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要約

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。

要約

質量分析(MS)ベースのプロテオミクスは、細胞、組織、体液など、幅広い生体サンプルにわたる包括的なプロテオーム分析を可能にします。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片は、長期保存に一般的に使用され、プロテオミクス研究のための貴重なリソースとして浮上しています。研究者は、その保存上の利点に加えて、病理医との共同作業を通じて、正常組織領域から関心領域(ROI)を分離することができます。このような可能性にもかかわらず、ROIの分離、プロテオミクスサンプル調製、MS分析を含むプロテオミクス実験の合理的なアプローチは依然として不足しています。このプロトコルでは、ROIのマクロダイセクション、懸濁液トラップベースのサンプル調製、およびハイスループットMS分析を組み合わせた統合ワークフローを示します。このアプローチにより、病理医によって診断された良性漿液性嚢胞性腫瘍(SCN)と前がん性乳頭状粘液性腫瘍(IPMN)からなる患者のFFPE組織のROIをマクロ解剖、収集、分析し、高いプロテオームカバレッジを実現しました。さらに、2つの異なる膵臓嚢胞性腫瘍間の分子差が見事に同定され、FFPE組織を用いたプロテオミクス研究の進展にこのアプローチが適用可能であることが実証されました。

概要

何十年もの間、外科的に切除されたヒト組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックとしてアーカイブされてきました。これらの組織ブロックは、最初にパラフィンに埋め込まれた3次元(3D)構造を保持します。その後、組織をミクロトームを用いてスライスし、スライドにマウントし、一般的にはヘマトキシリンとエオシン(HE)または免疫組織化学(IHC)で染色して、経験豊富な病理医による病理組織学的診断を容易にします1,2。FFPE組織は、ホルマリンによって誘導されるタンパク質架橋により、酵素活性とタンパク質分解活性が停止するため、長期保存に明確な利点があります3。FFPE組織は、大規模で十分にアーカイブされたサンプルセットの構築をサポートするため、ゲノミクス4、5、6、7など、さまざまな分野でバイオマーカー発見の基礎と見なされてきました。

しかし、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)ベースのプロテオミクスへの応用は、歴史的に課題をもたらしてきました。主な制限は、ホルマリン誘導性タンパク質架橋であり、これはトリプシン消化を妨害します。これは、グローバルプロテオーム解析における重要なステップです8。さらに、組織スライドから少量のタンパク質を回収できるため、従来のサンプル調製法はしばしば不適切です。これらの課題にもかかわらず、進歩は、タンパク質架橋が長期にわたる高温処理によって逆転できることを実証している9,10,11。同時に、少量のタンパク質サンプルに最適化されたサンプル調製法により、プロテオミクス研究におけるFFPE組織の使用が拡大しています12,13,14,15。

プロテオミクスでFFPE組織スライドを使用する大きな利点の1つは、領域特異的な分析を可能にする能力にあります。FFPEスライドには通常、病変と隣接する正常組織(ANT)の両方が含まれています。組織全体を無差別に分析すると、分子シグネチャーが混在するため、結果を混乱させるリスクがあります。対照的に、関心領域(ROI)の単離と解析(病変とANTの比較)により、病理領域に特異的な分子的特徴をより正確に評価することができます。その結果、FFPEベースのアプローチは、プロテオミクス研究16,17,18,19,20においてますます人気が高まっています。その用途が拡大しているにもかかわらず、プロテオミクス実験全体を段階的に記述する合理化されたワークフローはまだ不足しています。特に、ビデオベースのプロトコルは公開されていません。

この研究では、病変特異的領域内の分子変化の正確なプロファイリングに合わせて調整された、頑健な LC-MS ベースのプロテオミクスワークフローが確立されました。2人の病理医によって診断されたFFPE組織を使用して、良性漿液性嚢胞性腫瘍(SCN)および前癌性乳管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)からのROIをマクロに解剖、収集、および分析しました。このプロトコールには、ROIのマクロダイセクション、最小限のタンパク質インプットに最適化された懸濁液トラップベースのサンプル調製、およびナローレンジデータに依存しない取得(DIA)-MS分析が組み込まれています。この方法により、約1cm²の組織領域から9,000を超えるタンパク質を同定し、SCNおよびIPMNに関連する明確なプロテオミクスシグネチャを解読することができました。

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プロトコル

この研究は、ソウル大学病院の治験審査委員会によって審査され、承認されました(IRB No. 1904-114-1028)。すべての参加者は、研究に参加するための書面によるインフォームド コンセントを提供しました。この議定書で使用されるすべての材料に関する詳細情報は、 材料の表に記載されています。

1. プロテオミクスサンプル調製のためのFFPE組織抗原賦活化

注意: メスと使用するチューブなどのすべての材料が無菌であり、相互汚染を避けてください。この研究のプロトコルは、実験室のセットアップに基づいてわずかな変更を加えるだけで、任意のFFPE組織に適合させることができます。

  1. ホールマウントFFPE組織ブロックから10μmのFFPE組織切片を切り取り、スライドガラス上に置きます。
    注:この研究では、ヒト膵臓嚢胞FFPE組織(嚢胞組織の2つの異なるタイプ-SCNとIPMN)がプロテオミクスサンプル調製に使用されました。
  2. FFPE組織のパラフィンワックスをキシレンで2回洗浄し、注意して除去します:1回は5分間、もう1回は2分間。
  3. 等級付けされたエタノール混合物による連続洗浄を通じて組織を再水和します:100%、85%、70%、および50%のエタノールでそれぞれ3分間、続いて脱イオン水ですすいでください。
    注:キシレンとエタノールが化学薬品のヒュームフードで取り扱われていることを確認してください。

2. FFPE組織タンパク質抽出

  1. 病理医がROIを示すHEまたはIHC染色の組織スライドを調製します。
  2. 未染色のティッシュスライドと染色したティッシュスライドの裏面を向き合わせて置き、整列させます。ROIがスライドガラスを通して観察されるようにします。
  3. メスを使用して興味のない組織領域を取り除きます。
    注:隣接する正常組織を分析する必要がある場合は、他のチューブに収集します。
  4. メスを使用して組織のROIをスライドの中心まで掻き取り、きれいな1.5 mLの低タンパク質結合チューブに移します。
  5. 180 μL のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 溶解バッファー (5 % SDS、2 mM トリス (2-カルボキシエチル) ホスフィン) [TCEP]、300 mM pH 8.5 Tris-HCl in deionized water) を各チューブに加えます。
    注:溶解バッファーの量が、超音波処理中に組織を可溶化し、抽出されたタンパク質を懸濁するのに十分であることを確認してください。バッファーが不十分な場合、組織の溶解が不完全になる可能性があり、バッファーが過剰になるとタンパク質溶解物が希釈される可能性があります。
  6. 20%の振幅でプローブの超音波処理を行い、5秒のオンと5秒のオフの10サイクルを適用します。
  7. サンプルを100°Cで3.5時間、1,000 x gでインキュベートします。
    注:効率的なタンパク質抽出のために、インキュベーション中に1時間ごとにサンプルの水超音波処理を行います。
  8. インキュベーション後、サンプルを室温(RT)で10分間冷却します。サンプルを16,000 x g でRTで10分間遠心分離し、上清から組織破片を分離します。
  9. 上清を清潔なラベル付きチューブに集め、さらに使用するまで-80°Cで保存します。

3. FFPE組織ライセートのタンパク質定量

注:タンパク質定量のためのほとんどのビシンコニン酸アッセイステップは、わずかな変更を加えた製造元の指示に基づいています。試薬はメーカーのガイドラインに従って調製することをお勧めします。

  1. ストック溶液(2 mg/mL の BSA)を段階希釈することにより、さまざまな濃度のウシ血清アルブミン(BSA)標準試料を調製します。必要に応じて、希釈係数20または40でサンプルを希釈します。
  2. ブランクとして脱イオン水を準備し、サンプルコントロールとしてSDS溶解バッファーを準備します。
  3. 標準液9μL、ブランク、サンプルコントロール、サンプルをマイクロプレートウェルの中心にピペットで移します。
  4. 各ウェルのサンプルに4 μLの適合性試薬溶液を加えます。
  5. プレートに蓋をし、プレートシェーカーで中速で1分間混合します。その後、プレートを37°Cで15分間インキュベートします。
  6. 260 μLのBCA作動試薬を各ウェルに加え、プレートを37°Cで30分間インキュベートします。
  7. プレートをRTで3分間冷却します。
  8. プレートリーダーで562nmでのウェルの吸光度を測定します。
  9. ブランクの562nmの吸光度値を、すべてのサンプルとサンプルコントロールの吸光度から減算します。
  10. さらに、ブランク減算サンプルコントロールの562nm吸光度値を、すべてのサンプルの吸光度値から減算します。
  11. 標準曲線をプロットして使用し、各サンプルのタンパク質濃度を決定します。
    注:推定200〜250μgのタンパク質が、それぞれが約1cm2の面積を持つFFPE組織の3つのスライドガラスから抽出されていることを確認してください。

4. タンパク質のアセトン沈殿

注:アセトン沈殿および懸濁液トラップベースのタンパク質消化には、合計100〜300μgのタンパク質が使用されていることを確認してください。

  1. タンパク質サンプル(100〜300μgに相当)をアセトン適合チューブに入れます。
  2. サンプル容量の5倍の容量で-20°Cのアセトンをチューブに加えます。
  3. 混合物を-20°Cで18時間インキュベートします。
  4. チューブを16,000 x g で15分間遠心分離します。
  5. 上清は、タンパク質ペレットを乱さずに慎重に廃棄してください。
  6. -20°Cのアセトン500μLを加え、手順4.4〜4.5を繰り返します。
  7. サンプルを風乾します。

5. 懸濁液捕捉によるタンパク質消化

注:懸濁液トラップフィルターベースのタンパク質消化手順は、製造元の指示書から若干の変更を加えて適応されました。

  1. 懸濁液トラッピング溶解バッファー(脱イオン水中の5 % SDS、5 mM TCEP、50 mM pH 8.5 TEAB)を調製します。
  2. サンプルチューブに40μLのバッファーを加え、十分にボルテックスして風乾したタンパク質ペレットを溶解します。
  3. サンプルを100°Cでインキュベートし、1,000 x g で35分間振とうします。
  4. 10 μLのアルキル化試薬(100 mM pH 8.5 Tetraethylammonium bromide [TEAB]に100 mMクロロアセトアミド[CAA])をサンプルに加えます。
  5. RTで300 x g で1時間振とうしながらインキュベートします。
  6. 酸性化剤(脱イオン水中の10%トリフルオロ酢酸[TFA])を慎重に調製します。.強酸であるTFAが化学薬品ドラフトで取り扱われていることを確認してください。
  7. サンプルに5 μLの酸性化剤を添加して、最終濃度1% TFAを達成します(最終サンプル容量:55 μL)。
  8. pHペーパーを使用してサンプルのpHを確認します。pHが1未満であることを確認してください。
  9. 350 μLのBinding/Wash Buffer-1 (0.1 M pH 8.5 TEAB in 90% MeOH) をサンプルに添加して、タンパク質をトラップします。
    注:サンプルの損失を防ぐために、タンパク質のトラップ(ステップ5.9)中のボルテックスと遠心分離は避けてください。十分な量のタンパク質は、半透明の外観を持つ目に見えるコロイド状タンパク質粒子の形成を確実にします。
  10. 懸濁液トラップカラムを2 mLチューブに入れ、不溶性物質を含むサンプル全体を懸濁液トラップカラムに移します。
  11. カラムを4,000 x g で50秒間遠心分離し、タンパク質をトラップします。
    注:すべてのサンプルがカラムを通過することを確認してください。そうでない場合は、完全にろ過されるまで遠心分離を繰り返します。
  12. 400 μL の洗浄バッファー-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) をカラムに加え、4000 x g で 50 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
  13. 手順5.12を3回繰り返します。
  14. 400 μL のバッファー 1 を加え、4000 x g で 50 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
  15. 手順5.14を3回繰り返します。
  16. 4000 x g で1.25分間遠心分離し、buffer-1の全通過を確認します。
  17. 懸濁液トラッピングカラムを新しいサンプルチューブに移し、酵素分解を行います。
  18. 125 μLの消化バッファー(0.16 μg/μLのトリプシン/Lys-C、50 mM pH 8.5 TEAB)を懸濁液トラップカラムに加え、蒸発を防ぐためにキャップします。
    注:トリプシン/Lys-C比は1:10(重量/重量)である必要があります。効果的な消化のためには、最低10 μgのトリプシン/Lys-Cを確保してください。
  19. 振とうせずに37°Cで18時間インキュベートします。
  20. 以下の溶出バッファーを調製します:バッファー-1(脱イオン水中の50 mM pH 8.5 TEAB)、バッファー-2(脱イオン水中の0.2 % FA)、およびバッファー-3(脱イオン水中の50 % アセトニトリル[ACN])。
  21. 80 μL の溶出バッファー-1 を懸濁液トラッピングカラムに加え、4000 x g で 1.25 分間遠心分離します。
  22. 80 μLの溶出バッファー-2およびバッファー-3でステップ5.20を繰り返します。
  23. 溶出したペプチドをプールし、清潔な新しいチューブに移します。

6. ペプチド定量

注:定量的比色ペプチドアッセイのほとんどのステップは、製造元の指示からわずかな変更を加えて適応されています。試薬はメーカーのガイドラインに従って調製することをお勧めします。

  1. スタンダードの原液を連続希釈(1 mg/mL)して、一連のスタンダードを調製します。必要に応じて、希釈係数4または5を使用してサンプルを希釈します。
  2. 脱イオン水をブランクとして調製し、溶出バッファー-1、バッファー-2、およびバッファー-3の混合物をサンプルコントロールとして同じ割合で調製します。
  3. 20 μLのスタンダード、ブランク、サンプルコントロール、およびサンプルを各マイクロプレートウェルの中央に置きます。
  4. 各ウェルに180 μLの作業試薬を加え、プレートシェーカーでプレートを1分間十分に混合します。
  5. プレートを覆い、プレートを37°Cで20分間インキュベートします。
  6. プレートを室温で3分間冷まします。
  7. プレートリーダーを使用して、480 nmでのウェルの吸光度を測定します。
  8. ブランクの480nmの吸光度値を、すべてのサンプルとサンプルコントロールの値から減算します。
  9. さらに、ブランク減算サンプルコントロールの480nm吸光度値を、すべてのサンプルの吸光度値から減算します。
  10. 標準曲線をプロットして使用し、各サンプルのペプチド濃度を計算します。

7. 液体クロマトグラフィー-質量分析

  1. ペプチド定量後、20 μgのペプチドを凍結乾燥します。
  2. ペプチドを40 μLの水性緩衝液 (0.1 % ギ酸 [FA] 水に 3 % ACN) を入れ、超音波処理槽で 10 分間再溶解します。得られるペプチド濃度は0.5μg/μLとなります。
  3. サンプルを16,000 x g で60分間遠心分離し、サンプルをバイアルに移してMS分析を行います。
  4. nano LC-MS/MS システムのオートサンプラーを使用して、各サンプルの 2 μL を注入します。
  5. 逆相カラム(内径0.075 mm x 150 mmカラム、3 μm C18材料充填、5%-35%アセトニトリル、100 nL/minの127分間グラジエントを使用)でペプチドを分離します。ナノスプレーイオン源を介してペプチドをイオン化し、Orbitrapベースの質量分析計に移します。
  6. 狭範囲データ非依存取得法21を用いてペプチドを分析する。
  7. MS m/z 範囲: 495-745、分解能ターゲット: 15000、AGC ターゲット: 3 x 10E6、最大注入時間: 自動、MS/MS ウィンドウ: ユーザー定義 (補足ファイル 1)、分解能ターゲット: 45000、AGC ターゲット 3 x 10E6、最大注入時間: 自動、HCD 衝突エネルギー: 22%、26%、30%
    注:分析前に標準サンプルを分析して、装置の初期品質チェックを実行することをお勧めします。MSデータ集録ソフトウェアを使用してパラメータを設定します( 材料表を参照)。

8. プロテオミクス探索のためのデータ解析

注:MS 生データのプロテオミクス検索には、オープンソースツールを使用して LC-MS データフォーマットを変換し、プロテオーム検索を実行しました( 材料表を参照)。データ分析に使用するパラメータについては、 補足ファイル2に詳しく記載されています。オープンソースツールの基本的な使用方法については、 資料の表に含まれているリンクを参照してください。

  1. オープンソースソフトウェアを使用して、LC-MSから取得した生のMS/MSスペクトルファイル(*.raw)を*.mzML形式に変換します。
  2. フォーマット変換された生ファイル(*.mzML)をオープンソースの検索エンジンの入力として使用して、プロテオーム検索を実行します。
  3. 補足ファイル2で指定されたパラメータに基づいてプロテオミクス検索を開始します。

9. 統計分析

注:差次的に発現するタンパク質を同定するための統計解析のために、オープンソースのツールを使用して単変量解析を行いました(例:スチューデントのt検定; 資料表を参照)。オープンソースツールの基本的な使用方法については、 資料の表に記載されているリンクを参照することをお勧めします。

  1. 同定されたタンパク質(*.txt)のリストをオープンソースツールにインポートします。
  2. サンプルをグループに分類します。この研究では、SCNとIPMNの2つのグループが指定されました。
  3. 存在量の値のLog2 変換を実行して、データ分布を近似正規分布に調整します。
  4. フィルタリングステップを適用して、欠損値のあるタンパク質を除去します。この研究では、含めるために、各グループに少なくとも 2 つの有効な値が必要でした。
  5. 正規分布ベースのアプローチを使用して欠損値を代入し、その後の単変量解析のために定量化されたタンパク質の包括的なリストを生成します。
  6. スチューデントのt検定を実行して、2つのグループ間で発現差のあるタンパク質を特定します。本研究では、Benjamini-Hochbergの誤発見率(FDR)補正を適用した。
  7. 次の基準を満たす差次的に発現するタンパク質を抽出します:Benjamini-Hochberg FDR < 0.05および|fold-change|≥ 2.

10. バイオインフォマティクス解析

注:過剰表現解析には、市販のバイオインフォマティクスツールを使用しました(例:Ingenuity経路解析、 資料表を参照)。このツールを使用する前に、製造元の指示を参照することをお勧めします。

  1. DEP (*.txt) のリストを商用ツールにインポートします。
  2. コア解析を開始して、過剰表現解析を実施します。
  3. フィッシャーの正確確率検定を使用して、DEPから濃縮された有意な正規経路をエクスポートします(調整されたp値<0.05)。研究に関連する関心のある経路を特定します。

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結果

確立された懸濁液トラップフィルターベースのプロテオミクスサンプル調製と、シングルショットデータに依存しない取得によるラベルフリー定量を組み合わせて、膵臓嚢胞性FFPE組織に適用しました(図1)。FFPE 組織プロセッシング中の正確な ROI 単離は、異なる膵臓嚢胞性 FFPE 組織間で達成され(図 2A)、その結果、膵臓嚢?...

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ディスカッション

このプロトコルは、スライドガラスに取り付けられたFFPE組織切片から分離されたROIを病理学的診断に利用する、迅速かつ効率的なプロテオミクス法の概要を示しています。外科的介入が有利な場合、がんや嚢胞などの固形新生物を外科的に切除し、病理学的評価のために保存します。長期保存のために、組織をホルマリンに固定し、パラフィン(FFPE)に包埋します。?...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反はありません

謝辞

この記事のすべての図は、BioRender(http://www.biorender.com)を使用して作成されました。この研究は、韓国国立研究財団(NRF)の助成金(Grant No.RS-2023-00253403 および RS-2024-00454407)。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% FA in ACN (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS120-212
0.1% FA in Water (LC-MS grade)Fisher ChemicalLS118-4
0.5M TCEPThermo Scientific77720
10% SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8.5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8.5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14C centrifugeSatorious167709
Acetone (HPLC grade)Fisher ScientificA949-4
ACN (HPLC grade)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (HPLC grade)Thermo Scientific022920.k2
CR paperADVANTEC70406001
DIA-NN ver 1.9 Open source https://github.com/vdemichev/DiaNNProteomics Search Engine 
EPOCH2 microplate readerAgilent 2106208
EthanolMERCKK50505283 836
FA (LC-MS grade)Fisher ChemicalA117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)QIAGEN830018Bioinformatics tool
Lyophilizer (SRF110R+vaper trap)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (HPLC grade)MERCKUN1230
Microplate BCA protein Assay kit-Reducing Agent CompatibleThermo Scientific23252
MSConvert Open source http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlMS data transformation software
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 separation column Thermo ScientificES903
PerseusOpen sourcehttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlStatistical tool
PIERCE chloroacetamide No-Weigh FormatThermo ScientificA39270
PIERCE Quantitative colorimetric peptide AssayThermo Scientific23275
Plate shaker Green SSerikerVS-202D
Probe sonicatorVibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431081
QSP 10 µL pipette TipThermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µL pipette TipThermo ScientificTLR106RS-Q
ScalpelBard-Parker372615
S-Trap: Rapid Universal MS sample PrepPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsin/Lys-C (LC-MS grade)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (HPLC grade)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS data acquisition software
XyleneSigma-Aldrich102033629

参考文献

  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

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