המחברים מבקשים להודות בני הזוג. ריק ריאן, ואומש פאטל, ג&#39;ף עד, מתיו הסו, ג&#39;האנגיר מיסטרי ומישל Hatler על התמיכה במהלך הפיתוח של הפרויקטים הללו ופרוטוקולים.

תא הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני זריעת התא, assay תרבות נוירונים / האסטרוציטים בתקשורת צמיחה עד ~ ומחוברות 70-80% (אלא אם כן תא זריעת ישירות ההפשרה או בידוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים צלוחיות תרבות / צלחות דרך בשיטה המתאימה לסוג התא של עניין. אם יש צורך, assay מעיל בארות צלחת עם חלבון פולי-D-ליזין או תאיים מטריקס לשפר את הידבקות התא. Co-התרבויות של האסטרוציטים ונוירונים ניתן seeded בו זמנית או ברצף. עבור seedings רציפים, ציפוי של האסטרוציטים הראשונה שכבה &quot;הבסיס&quot; מומלץ, ואחריו ציפוי בידול העצבית, ובמידת הצורך. התאם את צפיפות התאים בהתאם לסוג התא, תרבות זמן לאחר מכן, פרמטרים של עניין, וכו &#39;בהתאם לגיל, תרבות, מקור התא צפיפות זריעה, תרבויות העיקרי עשויים להשתנות במידה ניכרת בשיעור של שגשוג, הביטוי GFAP או תולדה neurite - חשוב לאפיין לייעל את המערכת הסלולרי שלך כדי לספק את הרלוונטיות ביותר עבור מודל הביולוגי הניסיוני שלך, כמו גם לספק הדמיה פילוח יעיל, ניתוח באמצעות HCS (ראה איור 1). לאחר הוספת תאים לצלחת (תאים עשויים להיות seeded ב 90 μL התקשורת, כדי להקל על הטיפול רעלן כמתואר שלב 3 להלן), מאפשרים צלחת לשבת על משטח ישר בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות, מה שמאפשר הפצה תא אפילו. לאחר תקופה זו, תאים דגירה בתקשורת צמיחה (37 ° C / 5% CO 2) לפחות 24 שעות, ולאחר מכן לעבור בתנאים תרבות בידול (לדוגמה, בסרום נמוך / NGF עבור PC12 תאים), בהתאם. המשך התרבות תאים להגיע עד הרמה הרצויה של מפגש או בידול, שינוי התקשורת במרווחים המתאימה לסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים נייד (תרכובות שליטה, תרכובות מבחן, וכו &#39;) יכול להיות מוצג בכל נקודה במהלך תקופה זו תרבות, בהתאם כמובן בזמן הטיפול של עניין. Acrylamide, מי חמצן ו - K-252a מסופקים תרכובות לשלוט neurotoxic. ריאגנטים מספיק ניתנים לשכפל 12 נקודות בתגובה עקומות מנה (כולל DH 2 O או DMSO שליטה מוגדר בתוך בתגובה את המינון) עבור כל חמש צלחות 96-היטב. תרכובות ניתנים בריכוז 250X (עבור K-252a, בהנחה טיפול מרבי של 1 מיקרומטר) או 10X (עבור acrylamide ואת מי חמצן, בהנחה טיפולים המרבי של 100 mM ו - 10 מ&quot;מ, בהתאמה). הכנה הטיפול המומלץ כולל חצי log (1: √ 10) דילול סדרתי של המתחם 250X ב DMSO, ואחריה דילול של הצפת דילול מתחם ל 10X (תרכובות לשלוט 10X שמקורם DH 2 O יכול להיות מדולל סדרתי ישירות סטרילי DH 2 O או דילול מאגר מתחם). 10 μL של כל טיפול עשוי מכן יתווספו 90 μL של התקשורת בתרבות הנוכחית כבר כל טוב, כי ריכוז 1X האחרון (0.4% או 10% DMSO DH 2 O). נתונים לדוגמה מסופק 24 או 96 שעות של טיפול במתחם ב 37 ° C לפני קיבעון. </li></ol> קיבוע נייד ו מכתים Immunofluorescent: הערה: הזמן הוא מכתים ~ 2.5 שעות שלאחר קיבעון. אל תאפשר בארות להתייבש בין הצעדים מכתים. שאיפה של חומרים כימיים ואת היתר צריכה להתנהל ברמות ספיקה נמוכה כדי לצמצם אובדן התא עקב גזירה נוזל. כל המומלצים &quot;לכל טוב&quot; כרכים מתייחסים אחד טוב של microplate 96-היטב. כל המומלצים &quot;לכל 96-היטב צלחת &#39;כרכים כוללים עודף של 25% על אובדן טיפול הנוזל נפח. כל הצעדים מכתים מבוצעות בטמפרטורת החדר (RT). כל מאגרי פתרונות נוגדנים הם יציבים במשך לפחות 24 שעות RT. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת תרבות, טרום חם פתרון HCS קיבוע (2X) לטמפרטורת החדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס אם רוצים (12 צלחת mL/96-well). במנדף כימי קטר, להוסיף 100 μL / גם ישירות למדיה תרבות ולאפשר לתקן למשך 30 דקות ב RT. הסר מקבע / רעלן המכיל מדיה להיפטר בקנה אחד עם תקנות פסולת מסוכנת (ראה MSDS). אם הליך מיד מכתים, לשטוף היטב פעמיים עם כל μL 200 של הצפת immunofluorescence HCS. לחילופין, אם יש צלחות מוכתמות במועד מאוחר יותר, לשטוף פעמיים עם μL 200 של הצפת לשטוף, אז לעזוב הכרך השני לשטוף בבארות וצלחות החנות סגורה היטב ב-C º 4 עד מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות קבוע אוחסנו ב-C º 4 לפני מכתים, לשטוף פעמיים עם הצפת 200 HCS μL immunofluorescence לפני שתמשיך פרוטוקול מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עובד הפתרון של הארנב נגד βIII טובולין / עכבר נגד GFAP נוגדנים HCS ראשיים (6 צלחת mL/96-well) כדלקמן: הוסף 60 μL של כל נוגדן ראשוני מופשר ל 5.88 מ&quot;ל של הצפת immunofluorescence HCS. מערבבים היטב. הסר חוצץ immunofluorescence הקודם לשטוף. הוסף 50 μL של פתרון נוגדן ראשוני זה היטב דגירה במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדן ראשוניהפתרון. לשטוף שלוש פעמים עם 200 הצפת μL immunofluorescence HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של נוגדן HCS משני / Hoechst HCS גרעיני כתמים (6 צלחת mL/96-well) כדלקמן: הוסף 30 μL של נוגדן זה משני מופשר 30 μL של מופשר Hoechst HCS גרעיני כתמים על 5.91 מ&quot;ל של הצפת immunofluorescence HCS. מערבבים היטב, פתרון הגנה מן האור. הסר חוצץ הקודם HCS immunofluorescence לשטוף. הוסף 50 μL של נוגדן HCS משני / Hoechst פתרון HCS כתמים גרעיני דגירה במשך שעה 1 ב RT, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר HCS פתרון יסודי נוגדן / Hoechst HCS כתמים גרעיני. שטפו פעמיים עם 200 הצפת μL immunofluorescence HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ הקודם HCS immunofluorescence לשטוף. שטפו פעמיים עם μL 200 של הצפת לשטוף HCS, עוזב הכרך השני לשטוף בבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת חותם התמונה מיד, או לאחסן צלחת ב-C º 4 מוגנת מפני אור עד מוכן הדמיה. </li></ol> תמונה רכישה ניתוח: <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה וניתוח של צלחות מוכתמות ניתן לבצע על מגוון רחב של פלטפורמות HCS זמין, כולל IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher מדעי) או אופרה (פרקין אלמר). הנחיות מסוימות הדמיה וניתוח ניתנים טבלה 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 רכישת תמונה הנחיות </td></tr><tr><td> איתור מגיב </td><td> המטרה עדשה </td><td> טווח עירור סנן [שיא / רוחב פס (ננומטר)] </td><td> טווח פליטה סנן [שיא / רוחב פס (ננומטר)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS גרעיני כתמים </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (535/50 או אם יש צורך) </td></tr><tr><td> HCS נוגדן משניים, FITC-חמור נגד ארנב IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS נוגדן משניים, Cy3-Donkey אנטי עכבר IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 ניתוח תמונה הנחיות </td></tr><tr><td> תא פרמטר </td><td> איתור </td><td> פילוח / מדידה </td><td> רציונל </td></tr><tr><td> מספר סלולרי, מאפייני גרעיני </td><td> Hoechst HCS גרעיני כתמים </td><td> האזור גרעיני (460 פליטה ערוץ ננומטר). ספירת מספר גרעינים. תוכן ה-DNA (בעוצמה גרעינית) או ניתוחים באזור גרעיני גם אפשרי. </td><td> שימוש במספר התא, המאפיינים גרעיני כדי לקבוע הפסד התא, פנוטיפים רעילות וכו &#39;ניתן &quot;לסנן&quot; גרעינים אלו הקשורים טובולין-βIII או ביטוי GFAP להשיג נפרד ספירת תא עצב astrocytic / אפיונים (מומלץ בחום). </td></tr><tr><td> βIII-טובולין, הביטוי Neurite תולדה </td><td> HCS נוגדן משניים, FITC-מצומדות </td><td> אזור cytoplasmic (535 ננומטר פליטת ערוץ). אות FITC ניתן להשתמש כדי להבחין גופי התא של הנוירונים neurites (למשל, באמצעות מינימום / ממוצע הגוף באזורים התא, אורך neurite מינימום / מקסימום רוחב). קביעת פרמטרים כגון אורך neurite מוחלט, שקובע neurite / סלולריים, ועוד </td><td> מדידות Neurite תוצאה עשויה להיות מווסתת במהלך התמיינות נוירונים או כתוצאה מפגיעה כימית, מדינות מחלה וכו &#39;יכול &quot;לסנן&quot; גופי התא של אלה הקשורים ביטוי βIII-טובולין לקבל אפיון עצביים שונים (מומלץ מאוד). </td></tr><tr><td> הביטוי GFAP, שטח Astrocyte </td><td> HCS נוגדן משניים, Cy3-מצומדות </td><td> אזור cytoplasmic (600 פליטה ערוץ ננומטר). אות Cy3 ניתן להשתמש כדי להגדיר פילוח cytoplasmic astrocytic. קביעת פרמטרים כגון עוצמת האות הממוצע cytoplasmic, אזור תא, וכו &#39; </td><td> הביטוי GFAP באזור תא astrocyte יכול להיות מאופנן במהלך הפיתוח astrocyte או כתוצאה מפגיעה כימית, מדינות מחלה וכו &#39;יכול &quot;לסנן&quot; גופי התא של אלה הקשורים ביטוי GFAP לקבל אפיון astrocytic ברורים (מומלץ בחום). </td></tr></tbody></table> . טבלה 1 תמונה רכישה ניתוח הנחיות - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-תרבות) Assay נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="איור 3" /> באיור 1. βIII-טובולין ו GFAP immunofluorescence מעורבת של תרבויות עכברוש עצביים התא. Co-התרבויות של האסטרוציטים עכברוש העיקרי בהיפוקמפוס עם או נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש העיקרי או PC12 תאים עכברוש נוצרו על ידי ציפוי מראש האסטרוציטים במשך כמה ימים בתרבות, ואחריו זריעת עצביים. נוירונים בתרבית ראשונית היו עבור 11 ימים נוספים, תוך PC12s היו בתרבית עבור 2 ימים נוספים בתנאי בידול (בסרום נמוך / NGF). טיפול Cell, קיבעון ו immunostaining בוצעו על פי פרוטוקולים HCS222 assay. תאים הם צילמו על GE בתא Analyzer 1000 (3.3) בשעה 20X (נוירונים העיקרי) או הגדלה 10X (PC12) המטרה ונותחו באמצעות GE תחנת עבודה נייד 1000 Analyzer (3.4) תוצאה Neurite ו Multi ניתוח אלגוריתמים יעד הפאנל למעלה.: תמונות התמזגו של הקרינה Hoechst HCS (אדום) גרעיני כתמים (כחול), βIII-טובולין (ירוק) ו GFAP. ניתוח נפרד של ערוץ βIII-טובולין את הקרינה מאפשר פילוח תולדה neurite (באמצע הפאנל: גופי התא המתוארים (נוירונים כחול העיקרי) או צהוב (PC12), neurites בירוק (נוירונים ראשונית) או תכלת (PC12)). ניתוח של ערוץ GFAP מאפשר פילוח astrocyte (פאנל התחתונה: גרעינים המתוארים כחול, הציטופלסמה בירוק). פילוח GFAP של עכברוש הראשוני בהיפוקמפוס תרבות שיתוף נוירון / astrocyte מדגים את היכולת להבחין בין גרעינים / תא הגופים כי הם GFAP (+) (ירוק מתאר) לבין אלה GFAP (-) (אדום), המאפשר ספירת תאים נפרדים נוירונים האסטרוציטים בסביבה תרבות מעורבת. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="איור 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="figure4 part2" /> איור 2. תגובות מנה של עכברוש הראשוני בהיפוקמפוס נוירון / astrocyte שיתוף תרבויות מדגיש רעילים. האסטרוציטים עכברוש ראשי בהיפוקמפוס (P6) היו מצופה על 96-היטב צלחות בתקשורת צמיחה בתרבית למשך 6 ימים. נוירונים בהיפוקמפוס עכברוש ראשיים (ישיר להפשיר) היו זורעים אז על גבי טרום מצופה האסטרוציטים ותרבותיים בתקשורת צמיחה במשך 11 ימים. תאים שטופלו דילולים הסידורי של חמצן acrylamide או מימן (ריכוז מרבי = 100mm ו - 10mm, בהתאמה) במשך 24 השעות האחרונות של התרבות. טיפול Cell, קיבעון ו immunostaining בוצעו על פי פרוטוקולים HCS222 assay. תאים הם צילמו על GE בתא Analyzer 1000 (3.3) בשעה 20X (10 שדות / טוב) ונותחו (גרעיני / cytoplasmic / neurite פילוח) באמצעות GE תחנת עבודה נייד 1000 Analyzer (3.4) תוצאה Neurite ו Multi ניתוח אלגוריתמים יעד. הנתונים המוצגים הינם ממוצע ± SEM, n = 3. פרמטרים מרובים (תוצאה neurite, עוצמת GFAP, אזור astrocyte וספירת תאים עצביים או astrocytic) נחקרו על המינון תלוי במגמות.

<ol>
	<li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro:+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth.">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li><li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening.">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li><li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells.">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li><li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening.">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li><li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems.">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li><li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allegory+of+a+mountain:+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology.">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li><li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+GFAP-thirty-one+years+(1969-2000).">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li><li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK/c-Jun+signaling+pathway.">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li><li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity.">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li><li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes,+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells:+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity?.">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?.</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li><li>Balls, M., Walum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+towards+the+acceptance+of+in+vitro+neurotoxicity+tests.">Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests.</a> Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).</li><li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias.">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li><li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+(SH-SY5Y)+in+vitro.">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li><li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species.">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li><li>Crist&#242;fol, R. M., Gass&#243;, S., V&#237;lchez, D., Rodr&#237;guez-Farr&#233;, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures:+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines.">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li></ol>

המחברים הם כל העובדים של Millipore Corporation.

עד כה, בניסויים במבחנה נועד המחקר הסיכון neurotoxicity הערכה באמצעות תרביות מעורבות של נוירונים האסטרוציטים היה מוגבל. זה היטב מקובל כי תאי גלייה הם חלק בלתי נפרד במתן תמיכה מרחבית מטבולית לנוירונים, לשחק תפקיד קריטי ויסות עצבי פונקציות שונות, כולל הגירה בידול עצבית, פעילות סינפטית. האסטרוציטים גליה גם לשחרר ציטוקינים וגורמים מסיסים אחרים המסוגלים סובלנות הן עצבי וגורם לתגובות שליליות לרקמות העצבית, כמו גם קידום של רעלים רבים. הדגמת העומק של נוירונים, גליה אינטראקציות, ב שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו כדי להגן על הנוירונים מפני רעילות של סטרס חמצוני, ואילו ליקוי astrocytic של פונקציות, כגון החזקת ההגנה נוגדת החמצון ורמות האנרגיה התאית, הוכח השפעה קריטית להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב במערכת בדיקה חוץ גופית neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר במבנה מערכת העצבים המרכזית האדם ותפקודו מאשר תאים עצביים לבד. למרות המודעות ההולכת וגדלה של המשמעות הפיזיולוגית של הנוירונים-astrocytic אינטראקציות, זה כבר קודם לכן קשה לבצע ניתוחים כמותיים של אינטראקציות אלה בתאים שלמים. הופעתו של הקרנת תכנים גבוהה מאפשרת את הפיתוח של מבחני חדש רב עוצמה לכתובת זו. במחקר זה, אנו הראו כי ניתוחים כמותיים של פנוטיפים עצב astrocytic מרובים בתוך assay יחיד מתאפשרים הודות HCA. בנוירונים העיקרי לנו לבצע מדידות כמותיות של סמנים neurotoxicity כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite. ב האסטרוציטים, דבקת תגובתי היא סמן ביולוגי ידוע neurotoxicity, מאופיין על ידי שינויים בביטוי GFAP, מספר astrocyte ומורפולוגיה astrocyte. אנחנו הוכיחו כי כל נקודות הקצה אלה עשויים בקלות להעריך באמצעות HCA. מחקרים אלה תומכים מושג HCA של עצבי ספציפי סמנים ביולוגיים יכול לשמש כחלק סוללה של בדיקות in vitro במהירות המסך מספר רב של כימיקלים עבור נקודות קצה neurotoxic. HCS222 ניתוח גבוהה של Millipore תוכן הערכה לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים מורכבת באיכות גבוהה ריאגנטים איתור פרוטוקולים בו זמנית פרופיל βIII-טובולין ו - גליה חלבון fibrillary חומצי (GFAP) במגוון רחב של דגמים סלולריים של neurotoxicity. הפערים תוקף ריאגנטים מסופק עם ערכה זו מאפשרת למשתמש לבצע סטנדרטיזציה של מבחני, למזער assay-to-assay השתנות, וכן reproducibly להפיק תמונות עם יחס אות רקע גבוה.

<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rabbit Anti-&#x03B2;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201672</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L 
Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201649</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201671</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200437</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200438</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200434</td>
<td>1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200435</td>
<td>1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Wash Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. 2007643</td>
<td>1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201679</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201730</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>K-252a (Control Compound), 250X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201741</td>
<td>1 vial containing 100 &micro;L of 250 &micro;M K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO for Compound Serial Dilution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200441</td>
<td>1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Compound Dilution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200442</td>
<td>1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate Sealers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200443</td>
<td>10 each Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCS imaging/analysis system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

גבוהה ניתוח תוכן (HCA) מבחני לשלב תאים ריאגנטים זיהוי עם הדמיה אוטומטיות עוצמה לניתוח אלגוריתמים תמונה, המאפשר מדידה של פנוטיפים הסלולר מרובים בתוך assay אחד. במחקר הנוכחי, השתמשנו HCA לפתח assay הרומן neurotoxicity. Neurotoxicity הערכה מהווה חלק חשוב של הערכה בטיחות התרופה, כמו גם להיות מוקד משמעותי של מאמצי הגנת הסביבה. בנוסף, neurotoxicity גם היטב קיבל<em&gt; במבחנה</em&gt; סמן להתפתחות מחלות ניווניות כגון אלצהיימר ופרקינסון. לאחרונה, היישום של HCA להקרנה עצבית דווחה. על ידי סימון תאים עצביים עם טובולין-βIII, מבחני HCA יכול לספק תפוקה גבוהה, לא סובייקטיבית, מדידות כמותית של פרמטרים כגון מספר העצבית, לספור neurite ואורך neurite, כל אשר יכול להצביע על ההשפעות הנוירו. עם זאת, התפקיד של האסטרוציטים נשאר נחקרו במודלים אלה. האסטרוציטים יש תפקיד אינטגרלי בשמירה על איזון מערכת העצבים המרכזית (CNS), והן קשורות עם neuroprotection והן neurodegradation כאשר הם מופעלים בתגובה חומרים רעילים או מצבי מחלה. GFAP הוא חלבון נימה ביניים הביעו בעיקר האסטרוציטים של מערכת העצבים המרכזית. הפעלת Astrocytic (דבקת) מוביל upregulation של GFAP, מלווה בדרך כלל על ידי הפצת היפרטרופיה astrocyte ו. תהליך זה של דבקת תגובתי הוצע כסמן מוקדם של נזק למערכת העצבים. השיטה המסורתית quantitation GFAP היא immunoassay. גישה זו היא מוגבלת על ידי חוסר יכולת לספק מידע על לוקליזציה מורפולוגיה הסלולר, ומספר התא. אנו נקבע כי HCA יכול לשמש כדי להתגבר על המגבלות האלה ואת למדוד בו זמנית מספר רב של תכונות הקשורות דבקת - שינויים בביטוי GFAP, היפרטרופיה astrocyte, ושגשוגם astrocyte - בתוך assay אחד. בשנת שיתוף תרבות מחקרים, האסטרוציטים הוכחו להגן על הנוירונים מפני מספר סוגים של עלבון רעילים כדי להשפיע באופן קריטי להישרדות עצביים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השימוש האסטרוציטים ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחן מערכת neurotoxicity עשוי להוכיח רלוונטיות יותר מבנה מערכת העצבים המרכזית לתפקד האדם מאשר תאים עצביים לבד. בהתאם לכך, פיתחנו assay HCA לתרבות משותפת של נוירונים האסטרוציטים, המורכב פרוטוקולים תוקף, יעד ספציפי ריאגנטים עבור זיהוי פרופיל βIII-טובולין וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). Assay זה מאפשר ניתוח סימולטני של neurotoxicity, תולדה neurite, דבקת, מורפולוגיה עצב astrocytic ופיתוח עצב astrocytic במגוון רחב של דגמים סלולריים, המייצג את רומן, לא סובייקטיבית, תפוקה גבוהה assay להערכה neurotoxicity. Assay מחזיקה פוטנציאל גדול לאיתור משופרת של neurotoxicity פרודוקטיביות משופרת במדעי המוח מחקר גילוי תרופות.

Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

a-neuronal-astrocyte-co-culture-assay-for-high-content-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Video: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

מדידה אבסולוטית קוונטית תשואה של דוגמאות אבקת

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it is challenging to assess the contributions of individual constituents to its overall toxicity. Toxicological profiles of individual constituents as well as mixtures can be however established in vitro, by applying high through-put screening tools, which enable the profiling of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHCs) of tobacco smoke, as defined by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).2
For an initial assessment, an impedance-based instrument was used for a real-time, label-free assessment of the compound&#39;s toxicity. The instrument readout relies on cell adhesion, viability and morphology that all together provide an overview of the cell status. A dimensionless parameter, named cell index, is used for quantification. A set of different staining protocols was developed for a fluorescence imaging-based investigation and a HCS platform was used to gain more in-depth information on the kind of cytotoxicity elicited by each HPHC.
Of the 15 constituents tested, only five were selected for HCS-based analysis as they registered a computable LD50 (&#60; 20 mM). These included 1-aminonaphtalene, Arsenic (V), Chromium (VI), Crotonaldehyde and Phenol. Based on their effect in the HCS, 1-aminonaphtalene and Phenol could be identified to induce mitochondrial dysfunction, and, together with Chromium (VI) as genotoxic based on the increased histone H2AX phosphorylation. Crotonaldehyde was identified as an oxidative stress inducer and Arsenic as a stress kinase pathway activator.
This study demonstrates that a combination of impedance-based and HCS technologies provides a robust tool for in vitro assessment of CS constituents.

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...