколе, представлена в Таблице материалов.

1. Забор тканевого антигена FFPE для протеомной пробоподготовки

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что скальпели и все материалы, такие как используемая трубка, стерильны, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Протоколы данного исследования могут быть адаптированы для любой ткани FFPE с незначительными изменениями в зависимости от лабораторных условий.

  1. Вырежьте срезы ткани FFPE размером 10 мкм из блоков ткани FFPE цельного крепления и поместите их на предметные стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании ткань FFPE кисты поджелудочной железы человека (два разных типа кистозной ткани - SCN и IPMN) использовалась для подготовки образцов протеомики.
  2. С осторожностью удалите парафин из ткани FFPE (депарафинизируйте) двумя промывками в ксилоле: одно в течение 5 минут, а другое в течение 2 минут.
  3. Регидратируйте ткань с помощью последовательного промывания смесью градуированного этанола: по 3 мин в 100%, 85%, 70% и 50% этаноле с последующим полосканием в деионизированной воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ксилол и этанол обрабатываются в вытяжном шкафу для химикатов.

2. Экстракция тканевого белка FFPE

  1. Подготовьте HE- или IHC-окрашенный предметный стекал тканей, на котором патологоанатомами указан ROI.
  2. Поместите предметное стекло без пятен и предметное стекло для окрашенной ткани тыльной стороной друг к другу, выровняв их вместе. Убедитесь, что окупаемость инвестиций наблюдается через предметное стекло.
  3. Удалите участки тканей, не представляющие интереса, с помощью скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо проанализировать соседние нормальные ткани, соберите их в другие пробирки.
  4. Соскребите тканевые ROI до центра предметного стекла с помощью скальпеля и перенесите их в чистые пробирки объемом 1,5 мл с низким содержанием белка.
  5. Добавьте в каждую пробирку 180 мкл буфера для лизиса додецилсульфата натрия (SDS, 5 % SDS, 2 мМ трис (2-карбоксиэтил)фосфина) [TCEP], 300 мМ pH 8,5 Tris-HCl в деионизированной воде).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что объем буфера для лизиса достаточен для растворения ткани во время ультразвуковой обработки и для суспензии экстрагированных белков. Недостаточный буфер может привести к неполному лизису тканей, в то время как избыток буфера может разбавить лизат белка.
  6. Проводите ультразвуковую обработку зондом с амплитудой 20%, применяя 10 циклов по 5 с включено и 5 с выключено.
  7. Образцы инкубируют при 100 °C в течение 3,5 ч с концентрацией 1 000 x g.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите ультразвуковую обработку образцов водой в течение 1 минуты каждый час во время инкубации для эффективной экстракции белка.
  8. После инкубации образец охладить при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут. Центрифугируйте образцы при 16 000 x g в течение 10 мин в режиме RT, чтобы отделить остатки тканей от надосадочной жидкости.
  9. Соберите надосадочную жидкость в чистую пробирку с маркировкой и храните при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

3. Количественное определение белка лизата тканей FFPE

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство этапов анализа бицинхониновой кислоты для количественного определения белка основаны на инструкциях производителя с незначительными изменениями. Рекомендуется готовить реактивы в соответствии с рекомендациями производителя.

  1. Приготовьте стандарты бычьего сывороточного альбумина (БСА) различной концентрации путем последовательного разбавления исходного раствора (2 мг/мл БСА). При необходимости разбавляют пробы с коэффициентом разбавления 20 или 40.
  2. Приготовьте деионизированную воду в качестве заготовки и буфер для лизиса SDS в качестве контрольного образца.
  3. Пипетка 9 мкл эталонов, бланк, контроль образцов и образцы в центр микропланшета лунки.
  4. Добавьте 4 мкл раствора совместимого реагента в образец в каждую лунку.
  5. Накройте тарелку крышкой и перемешивайте в шейкере на средней скорости в течение 1 минуты. После этого выдержите тарелку при температуре 37 °C в течение 15 минут.
  6. Добавьте 260 μL рабочего реагента BCA в каждую лунку, а затем инкубируйте планшет при 37 °C в течение 30 минут.
  7. Охладите тарелку при RT в течение 3 минут.
  8. Измерьте поглощение лунок на длине волны 562 нм на планшетном считывателе.
  9. Вычтите значение поглощения заготовки 562 нм из значения всех образцов и контрольных образцов.
  10. Далее вычтите значение поглощения 562 нм для контроля холостого образца из значения всех образцов.
  11. Постройте и используйте стандартную кривую для определения концентрации белка в каждом образце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что примерно 200-250 мкг белков извлечены из трех стеклянных стекол тканей FFPE, каждое из которых имеет приблизительную площадь 1 см2 .

4. Ацетоновое осаждение белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в общей сложности 100-300 мкг белка используется для осаждения ацетона и переваривания белка на основе улавливания суспензии.

  1. Поместите образец белка (соответствующий 100-300 мкг) в пробирку, совместимую с ацетоном.
  2. Добавьте в пробирку ацетон -20 °C в объеме, в пять раз превышающем объем образца.
  3. Выдерживать смесь при температуре -20 °C в течение 18 ч.
  4. Центрифугируйте пробирку при давлении 16 000 x g в течение 15 минут.
  5. Аккуратно утилизируйте надосадочную жидкость, не нарушая белковую гранулу.
  6. Добавьте 500 мкл ацетона -20 °C и повторите шаги 4,4-4,5.
  7. Высушите образец на воздухе.

5. Переваривание белка на основе улавливания суспензии

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура расщепления белка на основе фильтра для улавливания суспензии была адаптирована из инструкции производителя с незначительными изменениями.

  1. Приготовьте буфер для лизиса суспензии (5 % SDS, 5 мМ TCEP, 50 мМ pH 8,5 TEAB в деионизированной воде).
  2. Добавьте 40 μл буфера в пробирку с образцом и тщательно перемешайте, чтобы растворить высушенную на воздухе белковую гранулу.
  3. Образец инкубируют при 100 °C с встряхиванием при 1 000 x g в течение 35 минут.
  4. Добавьте в образец 10 мкл алкилирующего реагента (100 мМ хлорацетамида [CAA] в 100 мМ pH 8,5 тетраэтиламмония бромида [TEAB]).
  5. Инкубировать при РТ с встряхиванием при 300 х г в течение 1 ч.
  6. С осторожностью приготовьте подкислитель (10% трифторуксусной кислоты [ТЖК] в деионизированной воде). Убедитесь, что ТФК, сильная кислота, обрабатывается в вытяжном шкафу для химикатов.
  7. Добавьте в образец 5 μL подкислителя для достижения конечной концентрации 1% TFA (конечный объем образца: 55 μL).
  8. Проверьте pH образца с помощью pH-бумаги. Убедитесь, что pH меньше 1.
  9. Добавьте 350 мкл связывающего/промывочного буфера-1 (0,1 М pH 8,5 TEAB в 90% MeOH) в образец для захвата белков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте завихрения и центрифугирования во время захвата белка (шаг 5.9), чтобы предотвратить потерю пробы. Достаточное количество белка обеспечивает образование видимых частиц коллоидного белка с полупрозрачным внешним видом.
  10. Поместите колонну для улавливания суспензии в пробирку объемом 2 мл и перенесите весь образец, включая любой нерастворимый материал, в колонну для улавливания суспензии.
  11. Центрифугируйте колонку при давлении 4000 x g в течение 50 с, чтобы захватить белки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь образец проходит через колонку; Если нет, повторите центрифугирование до полной фильтрации.
  12. Добавьте 400 μL промывочного буфера-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) в колонку, центрифугируйте при 4000 x g в течение 50 с и выбросьте проточный.
  13. Повторите шаг 5.12 три раза.
  14. Добавьте 400 мкл буфера-1, центрифугируйте при 4000 x g в течение 50 с и выбросьте проточный.
  15. Повторите шаг 5.14 три раза.
  16. Центрифугируйте при 4000 x g в течение 1,25 мин, чтобы обеспечить полное прохождение буфера-1.
  17. Перенесите колонну для улавливания суспензии в новую пробирку для образца для ферментативного разложения.
  18. Добавьте 125 мкл буфера для разложения (0,16 мкг/мкл трипсина/Lys-C в 50 мМ pH 8,5 TEAB) в колонну для улавливания суспензии и закройте ее крышкой, чтобы предотвратить испарение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение трипсин/Lys-C должно быть 1:10 (вес/вес). Обеспечьте минимум 10 мкг трипсина/Lys-C для эффективного пищеварения.
  19. Инкубировать при 37 °C в течение 18 ч без встряхивания.
  20. Приготовьте следующие элюирующие буферы: буфер-1 (50 мМ pH 8,5 TEAB в деионизированной воде), буфер-2 (0,2 % FA в деионизированной воде) и буфер-3 (50 % ацетонитрила [ACN] в деионизированной воде).
  21. Добавьте 80 мкл элюирующего буфера-1 в колонну для улавливания суспензии и центрифугируйте при 4000 x g в течение 1,25 мин.
  22. Повторите шаг 5.20 с 80 мкл элюирующего буфера-2 и буфера-3.
  23. Объедините элюированные пептиды и перенесите их в чистую новую пробирку.

6. Количественное определение пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство этапов количественного колориметрического пептидного анализа адаптированы из инструкции производителя с незначительными изменениями. Рекомендуется готовить реактивы в соответствии с рекомендациями производителя.

  1. Приготовьте ряд стандартов путем последовательного разбавления исходного раствора стандарта (1 мг/мл). При необходимости разбавьте образцы с коэффициентом разбавления 4 или 5.
  2. Приготовьте деионизированную воду в виде заготовки и смесь элюирующего буфера-1, буфера-2 и буфера-3 в равных пропорциях в качестве пробного контроля.
  3. Поместите 20 мкл стандартов, бланк, контрольный образец и образцы в центр каждой лунки микропланшета.
  4. Добавьте по 180 мкл рабочего реагента в каждую лунку и тщательно перемешайте пластину на вибростенде в течение 1 мин.
  5. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте ее при температуре 37 °C в течение 20 минут.
  6. Дайте тарелке остыть при RT в течение 3 минут.
  7. Измерьте поглощение лунок на длине волны 480 нм с помощью планшетного ридера.
  8. Вычтите значение поглощения заготовки 480 нм из значения всех образцов и контрольных образцов.
  9. Далее вычтите значение поглощения 480 нм для контроля холостого образца из всех образцов.
  10. Постройте и используйте стандартную кривую для расчета концентрации пептидов для каждого образца.

7. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрический анализ

  1. После количественного определения пептидов лиофилизировать 20 мкг пептидов.
  2. Повторно растворите пептиды в 40 мкл водного буфера (3 % ACN в 0,1 % воде с муравьиной кислотой [FA]) в течение 10 минут в ультразвуковой ванне. Полученная концентрация пептида составит 0,5 мкг/мкл.
  3. Центрифугируйте образец при давлении 16 000 x g в течение 60 минут и переложите образцы в пробирки для анализа на МС.
  4. Введите 2 мкл каждого образца с помощью автосамплера системы nano LC-MS/MS.
  5. Разделите пептиды на колонке с обратной фазой (0,075 мм ID x 150 мм, упакованной материалом C18 толщиной 3 мкм, используя 127-минутный градиент 5%-35% ацетонитрила при 100 нл/мин. Ионизируйте пептиды с помощью источника ионов с нанораспылением и перенесите их в масс-спектрометр на основе orbitrap.
  6. Анализ пептидов с использованием метода сбора данных в узком диапазоне21.
  7. Примените следующие настройки параметров MS: MS m/z диапазон: 495-745, целевое разрешение: 15000, цель AGC: 3 x 10E6, максимальное время впрыска: авто, окно MS/MS: определено пользователем (Дополнительный файл 1), целевое разрешение: 45000, мишень AGC 3 x 10E6, максимальное время впрыска: авто, энергия столкновения HCD: 22%, 26%, 30%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется провести первоначальную проверку качества прибора путем анализа стандартных образцов перед анализом. Используйте программное обеспечение для сбора данных MS для настройки параметров (см. Таблицу материалов).

8. Анализ данных для поиска протеомики

ПРИМЕЧАНИЕ: Для протеомного поиска исходных данных MS были использованы инструменты с открытым исходным кодом для конвертации формата данных LC-MS и выполнения протеомного поиска (см. Таблицу материалов). Параметры, используемые для анализа данных, подробно описаны в Дополнительном файле 2. Основные инструкции по использованию инструментов с открытым исходным кодом см. по ссылке, приведенной в Таблице материалов.

  1. Скрытие необработанных файлов спектра MS/MS (*.raw), полученных из LC-MS, в формат *.mzML с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом.
  2. Используйте преобразованные в формат необработанные файлы (*.mzML) в качестве входных данных для поисковой системы с открытым исходным кодом для выполнения поиска протеома.
  3. Инициируйте протеомный поиск на основе параметров, указанных в дополнительном файле 2.

9. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистического анализа с целью идентификации дифференциально экспрессируемых белков был использован инструмент с открытым исходным кодом для проведения одномерного анализа (например, t-критерий Стьюдента; см. Таблицу материалов). Рекомендуется ознакомиться с основными инструкциями по использованию инструмента с открытым исходным кодом по ссылке, приведенной в Таблице материалов.

  1. Импортируйте список идентифицированных белков (*.txt) в инструмент с открытым исходным кодом.
  2. Классифицируйте образцы по группам. Для данного исследования были выделены две группы: SCN и IPMN.
  3. Выполните преобразование значений плотности Log2 , чтобы скорректировать распределение данных до приблизительного нормального распределения.
  4. Примените этап фильтрации, чтобы удалить белки с отсутствующими значениями. В этом исследовании для включения требовалось как минимум два действительных значения в каждой группе.
  5. Условное исчисление пропущенных значений с использованием подхода, основанного на нормальном распределении, для создания полного списка количественных белков для последующего одномерного анализа.
  6. Проведите t-критерий Стьюдента, чтобы определить дифференциально экспрессируемые белки между двумя группами. В этом исследовании была применена коррекция коэффициента ложных открытий Бенджамини-Хохберга (FDR).
  7. Извлечь дифференциально экспрессируемые белки, удовлетворяющие следующим критериям: Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 и |кратное изменение| ≥ 2.

10. Биоинформатический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческий инструмент биоинформатики был использован для анализа чрезмерной представленности (например, анализ пути Ingenuity, см. Таблицу материалов). Перед использованием данного средства рекомендуется обратиться к инструкции производителя.

  1. Импортируйте список DEP (*.txt) в коммерческий инструмент.
  2. Инициируйте анализ керна для проведения анализа чрезмерной представленности.
  3. Экспорт значимых канонических путей, обогащенных из DEP, с использованием точного теста Фишера (скорректированное p-значение < 0,05). Определите интересующие вас пути, которые имеют отношение к исследованию.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

К тканям кистозной FFPE поджелудочной железы применяли протеомную пробоподготовку на основе фильтра суспензии в сочетании с безмаркерным количественным определением с использованием однократного сбора, независимого от данных (рис. 1). Точная изоляция ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает быстрый и эффективный метод протеомики, в котором для патологической диагностики используются ROI, выделенные из срезов ткани FFPE, установленных на стеклянных предметных стеклах. Когда хирургическое вмешательство является благоприятным, солид...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не могут заявить о конфликте интересов

Благодарности

Все фигурки в этой статье были созданы с помощью BioRender (http://www.biorender.com). Эта работа была поддержана грантами Национального исследовательского фонда Кореи (NRF) (Grant No. RS-2023-00253403 и RS-2024-00454407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% FA in ACN (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS120-212
0.1% FA in Water (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS118-4
0.5M TCEPThermo Scientific77720
10% SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8.5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8.5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14C centrifugeSatorious167709
Acetone (HPLC grade)Fisher ScientificA949-4
ACN (HPLC grade)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (HPLC grade)Thermo Scientific022920.k2
CR paperADVANTEC70406001
DIA-NN ver 1.9 Open source https://github.com/vdemichev/DiaNNProteomics Search Engine 
EPOCH2 microplate readerAgilent 2106208
EthanolMERCKK50505283 836
FA (LC-MS grade)Fisher ChemicalA117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)QIAGEN830018Bioinformatics tool
Lyophilizer (SRF110R+vaper trap)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (HPLC grade)MERCKUN1230
Microplate BCA protein Assay kit-Reducing Agent CompatibleThermo Scientific23252
MSConvert Open source http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlMS data transformation software
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 separation column Thermo ScientificES903
PerseusOpen sourcehttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlStatistical tool
PIERCE chloroacetamide No-Weigh FormatThermo ScientificA39270
PIERCE Quantitative colorimetric peptide AssayThermo Scientific23275
Plate shaker Green SSerikerVS-202D
Probe sonicatorVibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431081
QSP 10 µL pipette TipThermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µL pipette TipThermo ScientificTLR106RS-Q
ScalpelBard-Parker372615
S-Trap: Rapid Universal MS sample PrepPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsin/Lys-C (LC-MS grade)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (HPLC grade)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS data acquisition software
XyleneSigma-Aldrich102033629

Ссылки

  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены