著者は、博士に感謝します。これらのプロジェクトとプロトコルの開発中に支援のためのリックライアン、Umesh Patelさん、ジェフティル、マシュースー、JehangirミストリーとミケーレHatler。

細胞の準備： <ol><li>増殖培地のアッセイは、培養ニューロン/アストロサイトのための細胞播種の前になるまで〜70-80％のコンフルエント（細胞が融解または分離から直接シードでない限り）。 </li><li>目的の細胞の種類に適したメソッドを介して培養フラスコ/プレートから細胞を剥離する。必要に応じて、ポリ- D -リジン又は細胞外マトリックス蛋白質とコートのアッセイプレートのウェルに細胞接着を強化する。アストロサイトとニューロンの共培養は、同時または逐次にシードされる可能性があります。シーケンシャルseedingsの場合は、&quot;基底&quot;レイヤーとして最初のアストロサイトのメッキは、必要に応じて神経細胞のプレーティングと分化が続く、推奨されます。文化の時代、セルのソースおよび播種密度に応じて他のセルのタイプ、その後の培養時間、目的のパラメータ、に応じて細胞密度を調整し、初代培養は、増殖の速度、GFAPの発現や神経突起の伸長に大きく異なる場合があります - それは重要です特徴づけ、最適化して細胞のシステムをほとんどの生物学あなたの実験モデルの妥当性だけでなく、HCSを使用して効果的な画像処理、セグメンテーションと分析を提供するを提供する（図1参照）。プレート（細胞は以下のステップ3で説明したように毒素の治療を容易にするために、90μLメディアでシードされる可能性があります）にセルを追加した後、プレートをさらにcell配布を可能にする、15〜30分間室温温度でレベルの表面に座ってできます。増殖培地で、培養するには（37℃/ 5％CO 2）、分化の培養条件（例えば、PC12細胞の低血清/ NGF）に切り替えてから、少なくとも24時間はこの期間、必要に応じて、次の。細胞は細胞のタイプに適切な間隔でメディアを変更して、合流または分化の目的のレベルに達するまで培養を継続。 </li><li>細胞治療は、（制御化合物、試験化合物、等）興味の治療の時間経過に応じて、この培養期間中の任意の時点で導入することができる。アクリルアミド、過酸化水素とK - 252Aは、神経毒性の制御化合物として提供されています。十分な試薬は、5つすべてを96ウェルプレート用の重複した12ポイントの用量反応曲線（用量反応内の一つのdH 2 OまたはDMSO -コントロールのセットを含む）のために用意されています。化合物は、250倍濃度（K - 252A用、1μMの最大の治療を想定）や10X（アクリルアミドおよび過酸化水素のため、それぞれ100 mMおよび10 mMの、最大の治療を想定）で提供されています。推奨される治療の準備には、ハーフログが含まれます：の化合物希釈緩衝液で希釈し、次いで（1√10）DMSO中の250X化合物の希釈系列を、10X（のdH 2 Oに起因10X制御化合物は、連続的滅菌のdH 2 Oで直接希釈してもよいまたは化合物の希釈バッファー）。各治療の10μLを、最終的な1X濃度（0.4％DMSOまたは10％のdH 2 O）のために、各ウェル内にすでに存在する培養培地90μLを加えてもよい。サンプルデータは、° C固定前に37℃で化合物の治療の24または96時間のために提供されています。 </li></ol>細胞の固定と免疫蛍光染色： 注：染色時間は約2.5時間後に固定です。井戸は、染色のステップ間を乾燥させないようにしてください。試薬の吸引と摂理は、流体の剪断に起因する任意のセルの損失を減少させるために低流量で実施されるべきである。すべての&quot;ウェルあたりの推奨量は96ウェルマイクロプレートの1ウェルを参照してください。推奨されるすべての&quot;当たり96 ​​ウェルプレート&quot;のボリュームは、液体の取扱量の損失の25％の超過などがあります。すべての染色ステップは室温（RT）で実行されます。すべてのバッファと抗体溶液を室温で少なくとも24時間安定です。 <ol start="4"><li>培養期間の終了時に、室温（RT）または37℃に予熱するHCSの固定液（2X）（12 mL/96-wellプレート）必要に応じて。化学煙フードでは、直接培地に100μl/ウェルを追加し、室温で30分間固定することができます。 （MSDSを参照）固定/毒素含有培地を取り除き、有害廃棄物規制に準拠して処分する。染色にすぐに進む場合、HCS免疫緩衝液200μlで二回の各ウェルを洗う。また、プレートはあとで染色される場合は、洗浄緩衝液200μlで二回リンス、2番目のしっかりと染色されるまで4℃で密封井戸や店舗のプレートでボリュームをすすぎ残す。 </li><li>固定試料は染色する前に、4℃で保存されている場合は、染色プロトコールに進む前に200μLHCS免疫緩衝液で2回すすいでください。 </li><li>次のように、ウサギ抗βIIIチューブリン/マウス抗GFAP HCS一次抗体（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：HCS免疫バッファの5.88 mLにそれぞれ解凍した一次抗体60μLを追加する。よく混ぜる。以前の免疫蛍光バッファリンス取り外します。各ウェルに一次抗体溶液50μLを追加し、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>一次抗体を除去ソリューション。 200μLHCS免疫の緩衝液で3回リンス。 </li><li>次のようHCS二次抗体/ヘキストHCS核染色（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：それぞれの融解二次抗体30μLと融解ヘキストHCS核の30μLHCS免疫バッファの5.91 mLにステインを追加する。光からソリューションを保護する、よく混ぜる。すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。 HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色液の50μLを追加し、光から保護RT、で1時間インキュベートする。 </li><li> HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色溶液を除去。 200μLHCS免疫緩衝液で2回リンスします。 </li><li>すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。井戸第二リンスボリュームを残し、HCSの洗浄バッファーを200μLで二回リンスします。 </li><li> 4℃ですぐにシールプレートおよび画像、またはストアのプレートは、イメージングのための準備が整うまで、光から保護。 </li></ol>画像の収集と解析： <ol start="12"><li>ステンドグラスプレートのイメージングと解析は、Cell AnalyzerのIN（GEヘルスケア）、ArrayScan（ThermoFisherサイエンティフィック）やオペラ（パーキンエルマー社）を含む、利用可能なHCSプラットフォーム、様々な時に実行されることがあります。イメージングと解析のためのいくつかのガイドラインを表1に提供されています。 </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222画像集録ガイドライン </td></tr><tr><td> 検出試薬 </td><td> 対物レンズ </td><td> 励起フィルタ範囲[ピーク/帯域幅（nm）の] </td><td> エミッションフィルターレンジ[ピーク/帯域幅（nm）の] </td></tr><tr><td>ヘキストHCS核は​​染色</td><td> 20X </td><td> 40分の360 </td><td> 40分の460（または必要に応じて50分の535） </td></tr><tr><td> HCS二次抗体、FITC -ロバ抗ウサギIgG </td><td> 20X </td><td> 40分の480 </td><td> 50分の535 </td></tr><tr><td> HCS二次抗体、Cy3でロバ抗マウスIgG </td><td> 20X </td><td> 50分の535 </td><td> 50分の600 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222画像解析のガイドライン </td></tr><tr><td> セルのパラメータ </td><td> 検出 </td><td> セグメンテーション/測定 </td><td> 論理的根拠 </td></tr><tr><td>細胞数、核特性</td><td>ヘキストHCS核は​​染色</td><td>核領域（460nmの発光チャネル）。核の数をカウントします。 DNAの含有量（核強度）や核領域の解析も可能です。 </td><td>セル損失、毒性の表現型、などが別々の神経細胞およびアストロサイトの細胞数/特性評価を得るためにβIII-チューブリンまたはGFAPの発現に関連するものを&quot;フィルタ&quot;核缶（強く推奨）を決定する細胞数、核特性を使用してください。 </td></tr><tr><td> βIII-チューブリンの発現、神経突起伸長</td><td> HCS二次抗体、FITC結合</td><td>細胞質領域（535 nmの発光チャネル）。 FITCのシグナルは、神経突起（ 例えば 、最小値/平均細胞体領域を介して、最大値/最小神経突起の長さと幅）から神経細胞体を区別するために使用されることがあります。このような全体の神経突起の長さは、神経突起カウント/セル、などなどのパラメータを決定する</td><td>神経突起伸長の測定は、神経細胞分化の過程や化学傷害、疾患の状態、等の結果として変調された可能性があります異なる神経細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにβIII-チューブリンの発現に関連するものを&quot;フィルタ&quot;細胞体できます。 </td></tr><tr><td> GFAPの発現、アストロサイトエリア </td><td> HCS二次抗体、Cy3結合 </td><td>細胞質領域（600 nm発光のチャネル）。 Cy3シグナルがアストロサイトの細胞質セグメンテーションを定義するために使用されることがあります。このような平均的な細胞質シグナル強度、セル面積、などのパラメータを決定する</td><td> GFAPの発現と星状細胞の面積は、アストロサイトの開発中または化学的傷害、疾患の状態の結果として変調された可能性がある、などが明確な星状膠細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにGFAP発現と関連するもののために細胞体を&quot;フィルタリング&quot;することができます。 </td></tr></tbody></table> 表1画像取得と分析ガイドライン- HCS222βIII-Tubulin/GFAP（共培養）アッセイ代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="図3" /> 図1。 βIII-チューブリン及びGFAP immunofluore混合ラットの神経細胞培養のscence。 PC12細胞は神経細胞の播種に続いて、培養中の数日間前めっきのアストロサイトによって生成された初代ラット海馬神経細胞またはラットのいずれかと初代ラット海馬アストロサイトの共培養。 PC12sが分化条件（低血清/ NGF）の下にさらに2日間培養しながら一次ニューロンは、追加の11日間培養した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。細胞は20倍（一次ニューロン）や10X（PC12）客観的な倍率でセルアナライザー1000（3.3）でGE上に結像し、セルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを用いて分析したトップパネルが。：ヘキストHCSステイン核（青）、βIII-チューブリン（緑）およびGFAP（赤）蛍光の融合画像。別βIII-チューブリンの蛍光チャネルの解析神経突起伸長のセグメンテーションを可能にする（ 中央のパネル：青（一次ニューロンに記載されている細胞体）や黄色（PC12）、緑（一次ニューロンの神経突起）や水色（PC12））。 GFAPのチャネルの分析は、アストロサイトセグメンテーション（：青、緑の細胞質に記載されている核下のパネル ）が可能になります。に別々のセルのカウントを可能にする、（赤） - （）ラット初代海馬ニューロン/アストロサイトの共培養のためのGFAPのセグメンテーションは、GFAP（+）（緑アウトライン）とGFAPされるものである核/細胞体を区別する能力を示しています混合培養設定のニューロンとアストロサイト。 <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="図4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="図4パート2" /> 図2。毒性ストレスに対するラット初代海馬ニューロン/アストロサイト共培養の用量が応答。 初代ラット海馬アストロサイトは、（P6）増殖培地で96ウェルプレートに播種し、6日間培養した。初代ラット海馬ニューロンを（解凍から直接）、事前メッキアストロサイトの上に播種し、11日間増殖培地で培養した。細胞は、培養の最後の24時間のアクリルアミドまたは過酸化水素（最大濃度= 100mMのと10mm、それぞれ）の連続希釈液で処理した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。セルはセルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを使用して（細胞質/核/神経突起セグメンテーション）20X（よく10フィールド/）でセルアナライザー1000（3.3）にGE上に結像し、分析した。提示されたデータは平均± SEM、n = 3のを。複数のパラメータを（神経突起伸長、GFAPの強度、アストロサイトの領域と神経やアストロサイトの細胞数）用量依存性の傾向を調べた。

<ol>
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K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. 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W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. 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著者らは、ミリポア社の全従業員です。

日付に、ニューロンおよびアストロサイトの混合培養を用いた神経毒性のリスク評価を研究するために設計されたin vitroの実験では限定されている。それは、グリア細胞が神経細胞に空間的および代謝のサポートを提供するのに不可欠であり、神経細胞遊走、分化、シナプス活動を含む変調いくつかの神経機能に重要な役割を果たすことはよく受け入れられている。グリアアストロサイトはまた、サイトカインと神経組織の周囲に有害反応を誘発するだけでなく、多くの毒素の神経細胞寛容を促進するの両方が可能である他の可溶性因子を放出する。神経 - グリア相互作用の深さを実証する、共培養の研究において、アストロサイトはそのような抗酸化防御と細胞のエネルギーレベルの維持など、アストロサイトの機能、、の減損がすることが示されているのに対し、酸化的ストレスの毒性に対して神経細胞を保護することが示されている批判的にニューロンの生存に影響を与える。最近の研究では、in vitroでの神経毒性試験システムでのアストロサイトの使用は、単独で神経細胞よりも人間の中枢神経系の構造と機能に、より関連性の高い証明するかもしれないことを示唆している。神経 - アストロサイト相互作用の生理的意義の意識の高まりにもかかわらず、それは以前に、インタクトな細胞で、これらの相互作用の定量的な分析を実行することは困難であった。ハイコンテントスクリーニングの出現は、この問題に対処する強力な新しいアッセイの開発が可能になります。 本研究では、我々は、単一のアッセイ内の複数のニューロンとアストロサイトの表現型の定量分析はHCAにより可能にされていることを明らかにした。一次ニューロンでは、ニューロン数、神経突起の数や神経突起の長さなどの神経毒性マーカーの定量的測定を実施している。アストロサイトでは、反応性神経膠症はGFAPの発現、アストロサイト数とアストロサイトの形態の変化によって特徴付けられる神経毒性の既知のバイオマーカー、です。我々は、これらのエンドポイントの各々が容易にHCAを経由して評価することができることを実証した。これらの研究は、神経特異的なバイオマーカーのHCAが急速に神経毒性のエンドポイント用化学薬品を大量にスクリーニングするin vitro試験での電池の一部として使用することができるという概念をサポートしています。 ニューロンとアストロサイトの共培養のためのミリポアのHCS222ハイコンテンツ分析キットは、高品質の検出試薬と同時に神経の細胞モデルの様々なβIII-チューブリンとグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）をプロファイリングするためのプロトコルで構成されています。このキットに付属して高度に検証された試薬は、ユーザーは、アッセイの標準化アッセイ間アッセイのばらつきを最小限に抑え、かつ再現性の高い信号対バックグラウンド比を持つ画像を生成することができます。

<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rabbit Anti-&#x03B2;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201672</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L 
Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201649</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201671</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200437</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200438</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200434</td>
<td>1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200435</td>
<td>1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Wash Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. 2007643</td>
<td>1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201679</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201730</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>K-252a (Control Compound), 250X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201741</td>
<td>1 vial containing 100 &micro;L of 250 &micro;M K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO for Compound Serial Dilution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200441</td>
<td>1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Compound Dilution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200442</td>
<td>1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate Sealers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200443</td>
<td>10 each Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCS imaging/analysis system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

ハイコンテント分析（HCA）のアッセイは、単一のアッセイ内の複数の細胞の表現型の測定を可能にする、自動化されたイメージングと強力な画像解析アルゴリズムを持つ細胞と検出試薬を組み合わせる。本研究では、我々は神経毒性のための新しいアッセイを開発するためにHCAを利用。神経毒性評価は、重要な薬剤の安全性評価の一部だけでなく、環境保全活動の重要な焦点であることを表します。さらに、神経毒性にも広く受け入れられています<em&gt; in vitroで</emこのようなアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患の開発の&gt;マーカー。最近、神経細胞のスクリーニングにHCAの応用が報告されている。 βIII-チューブリンとの神経細胞を標識することにより、HCAのアッセイは、神経毒性を示すことができるすべてがそのようなニューロンの数は、神経突起の数や神経突起の長さ、などのパラメータの高スループット、非主観的、定量的な測定を提供することができます。しかし、アストロサイトの役割は、これらのモデルでは未踏のままである。アストロサイトは、中枢神経系（CNS）恒常性の維持に不可欠な役割を持っており、それらが有毒物質または疾患状態に応答して活性化される神経保護およびneurodegradationの両方に関連付けられています。 GFAPは、CNSのアストロサイトで主に発現する中間径フィラメントタンパク質である。アストロサイトの活性化（グリオーシス）は、一般的に星状膠細胞の増殖や肥大を伴うGFAPのアップレギュレーション、につながる。反応性グリオーシスのこのプロセスは、神経系の損傷の早期マーカーとして提案されている。 GFAPの定量のための伝統的な方法は、イムノアッセイによってです。このアプローチは、細胞内局在、形態および細胞数に関する情報を提供できないことによって制限されます。我々は、HCAはこれらの制限を克服すると同時に、神経膠症に関連する複数の機能を測定するために使用されることが決定 - GFAP発現の変化、アストロサイト肥大、および星状細胞増殖 - 単一のアッセイ内を。共培養の研究では、星状膠細胞は有毒な侮辱のいくつかのタイプに対してニューロンを保護し、批判的にニューロンの生存に影響を及ぼすことが示されている。最近の研究では、中のアストロサイトの使用が示唆されている<em&gt; in vitroで</em&gt;神経毒性試験システムは、単独で神経細胞よりも人間の中枢神経系の構造と機能との関連性が高いことを証明することがあります。したがって、我々は、プロトコルおよびβIII-チューブリンとグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）をプロファイリングするための検証、ターゲット固有の検出試薬で構成されるニューロンとアストロサイトの共培養、用HCAアッセイを開発した。このアッセイは、神経毒性評価のための小説、非主観的、ハイスループットアッセイを表す、細胞モデルの多種多様な神経毒性、神経突起伸長、神経膠症、神経およびアストロサイトの形態と神経細胞とアストロサイトの開発の同時分析が可能になります。アッセイは、神経科学研究と創薬の神経毒性と生産性向上の強化を検出するための大きな可能性を秘めている。

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

この記事では、新規プロトコルと試薬の高いコンテンツの分析を用いてニューロンとアストロサイトの共培養での化合物および治療の神経毒性効果の感度測定のために設計されたセットを説明します。結果は、高含有量の分析は、神経毒性評価のためのエキサイティングな新技術を表すことを示している。

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.0K ビュー.  Millipore Inc.  日本語 

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Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

成長円錐の高分解能イメージングのためのアメフラシから神経細胞の培養

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

生物学

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

粉末試料の絶対量子収率測定

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it is challenging to assess the contributions of individual constituents to its overall toxicity. Toxicological profiles of individual constituents as well as mixtures can be however established in vitro, by applying high through-put screening tools, which enable the profiling of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHCs) of tobacco smoke, as defined by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).2
For an initial assessment, an impedance-based instrument was used for a real-time, label-free assessment of the compound&#39;s toxicity. The instrument readout relies on cell adhesion, viability and morphology that all together provide an overview of the cell status. A dimensionless parameter, named cell index, is used for quantification. A set of different staining protocols was developed for a fluorescence imaging-based investigation and a HCS platform was used to gain more in-depth information on the kind of cytotoxicity elicited by each HPHC.
Of the 15 constituents tested, only five were selected for HCS-based analysis as they registered a computable LD50 (&#60; 20 mM). These included 1-aminonaphtalene, Arsenic (V), Chromium (VI), Crotonaldehyde and Phenol. Based on their effect in the HCS, 1-aminonaphtalene and Phenol could be identified to induce mitochondrial dysfunction, and, together with Chromium (VI) as genotoxic based on the increased histone H2AX phosphorylation. Crotonaldehyde was identified as an oxidative stress inducer and Arsenic as a stress kinase pathway activator.
This study demonstrates that a combination of impedance-based and HCS technologies provides a robust tool for in vitro assessment of CS constituents.

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...