Un approccio semplificato per la proteomica basata sulla spettrometria di massa utilizzando regioni tissutali selezionate

Riepilogo

Qui, stabiliamo un metodo proteomico basato sulla spettrometria di massa utilizzando regioni isolate di interesse in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Questo protocollo viene utilizzato per analizzare il proteoma proveniente da specifiche aree tissutali in sezioni di tessuto archiviate fissate in formalina e incluse in paraffina.

Abstract

La proteomica basata sulla spettrometria di massa (MS) consente un'analisi completa del proteoma su un'ampia gamma di campioni biologici, tra cui cellule, tessuti e fluidi corporei. Le sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE), comunemente utilizzate per l'archiviazione a lungo termine, sono emerse come risorse preziose per gli studi proteomici. Oltre ai vantaggi dell'archiviazione, i ricercatori possono isolare le regioni di interesse (ROI) dalle normali regioni dei tessuti attraverso sforzi collaborativi con i patologi. Nonostante questo potenziale, rimane carente un approccio semplificato per gli esperimenti proteomici che comprenda l'isolamento del ROI, la preparazione del campione proteomico e l'analisi MS. In questo protocollo, viene presentato un flusso di lavoro integrato che combina la macrodissezione delle ROI, la preparazione del campione basata sul trapping in sospensione e l'analisi MS ad alto rendimento. Attraverso questo approccio, le ROI dei tessuti FFPE dei pazienti, costituite da neoplasie cistiche sierose benigne (SCN) e neoplasie mucinose papillari intraduttali precancerose (IPMN) diagnosticate dai patologi, sono state macrodissezionate, raccolte e analizzate, con conseguente elevata copertura del proteoma. Inoltre, sono state identificate con successo differenze molecolari tra le due distinte neoplasie cistiche pancreatiche, dimostrando così l'applicabilità di questo approccio per far progredire la ricerca proteomica con tessuti FFPE.

Introduzione

Per decenni, i tessuti umani asportati chirurgicamente sono stati archiviati come blocchi fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Questi blocchi di tessuto inizialmente conservano la struttura tridimensionale (3D) incorporata nella paraffina. I tessuti vengono successivamente tagliati utilizzando microtomi, montati su vetrini e colorati, comunemente con ematossilina ed eosina (HE) o immunoistochimica (IHC), per facilitare la diagnosi istopatologica da parte di patologi esperti ^1,2. I tessuti FFPE offrono vantaggi distinti per la conservazione a lungo termine grazie alla reticolazione proteica indotta dalla formalina, che interrompe l'attività enzimatica e proteolitica³. Poiché supportano la costruzione di set di campioni di grandi dimensioni e ben archiviati, i tessuti FFPE sono stati considerati una pietra miliare per la scoperta di biomarcatori in diversi campi, tra cui la genomica 4,5,6,7.

Tuttavia, la loro applicazione nella proteomica basata sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) ha storicamente posto delle sfide. Una limitazione chiave è la reticolazione proteica indotta dalla formalina, che interferisce con la digestione triptica, un passaggio critico nell'analisi globale del proteoma⁸. Inoltre, la piccola quantità di proteine recuperabili dai vetrini di tessuto rende spesso inadatti i metodi convenzionali di preparazione dei campioni. Nonostante queste sfide, i progressi hanno dimostrato che le reticolazioni proteiche possono essere invertite attraverso un trattamento prolungato ad alta temperatura ^9,10,11. Allo stesso tempo, i metodi di preparazione dei campioni ottimizzati per campioni proteici di bassa quantità hanno ampliato l'uso dei tessuti FFPE nella ricerca proteomica 12,13,14,15.

Un vantaggio significativo dell'utilizzo dei vetrini tissutali FFPE in proteomica risiede nella loro capacità di consentire un'analisi region-specific. I vetrini FFPE contengono tipicamente sia lesioni che tessuto normale adiacente (ANT). L'analisi indiscriminata dell'intero tessuto rischia di confondere i risultati a causa di firme molecolari miste. Al contrario, l'isolamento e l'analisi delle regioni di interesse (ROI) - lesioni rispetto a ANT - consente una caratterizzazione più precisa delle caratteristiche molecolari specifiche delle regioni patologiche. Di conseguenza, gli approcci basati su FFPE sono diventati sempre più popolari negli studi di proteomica 16,17,18,19,20. Nonostante la loro crescente applicazione, un flusso di lavoro semplificato che descriva l'intero esperimento proteomico passo dopo passo rimane ancora scarso. In particolare, non è stato pubblicato un protocollo basato su video.

In questo studio, è stato stabilito un robusto flusso di lavoro proteomico basato su LC-MS su misura per la profilazione accurata dei cambiamenti molecolari all'interno di regioni specifiche della lesione. Utilizzando tessuti FFPE diagnosticati da due patologi, sono stati macrodissezionati, raccolti e analizzati i ROI delle neoplasie sierose cistiche benigne (SCN) e delle neoplasie mucinose papillari intraduttali precancerose (IPMN). Il protocollo incorpora una macrodissezione delle ROI, una preparazione del campione basata sull'intrappolamento in sospensione ottimizzata per input proteici minimi e l'analisi DIA)-MS con acquisizione indipendente dai dati (DIA) a intervallo ristretto. Questo metodo ha permesso l'identificazione di oltre 9.000 proteine da aree tissutali di circa 1 cm², decifrando distinte firme proteomiche associate a SCN e IPMN.

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Protocollo

Questo studio è stato esaminato e approvato dall'Institutional Review Board dell'Ospedale Universitario Nazionale di Seoul (IRB n. 1904-114-1028). Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto per partecipare allo studio. Informazioni dettagliate su tutti i materiali utilizzati in questo protocollo sono presentate nella Tabella dei materiali.

1. Recupero dell'antigene tissutale FFPE per la preparazione di campioni di proteomica

NOTA: Assicurarsi che i bisturi e tutti i materiali, come il tubo utilizzato, siano sterili per evitare qualsiasi contaminazione incrociata. I protocolli di questo studio possono essere adattati per qualsiasi tessuto FFPE con piccole modifiche in base alla configurazione di laboratorio.

1. Tagliare sezioni di tessuto FFPE da 10 μm da blocchi di tessuto FFPE a montaggio intero e posizionarle su vetrini.
   NOTA: In questo studio, il tessuto FFPE della cisti pancreatica umana (due diversi tipi di tessuto cistico-SCN e IPMN) è stato utilizzato per la preparazione del campione di proteomica.
2. Rimuovere la cera di paraffina dal tessuto FFPE (deparaffinizzare) con due lavaggi in xilene con cautela: uno per 5 minuti e un altro per 2 minuti.
3. Reidratare il tessuto attraverso un lavaggio seriale con una miscela di etanolo graduato: 3 minuti ciascuno in etanolo al 100%, 85%, 70% e 50%, seguito da un risciacquo in acqua deionizzata.
   NOTA: Assicurarsi che lo xilene e l'etanolo siano maneggiati in una cappa chimica.

2. Estrazione di proteine tissutali FFPE

1. Preparare un vetrino di tessuto colorato con HE o IHC su cui la ROI è indicata dai patologi.
2. Posizionare il vetrino di tessuto non colorato e il vetrino di tessuto colorato con i lati posteriori uno di fronte all'altro, allineandoli insieme. Assicurati che il ROI sia osservato attraverso il vetrino.
3. Rimuovere le regioni di tessuto non interessate utilizzando il bisturi.
   NOTA: Se è necessario analizzare il tessuto normale adiacente, raccoglierlo nelle altre provette.
4. Raschiare le ROI tissutali al centro del vetrino utilizzando il bisturi e trasferirle nelle provette pulite da 1,5 ml a basso contenuto proteico.
5. Aggiungere 180 μL di tampone di lisi dodecil solfato di sodio (SDS) (5 % SDS, 2 mM tris (2-carbossietil)fosfina) [TCEP], 300 mM pH 8,5 Tris-HCl in acqua deionizzata) in ciascuna provetta.
   NOTA: Assicurarsi che il volume del tampone di lisi sia sufficiente per solubilizzare il tessuto durante la sonicazione e per sospendere le proteine estratte. Un tampone insufficiente può portare a una lisi tissutale incompleta, mentre un tampone eccessivo può diluire il lisato proteico.
6. Eseguire la sonicazione della sonda con un'ampiezza del 20%, applicando 10 cicli di 5 s on e 5 s off.
7. Incubare i campioni a 100 °C per 3,5 ore con 1.000 x g.
   NOTA: Eseguire la sonicazione con acqua dei campioni per 1 minuto ogni ora durante l'incubazione per un'estrazione efficiente delle proteine.
8. Dopo l'incubazione, raffreddare il campione a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 10 minuti a RT per separare i detriti tissutali dal surnatante.
9. Raccogliere il surnatante in una provetta pulita ed etichettata e conservarlo a -80 °C fino a nuovo utilizzo.

3. Quantificazione proteica del lisato tissutale FFPE

NOTA: La maggior parte delle fasi del dosaggio dell'acido bicinconinico per la quantificazione delle proteine si basano sulle istruzioni del produttore con piccole modifiche. Si raccomanda di preparare i reagenti secondo le linee guida del produttore.

1. Preparare standard di albumina sierica bovina (BSA) a concentrazione variabile diluendo in serie la soluzione madre (2 mg/mL di BSA). Se necessario, diluire i campioni con un fattore di diluizione di 20 o 40.
2. Preparare l'acqua deionizzata come bianco e il tampone di lisi SDS come controllo del campione.
3. Pipettare 9 μL di standard, bianco, controllo del campione e campioni al centro del pozzetto della micropiastra.
4. Aggiungere 4 μl di soluzione di reagente di compatibilità al campione in ciascun pozzetto.
5. Coprire il piatto e mescolare su uno shaker a velocità media per 1 min. Successivamente, incubare la piastra a 37 °C per 15 minuti.
6. Aggiungere 260 μl del reagente di lavoro BCA in ciascun pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti.
7. Raffreddare la piastra a RT per 3 min.
8. Misurare l'assorbanza dei pozzetti a 562 nm su un lettore di piastre.
9. Sottrarre il valore di assorbanza di 562 nm del bianco da quello di tutti i campioni e del controllo del campione.
10. Inoltre, sottrarre il valore di assorbanza di 562 nm del controllo del campione sottratto in bianco da quello di tutti i campioni.
11. Tracciare e utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione proteica di ciascun campione.
    NOTA: Assicurarsi che i 200-250 μg stimati di proteine siano estratti da tre vetrini di tessuti FFPE, ciascuno con un'area approssimativa di 1 cm².

4. Precipitazione dell'acetone delle proteine

NOTA: Assicurarsi che un totale di 100-300 μg di proteine venga utilizzato per la precipitazione dell'acetone e la digestione delle proteine basata sulla cattura in sospensione.

1. Posizionare il campione di proteine (corrispondente a 100-300 μg) in una provetta compatibile con acetone.
2. Aggiungere alla provetta acetone a -20 °C in un volume cinque volte superiore al volume del campione.
3. Incubare la miscela a -20 °C per 18 ore.
4. Centrifugare la provetta a 16.000 x g per 15 min.
5. Smaltire con cura il surnatante senza disturbare il pellet proteico.
6. Aggiungere 500 μl di acetone a -20 °C e ripetere i passaggi 4.4-4.5.
7. Asciugare il campione all'aria.

5. Digestione delle proteine basata sul intrappolamento in sospensione

NOTA: La procedura di digestione delle proteine basata su filtro per l'intrappolamento delle sospensioni è stata adattata dalle istruzioni del produttore con piccole modifiche.

1. Preparare il tampone di lisi per l'intrappolamento delle sospensioni (5 % SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8,5 TEAB in acqua deionizzata).
2. Aggiungere 40 μl di tampone alla provetta del campione e agitare accuratamente per sciogliere il pellet proteico essiccato all'aria.
3. Incubare il campione a 100 °C agitando a 1.000 x g per 35 minuti.
4. Aggiungere al campione 10 μl di reagente alchilante (100 mM di cloroacetammide [CAA] in 100 mM di pH 8,5 di tetraetilammonio bromuro [TEAB]).
5. Incubare a RT con agitazione a 300 x g per 1 ora.
6. Preparare un acidificante (10% di acido trifluoroacetico [TFA] in acqua deionizzata) con cautela. Assicurarsi che il TFA, un acido forte, venga maneggiato in una cappa chimica.
7. Aggiungere 5 μl di acidificante al campione per ottenere una concentrazione finale dell'1% di TFA (volume finale del campione: 55 μl).
8. Controllare il pH del campione utilizzando carta per pH. Assicurarsi che il pH sia inferiore a 1.
9. Aggiungere 350 μL di tampone legante/lavaggio-1 (0,1 M pH 8,5 TEAB in 90% MeOH) al campione per intrappolare le proteine.
   NOTA: Evitare il vortice e la centrifugazione durante l'intrappolamento delle proteine (passaggio 5.9) per evitare la perdita di campione. Quantità sufficienti di proteine assicurano la formazione di particelle proteiche colloidali visibili con un aspetto traslucido.
10. Posizionare la colonna di intrappolamento della sospensione in una provetta da 2 mL e trasferire l'intero campione, compreso l'eventuale materiale insolubile, nella colonna di intrappolamento della sospensione.
11. Centrifugare la colonna a 4.000 x g per 50 s per intrappolare le proteine.
    NOTA: Assicurarsi che tutto il campione passi attraverso la colonna; In caso contrario, ripetere la centrifugazione fino a completa filtrazione.
12. Aggiungere 400 μl del tampone di lavaggio-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) alla colonna, centrifugare a 4000 x g per 50 s ed eliminare il flusso.
13. Ripetere il passaggio 5.12 tre volte.
14. Aggiungere 400 μl di tampone-1, centrifugare a 4000 x g per 50 s ed eliminare il flusso.
15. Ripetere il passaggio 5.14 tre volte.
16. Centrifugare a 4000 x g per 1,25 min per garantire l'intero passaggio del tampone-1.
17. Trasferire la colonna di intrappolamento della sospensione in una nuova provetta per la digestione enzimatica.
18. Aggiungere 125 μL di tampone di digestione (0,16 μg/μL di tripsina/Lys-C in 50 mM pH 8,5 TEAB) alla colonna di intrappolamento della sospensione e tapparla per evitare l'evaporazione.
    NOTA: Il rapporto tripsina/Lys-C deve essere 1:10 (peso/peso). Garantire un minimo di 10 μg di tripsina/Lys-C per una digestione efficace.
19. Incubare a 37 °C per 18 ore senza agitare.
20. Preparare i seguenti tamponi di eluizione: tampone-1 (50 mM pH 8,5 TEAB in acqua deionizzata), tampone-2 (0,2 % FA in acqua deionizzata) e tampone-3 (50 % acetonitrile [ACN] in acqua deionizzata).
21. Aggiungere 80 μl di tampone di eluizione-1 alla colonna di intrappolamento della sospensione e centrifugare a 4000 x g per 1,25 min.
22. Ripetere il passaggio 5.20 con 80 μl di tampone di eluizione-2 e tampone-3.
23. Raggruppare i peptidi eluiti e trasferirli in una nuova provetta pulita.

6. Quantificazione dei peptidi

NOTA: La maggior parte delle fasi del saggio quantitativo colorimetrico dei peptidi è adattata dalle istruzioni del produttore con piccole modifiche. Si raccomanda di preparare i reagenti secondo le linee guida del produttore.

1. Preparare una serie di standard diluendo in serie la soluzione madre dello standard (1 mg/mL). Se necessario, diluire i campioni utilizzando un fattore di diluizione di 4 o 5.
2. Preparare l'acqua deionizzata come bianco e una miscela di tampone di eluizione-1, tampone-2 e tampone-3 in proporzioni uguali come controllo del campione.
3. Posizionare 20 μL di standard, bianco, controllo del campione e campioni al centro di ciascun pozzetto della micropiastra.
4. Aggiungere 180 μl del reagente di lavoro a ciascun pozzetto e mescolare accuratamente la piastra su uno shaker per piastre per 1 minuto.
5. Coprire la piastra e incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti.
6. Lasciare raffreddare la piastra a RT per 3 minuti.
7. Misurare l'assorbanza dei pozzetti a 480 nm utilizzando un lettore di piastre.
8. Sottrarre il valore di assorbanza di 480 nm del bianco da quello di tutti i campioni e del controllo del campione.
9. Inoltre, sottrarre il valore di assorbanza di 480 nm del controllo del campione sottratto in bianco da quello di tutti i campioni.
10. Tracciare e utilizzare la curva standard per calcolare la concentrazione di peptidi per ciascun campione.

7. Analisi di cromatografia liquida-spettrometria di massa

1. Dopo la quantificazione dei peptidi, liofilizzare 20 μg di peptidi.
2. Risciogliere i peptidi in 40 μl di tampone acquoso (3 % ACN in 0,1 % di acqua di acido formico [FA]) per 10 minuti in un bagno di sonicazione. La concentrazione di peptidi risultante sarà di 0,5 μg/μL.
3. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 60 minuti e trasferire i campioni in fiale per l'analisi MS.
4. Iniettare 2 μL di ciascun campione utilizzando l'autocampionatore del sistema nano LC-MS/MS.
5. Separare i peptidi su una colonna a fase inversa (0,075 mm ID x 150 mm di colonna, impaccata con materiale C18 da 3 μm, utilizzando un gradiente di 127 minuti di acetonitrile al 5%-35% a 100 nL/min. Ionizzare i peptidi tramite una sorgente ionica nanospray e trasferirli in uno spettrometro di massa basato su orbitrap.
6. Analizzare i peptidi utilizzando un metodo di acquisizione indipendente dai dati a intervalli ristretti²¹.
7. Applicare la seguente impostazione dei parametri MS: intervallo MS m/z: 495-745, obiettivo di risoluzione: 15000, obiettivo AGC: 3 x 10E6, tempo massimo di iniezione: auto, finestra MS/MS: definito dall'utente (file supplementare 1), obiettivo di risoluzione: 45000, obiettivo AGC 3 x 10E6, tempo massimo di iniezione: auto, energia di collisione HCD: 22%, 26%, 30%.
   NOTA: Si consiglia di eseguire un controllo di qualità iniziale dello strumento analizzando campioni standard prima dell'analisi. Utilizzare il software di acquisizione dati MS per configurare i parametri (fare riferimento alla Tabella dei materiali).

8. Analisi dei dati per la ricerca proteomica

NOTA: Per la ricerca proteomica dei dati grezzi MS, sono stati utilizzati strumenti open source per convertire il formato dei dati LC-MS ed eseguire la ricerca del proteoma (fare riferimento alla Tabella dei materiali). I parametri utilizzati per l'analisi dei dati sono descritti in dettaglio nel File Supplementare 2. Per le istruzioni di base sull'uso degli strumenti open source, fare riferimento al collegamento incluso nella Tabella dei materiali.

1. Converti i file grezzi dello spettro MS/MS (*.raw) ottenuti dal LC-MS nel formato *.mzML utilizzando un software open source.
2. Utilizzare i file raw convertiti in formato (*.mzML) come input per un motore di ricerca open source per eseguire la ricerca del proteoma.
3. Avviare la ricerca proteomica in base ai parametri specificati nel File Supplementare 2.

9. Analisi statistica

NOTA: Per l'analisi statistica per identificare le proteine differenzialmente espresse, è stato utilizzato uno strumento open-source per eseguire l'analisi univariata (ad esempio, il t-test di Student; fare riferimento alla Tabella dei Materiali). Si consiglia di fare riferimento alle istruzioni di base per l'uso dello strumento open source tramite il link fornito nella Tabella dei materiali.

1. Importa l'elenco delle proteine identificate (*.txt) nello strumento open source.
2. Classificare i campioni in gruppi. Per questo studio sono stati designati due gruppi: SCN e IPMN.
3. Eseguire la trasformazione Log₂ dei valori di abbondanza per regolare la distribuzione dei dati in modo che approssima la distribuzione normale.
4. Applicare un passaggio di filtraggio per rimuovere le proteine con valori mancanti. In questo studio, per l'inclusione era richiesto un minimo di due valori validi in ciascun gruppo.
5. Imputare i valori mancanti utilizzando un approccio basato sulla distribuzione normale per generare un elenco completo di proteine quantificate per la successiva analisi univariata.
6. Eseguire un t-test di Student per identificare le proteine differenzialmente espresse tra i due gruppi. In questo studio, è stata applicata la correzione del tasso di false scoperte (FDR) di Benjamini-Hochberg.
7. Estrarre le proteine differenzialmente espresse che soddisfano i seguenti criteri: Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 e |fold- change| ≥ 2.

10. Analisi bioinformatica

NOTA: Per l'analisi della sovrarappresentazione è stato utilizzato uno strumento bioinformatico commerciale (ad esempio, l'analisi del percorso Ingenuity, fare riferimento alla Tabella dei Materiali). Prima di utilizzare questo strumento, si consiglia di fare riferimento alle istruzioni del produttore.

1. Importare l'elenco delle DEP (*.txt) nello strumento commerciale.
2. Avviare l'analisi di base per condurre un'analisi di sovrarappresentazione.
3. Esporta i percorsi canonici significativi arricchiti dai DEP utilizzando il test esatto di Fisher (valore p rettificato < 0,05). Identificare i percorsi di interesse rilevanti per la ricerca.

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Risultati

La consolidata preparazione del campione di proteomica basata su filtro per l'intrappolamento in sospensione, combinata con la quantificazione senza marcatura utilizzando l'acquisizione indipendente dai dati a colpo singolo, è stata applicata ai tessuti FFPE cistici pancreatici (Figura 1). L'isolamento preciso del ROI durante il processamento del tessuto FFPE è stato ottenuto su diversi tessuti FFPE cistici pancreatici (Figura 2A

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Discussione

Questo protocollo delinea un metodo di proteomica rapido ed efficiente che utilizza ROI isolate da sezioni di tessuto FFPE montate su vetrini per la diagnosi patologica. Quando l'intervento chirurgico è vantaggioso, le neoplasie solide come i tumori e le cisti vengono resecate chirurgicamente e conservate per la valutazione patologica. Per la conservazione a lungo termine, i tessuti sono fissati in formalina e incorporati in paraffina (FFPE). I blocchi di tessuto FFPE vengono quindi sez...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% FA in ACN (LC-MS grade)	Fisher Chemical	LS120-212
0.1% FA in Water (LC-MS grade)	Fisher Chemical	LS118-4
0.5M TCEP	Thermo Scientific	77720
10% SDS	Invitrogen	2679093
1M TEAB (pH 8.5)	Sigma-Aldrich	102545001
1M Tris-cl (pH 8.5)	BIOSOLUTION	BTO21
A-14C centrifuge	Satorious	167709
Acetone (HPLC grade)	Fisher Scientific	A949-4
ACN (HPLC grade)	J.T.Baker	9017-88
CHCl3 (HPLC grade)	Thermo Scientific	022920.k2
CR paper	ADVANTEC	70406001
DIA-NN ver 1.9	Open source	https://github.com/vdemichev/DiaNN	Proteomics Search Engine
EPOCH2 microplate reader	Agilent	2106208
Ethanol	MERCK	K50505283 836
FA (LC-MS grade)	Fisher Chemical	A117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)	QIAGEN	830018	Bioinformatics tool
Lyophilizer (SRF110R+vaper trap)	Thermo Scientific	SRF-110-115
MeOH (HPLC grade)	MERCK	UN1230
Microplate BCA protein Assay kit-Reducing Agent Compatible	Thermo Scientific	23252
MSConvert	Open source	http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml	MS data transformation software
Orbitrap Exploris 480	Thermo Scientific	MA10813C	MS
PepMAP RSLC C18 separation column	Thermo Scientific	ES903
Perseus	Open source	https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html	Statistical tool
PIERCE chloroacetamide No-Weigh Format	Thermo Scientific	A39270
PIERCE Quantitative colorimetric peptide Assay	Thermo Scientific	23275
Plate shaker	Green SSeriker	VS-202D
Probe sonicator	VibraCellTM	VCX750
Protein LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431081
QSP 10 µL pipette Tip	Thermo Scientific	TLR102RS-Q
QSP 300 µL pipette Tip	Thermo Scientific	TLR106RS-Q
Scalpel	Bard-Parker	372615
S-Trap: Rapid Universal MS sample Prep	PROTIFI	CO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mL	Thermo Scientific	6pk1655
TFA	Sigma-Aldrich	102614284
ThermoMixer C	Eppendorf	5382
Trypsin/Lys-C (LC-MS grade)	Promega	V5073
Vanquish NEO	Thermo Scientific	8348249	LC
Water (HPLC grade)	Honeywell	AH365-4
Xcalibur ver 4.7	Thermo Scientific	30966	MS data acquisition software
Xylene	Sigma-Aldrich	102033629