עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לבריאות הנפש (NIH / NIMH) מענק # 1R21MH085267.

חלק 1: הכנת תבנית אב תא רב נוירון שיתוף התרבות ייצור המכשיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד ראשון לפברק האב PMMA הוא להפוך תאים 3.5 מ&quot;מ עמוק. אחת תא סומה ושישה האקסון / גליה תאים מוגדרים על בלוק PMMA באמצעות כרסום מיקרו מכונה (MDX-40, רולנד או כל מכונת כרסום CNC אחרים). PMMA המאסטר sonicated אז במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות של אלכוהול איזופרופילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכים של מבנים 2.5 מיקרומטר רכס גבוה הם בדוגמת על 50.8 מ&quot;מ x 50.8 מ&quot;מ זכוכית שקופית בתהליך photolithography סטנדרטי, ואחריו תחריט רטוב של הזכוכית. ראשית, מערך של מבנים רכס הם בדוגמת על מצע זכוכית לנקות עם חיובי photoresist S1818 באמצעות photolithography. S1818 היא ספין מצופים על פני המצע (4,000 סל&quot;ד), רך מבוסס על 110 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן נחשף לאור UV (84 mJ / cm 2) בעזרת aligner המסכה ואחריו פיתוח של photoresist ב MF319 עבור 40 שניות. בשלב הבא, המצע בדוגמת photoresist זכוכית שקוע תחמוצת שנאגרו לחרוט (BOE) בטמפרטורת החדר למשך 6-7 דקות כדי לקבל 2.5 מיקרומטר מבנים רכס גבוה. לבסוף, שכבת photoresist יוסר על ידי אצטון ואלכוהול איזופרופיל, ואחריו שטיפה יסודית במים (DI) דה מיונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצע זכוכית עם מיקרו רכס מבנים הוא חם בולטות נגד המאסטר PMMA להעביר את דפוסי שלה. ראשית, אדון PMMA עובש מצעים זכוכית מיושרים ידני והניח על העיתונות חם. ואז, הטמפרטורה עולה על 115 ° C. לאחר הטמפרטורה הרצויה היא הגיעה, 0.5 טון משקל מוחל במשך 5 דקות. אחרי 5 דקות, הטמפרטורה הוא מקורר עד 40 ° C והלחץ הוא שוחרר. האדון PMMA הוא חתך ואז לתוך 50.8 מ&quot;מ x 50.8 מ&quot;מ גודל הבלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מראש פולימר (Sylgard 184) מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס של 10: 1 לפי משקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PMMA מאסטר ממוקם בתוך חבית תערובת PDMS הוא שפך על גבי האב PMMA לפברק מאסטר PDMS. זה ממוקם אז ייבוש המחובר משאבת ואקום. PDMS שפכו על גבי PMMA המאסטר degassed אז במשך 15 דקות כדי להסיר בועות שנוצר במהלך תהליך PDMS ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הבועות מוסרים, PDMS מכניסים לתנור מפולס 85 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת של פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע PDMS הוא נרפא לחלוטין, PDMS הראשי הוא קילף מן האב PMMA והניח בתוך תא ייבוש עם 2-3 טיפות trichlorosilane ושאבתי במשך 15 דקות עד אדי המעיל פני האדון PDMS. ציפוי Trichlorosilane מאפשר את שחרורו של האחרון PDMS נוירון שיתוף התרבות התקנים מן האדון PDMS. לאחר ציפוי, המאסטר PDMS היא שטפה בקצרה עם אלכוהול איזופרופילי להסיר trichlorosilane מוגזם, מיובש עם הגז N 2. </li></ol> חלק 2: התקן Neuron שכפול תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מראש פולימר (Sylgard 184) מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס של 10: 1 לפי משקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת PDMS הוא שפך על גבי האב PDMS ו degassed בתוך תא ייבוש המחובר משאבת ואקום במשך 15 דקות. חשוב לא לשפוך PDMS יותר מדי, כך מבנה גבוה 3.5 מ&quot;מ PDMS הבסיס אינו שקוע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הבועות מוסרים, PDMS מכניסים לתנור מפולס 85 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת של פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מוציאים מהתנור אחרי שעה והשאיר בטמפרטורת החדר כדי להתקרר. ואז, PDMS מכשירים נוירון תרבות הם קלופים בעדינות מן האדון PDMS. קילף מכשירים PDMS הם עטופים עם parafilm כדי להגן עליהם מפני dusts או פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS התקנים, עטוף parafilm, הם לחתוך לחתיכות בודדים באמצעות מקדחה מצויד בסכין. </li></ol> חלק 3: התקן הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מכשיר נוירון תרבות ממוקם בתוך שואב פלזמה חשוף לאוויר פלזמה למשך 90 שניות כדי להפוך את פני השטח של המכשיר PDMS הידרופילי. טיפול זה יקל פלזמה microchannels להתמלא התקשורת בתרבות לאחר ההרכבה למצע poly-d-ליזין מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנים שטופלו פלזמה שקועים אז במשך 30 דקות עבור עיקור באתנול 70% ועבר בתוך מכסה המנוע ביו מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירים מעוקרות לקוחים מתוך אתנול 70% מיובשים עם גז Millipore מסונן 2 N. מכשירים יבשים ממוקמים על גבי קלקר poly-d-ליזין מצופה 6-גם צלחת תרבות לחץ עדין מוחל על מנת להבטיח את החותם בין המצע לבין המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת מלאה אז לתא סומה, ואחריו ממלאים את ששת האקסון / גליה תאים. עדיף לתת 1-2 דקות הפסקה לפני מילוי האקסון / גליה תאים לאחר הוספת התקשורת בתרבות לתא סומה, כדי לוודא ששום בועות לכודים בתוך microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנים מלא עם התקשורת התרבות היא מודגרות בתוך 37 ° C חממה לילה לשטוף כל פסולת אפשרית או שאריות רעילים. </li></ol> חלק 4: Cell העמסה נוירון-oligodendrocyte שיתוף תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון של התרבות תאים, התאים העיקריים forebrain נוירון מיום עובריים 16-18 חולדות נטענים לתוך תא סומה בצפיפות אזוריות של 500 תאים / מ&quot;מ 2. ראשית, התקשורת והתרבות בתוך תא הן סומה האקסון ו / גליה תאים הם aspirated בעזרת פיפטה לפני טעינת התא. לאחר מכן, התאים 38500, בדילול מלא μl 40 של מדיה תרבות, נטענים לתא סומה סביב פתחי הכניסה microchannel. חשוב לא לגעת במכשיר PDMS בעת טעינת התאים, שכן הוא יכול לשבור את החותם בין המכשיר לבין המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מכשירים סלולריים נטען במשך 30 דקות בתוך 37 ° C חממה כדי לשפר את הידבקות התא למצע. לאחר דגירה, תאים כל התמלא התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הם תאים בתרבית בשעה 37 ° C ב humidified 5% CO 2 באינקובטור ורק מחצית התקשורת בתרבות משתנה החוצה כל 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 14 ימים של תרבות נוירון במבחנה, oligodendrocytes מתווספים האקסון / גליה תאים לתרבות משותפת. Oligodendrocytes, גזור מן אונות המוח של חולדות Sprague-Dawley ביום הלידה 1-2, מתווספים תא האקסון / גליה כל בצפיפות על שטח של 1000 תאים / מ&quot;מ 2. לפני טעינת תאים, כ 60% של התקשורת בתרבות בתוך תאים הם aspirated עם פיפטה. זהירות חייב להיעשות לא לגעת המצע התחתונה, שכן הוא יכול לגרום נזק רשת axonal נוצרו על פני המצע. לאחר מכן, 6700 תאים oligodendrocyte, בדילול מלא μl 5 של התקשורת בתרבות, מתווספים אל האקסון / גליה תאים. תאים מודגרת במשך שעה 1 ו - תאים מלאים עם התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הם תאים בתרבית בשעה 37 ° C ב humidified 5% CO 2 באינקובטור ורק מחצית התקשורת בתרבות משתנה החוצה כל 3-4 ימים במשך שבועיים נוספים. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: כאשר הניסויים מתבצעים כראוי, תאים הנוירון טעון לתא סומה לאתר קרוב פתחי הכניסה microchannel שכבת axonal להתחיל לגבש בתוך האקסון / גליה תאים לאחר שבוע 1 של התרבות. סימן צבירה תא עצב בתוך תא סומה יכול להיות אינדיקציה לכך התאים אינם בריאים. בעת טעינת oligodendrocytes לאחר שבועיים של תרבות נוירון, האקסון / גליה תאים צריך להיות מכוסה בשכבה צפופה של אקסונים oligodendrocytes צריך להיות טעון על גבי שכבת axonal. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="דמות 1" /> באיור 1. איורים סכמטי של תפוקה גבוהה פלטפורמת CNS תא רב microfluidic שיתוף תרבות נוירון. חתך להציג מראה ובידוד של אקסונים מ סומה ו דנדריטים עצביים כמו גם בידוד fluidic בין תאים עם הפרש דקה רמת fluidic. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="דמות 2" /> 2. איור ייצור צעדים הרכבה עבור תא רב PDMS microfluidic שיתוף תרבות המכשיר. כל התקן מתאים לאחד היטב צלחת קונבנציונאלי 6-גם תא פוליסטירן תרבות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol>
	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פיתחנו תא רב שיתוף תרבות פלטפורמה לחקר יונקים CNS-האקסון גליה אינטראקציה. אקסונים CNS בודדו בהצלחה מתא גופים העצבית / דנדריטים, ו oligodendrocytes היו בהצלחה שיתוף בתרבית בתוך המכשיר. צפיפות Neuron יכולים להיות מגוונים על ידי יישומים, אבל בריכוז נמוך מדי או גבוה מדי עלול לגרום לתאי...

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

אנו מציגים רומן תא רב שיתוף תרבות נוירון microsystem פלטפורמה למחקר האקסון גליה ב-CNS במבחנה אינטראקציה, המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל עבור תפוקה גבוהה יותר. פיתחנו שיטת ייצור חדשים כדי ליצור התקנים microfluidic שיש מבנים בקנה מידה הן מיקרו ומקרו בתוך המכשיר אותו באמצעות תהליך רך ליתוגרפיה יחיד, מה שמאפשר ייצור המוני עם הדירות טוב. תא רב פלטפורמת microfluidic שיתוף תרבות מורכבת במדור אחד עבור סומה נוירונים ושישה האקסון / גליה מדורים oligodendrocytes (OLS). תא סומה האקסון ו / גליה תאים המחוברים באמצעות מערכים של האקסון, המנחה microchannels המתפקדים מחסומים פיזיים להגביל סומה עצבי בתא סומה, תוך מתן אפשרות האקסונים לגדול לתוך האקסון / תאים גליה. OLS נטען לתוך האקסון / גליה תאים יכולים לתקשר רק עם אקסונים אך לא עם סומה או דנדריטים עצביים, מה שמאפשר מקומי האקסון, גליה מחקרים אינטראקציה. Microchannels גם איפשר הבידוד fluidic בין תאים, המאפשר six ניסויים עצמאיים להתנהל על התקן יחיד עבור תפוקה גבוהה יותר. רכים ליתוגרפיה באמצעות פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) היא טכניקה הנמצאת בשימוש נפוץ microdevices ביו. מאגרים על מכשירים אלה מוגדרים בדרך כלל על ידי ניקוב ידני. למרות יישור פשוטים, עניים הטבע זמן רב של התהליך עושה את התהליך הזה אינו מתאים כאשר מספר גדול של מאגרי יש ליצור שוב ושוב. השיטה החדשה שפותחה לא דורשים ניקוב ידני של מאגרים, להתגבר על מגבלות כאלה. ראשית, שבעה מאגרי מים (עומק: 3.5 מ&quot;מ) נעשו על בלוק פולי (PMMA) (methacrylate מתיל) באמצעות מכונת כרסום מיקרו. ואז, מערכים של microstructures רכס, מפוברק על מצע זכוכית, היו חמים בולטות נגד בבלוק PMMA להגדיר microchannels המחברים את סומה ואת האקסון / גליה תאים. תהליך זה הביא המאקרו היקף המאגרים (3.5 מ&quot;מ) ומיקרו בקנה מידה ערוצים (2.5 מיקרומטר) כדי לחפוף בתוך מאסטר PMMA יחיד. העתק PDMS ששימש מאסטר עובש הושג באמצעות רך ליתוגרפיה והמכשיר הסופי PDMS היה משוכפל מן האדון הזה. נוירונים ראשי מ E16-18 חולדות הועמסו לתא סומה ותרבותי במשך שבועיים. לאחר שבוע של תרבית תאים, אקסונים חצה microchannels והקימו רשת axonal שכבת רק בתוך האקסון / גליה תאים. אקסונים גדל באופן אחיד במשך שש האקסון / גליה תאים ו OLS מ P1-2 חולדות נוספו האקסון / גליה תאים ב 14 ימים במבחנה לתרבות משותפת.

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform at JoVE.com

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Views.  Texas A&M University (TAMU). פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

Video: A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

בדיקה Microfluidic: מבצע ושימוש לעיבוד Surface לוקליזציה

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

השתנה ES / OP9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.