Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia

La cromatografia a scambio ionico è un tipo di cromatografia che separa gli analiti in base alla carica. Viene utilizzata una colonna che viene riempita con una fase stazionaria carica su un supporto solido, chiamata resina a scambio ionico. La cromatografia a forte scambio cationico separa preferenzialmente i cationi utilizzando una resina caricata negativamente, mentre la cromatografia a scambio anionico forte seleziona preferenzialmente gli anioni utilizzando una resina caricata positivamente. Questo tipo di cromatografia è popolare per la preparazione del campione, ad esempio nella pulizia di proteine o campioni di acido nucleico.

La cromatografia a scambio ionico è un processo in due fasi. Nel primo passaggio, l'esempio viene caricato nella colonna in un buffer di caricamento. Il legame del campione caricato alla resina della colonna si basa sulle interazioni ioniche della resina per attirare il campione della carica opposta. Pertanto, i campioni carichi di polarità opposta alla resina sono fortemente legati. Altre molecole che non sono cariche o sono di carica opposta non sono legate e vengono lavate attraverso la colonna. Il secondo passo è quello di eluire l'analita che è legato alla resina. Questo si ottiene con un gradiente salino, in cui la quantità di sale nel buffer viene lentamente aumentata. Le frazioni vengono raccolte alla fine della colonna quando si verifica l'eluizione e il campione purificato di interesse può essere recuperato in una di queste frazioni. Un'altra tecnica, come la spettroscopia, potrebbe essere necessaria per identificare quale frazione contiene il campione. La cromatografia a scambio ionico è particolarmente utile negli studi sulle proteine, per isolare proteine di interesse che hanno una carica o una dimensione specifica, in quanto le dimensioni possono determinare il numero di interazioni con la resina.

La cromatografia a scambio ionico è una tecnica di separazione più generale rispetto alla cromatografia di affinità, che viene spesso utilizzata anche nella preparazione di campioni proteici, in cui un anticorpo è attaccato a una colonna per legare un analita specifico. Per ogni analita deve essere acquistata una nuova colonna di affinità, mentre lo stesso tipo di colonna a scambio ionico, spesso con condizioni di eluizione diverse, può essere utilizzato per ripulire molte proteine della stessa carica. La cromatografia a scambio ionico può anche essere utilizzata in combinazione con altri tipi di cromatografia che si separano in base ad altre proprietà. Ad esempio, la cromatografia ad esclusione dimensionale si separa in base alle dimensioni e potrebbe essere utilizzata prima della cromatografia a scambio ionico per scegliere composti di una determinata dimensione.

1. Preparazione del campione e della colonna

1. In questa dimostrazione, una miscela di 2 proteine sarà separata su una colonna a scambio cationico: emoglobina e citocromo C. Aggiungere 0,2 mL di tampone di equilibrio (pH 8,1) al campione proteico e vortice per mescolare accuratamente. Centrifugare per 2 minuti per rimuovere qualsiasi schiuma.
2. Posizionare la colonna di scambio cationico in una provetta per 5 minuti per consentire alla resina di depositarsi. Bloccare la provetta con la colonna su un suppo

La cromatografia a scambio ionico è ampiamente utilizzata in biochimica per isolare e purificare campioni di proteine. Le proteine hanno molti amminoacidi con gruppi funzionali che sono carichi. Le proteine vengono separate in base alla carica netta, che dipende dal pH. Alcune proteine sono caricate più positivamente mentre altre sono più caricate negativamente. Inoltre, i tag peptidici possono essere aggiunti geneticamente a una proteina per darle un punto isoelettrico che non è nella gamma delle proteine normali, r...