فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. ريك ريان ، أوميش باتل ، وحتى جيف هسو ماثيو ، ميستري جيهانجير وميشيل Hatler للحصول على دعم خلال تطوير هذه المشاريع والبروتوكولات.

خلية التحضير : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البذر الخلية العصبية للمقايسة والثقافة ، و/ النجمية النمو في وسائل الإعلام حتى ~ متموجة 70-80 ٪ (ما لم تكن الخلية البذر مباشرة من الذوبان أو العزلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من قوارير ثقافة / لوحات عن طريق الأسلوب المناسب لنوع من الخلايا في المصالح. إذا لزم الأمر ، وحفر الآبار لوحة معطف مقايسة مع بروتين المصفوفة بولي - D - يسين أو خارج الخلية لتعزيز التصاق الخلية. قد يكون المصنف المشترك ثقافات النجمية والخلايا العصبية في نفس الوقت أو بالتتابع. تصنيف المنتخبات لمتسلسلة ، فمن المستحسن تصفيح النجمية أولا بوصفها طبقة &quot;القاعدية&quot; ، تليها الطلاء وتمايز الخلايا العصبية ، إذا لزم الأمر. ضبط كثافة الخلايا بما يتناسب مع نوع من الخلايا ، بعد وقت والثقافة ، والمعلمات في المصالح ، وما إلى ذلك اعتمادا على العمر والثقافة ، ومصدر الخلية وكثافة الغرس والثقافات الأولية قد تختلف اختلافا كبيرا في معدل الانتشار ، GFAP التعبير أو ثمرة neurite -- من المهم أن توصيف وتحسين النظام الخاص خلية لتوفير أكثر ملاءمة البيولوجية للنموذج التجريبي الخاص ، وكذلك لتوفير التصوير فعالة ، وتجزئة والتحليل باستخدام HCS (انظر الشكل 1). بعد إضافة الخلايا لوحة (قد تكون خلايا المصنف في 90 ميكرولتر وسائل الاعلام ، لتسهيل معالجة السم كما هو موضح في الخطوة 3 أدناه) ، والسماح لوحة على الجلوس على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة ل15-30 دقيقة ، مما يتيح توزيع الخلية حتى. بعد هذه الفترة ، واحتضان خلايا النمو في وسائل الإعلام (37 ° / C 5 ٪ CO 2) ما لا يقل عن 24 ساعة ، ثم التبديل إلى ظروف ثقافة التمايز (على سبيل المثال ، المصل منخفض / NGF PC12 للخلايا) ، حسب الاقتضاء. تواصل الثقافة حتى تصل إلى مستوى الخلايا المطلوب من التقاء أو التمايز ، وتغيير وسائل الاعلام على فترات مناسبة لنوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إدخال علاجات الخلية (مركبات السيطرة ، اختبار المركبات ، الخ) في أي وقت خلال هذه الفترة والثقافة ، وبما يتناسب بالطبع وقت للعلاج من الفائدة. يتم توفير مادة الأكريلاميد ، بيروكسيد الهيدروجين وK - 252a ومركبات التحكم العصبي. يتم توفير الكواشف كافية لمكررة من 12 نقطة منحنيات الاستجابة للجرعة (بما في ذلك O 2 درهم أو مجموعة DMSO التحكم في الاستجابة للجرعة) لجميع لوحات five 96 - جيدا. يتم توفير هذه المركبات في تركيز 250X (K - 252a ل، على افتراض علاج أقصى 1 ميكرومتر) أو 10X (على مادة الأكريلاميد وبيروكسيد الهيدروجين ، على افتراض العلاجات أقصى 100 ملم و 10 ملم على التوالي). أوصى بإعداد العلاج ينطوي نصف السجل (1 : √ 10) التخفيف المتسلسل للمجمع في DMSO 250X ، تليها في تخفيف مؤقت لمجمع التخفيف 10X (يمكن السيطرة المركبات 10X منشؤها درهم 2 O المخفف متسلسل مباشرة في العقيمة O 2 درهم أو التخفيف مجمع العازلة). قد ثم 10 ميكرولتر من كل معاملة يمكن ان تضاف الى وسائل الاعلام ميكرولتر 90 من ثقافة موجودة بالفعل في كل بئر ، على التركيز إلى 1X النهائي (0.4 ٪ أو 10 ٪ DMSO درهم 2 O). يتم توفير نموذج البيانات لمدة 24 أو 96 ساعة من العلاج المركب عند 37 درجة مئوية قبل التثبيت. </li></ol> التثبيت الخلية ويلطخ مناعي : ملاحظة : الوقت هو تلطيخ ~ 2.5 ساعة بعد التثبيت. لا تسمح لتجف الآبار بين الخطوات تلطيخ. وينبغي إجراء الطموح والإعفاء من الكواشف في معدلات التدفق المنخفض لتقليل أي خسارة الخلايا نتيجة القص السوائل. وأوصت جميع &#39;لكل بئر&quot; الرجوع إلى مجلدات واحد جيد لmicroplate 96 - جيدا. وأوصت جميع &#39;في 96 - جيدا لوحة&quot; تشمل كميات الزائدة بنسبة 25 ٪ لمعالجة فقدان السوائل وحدة التخزين. يتم تنفيذ جميع الخطوات تلطيخ في درجة حرارة الغرفة (RT). جميع مخازن والحلول الضد مستقرة لمدة لا تقل عن 24 ساعة في RT. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الفترة والثقافة ، وقبل حلول الحارة التثبيت HCS (2X) إلى درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية إذا كان المطلوب (12 mL/96-well لوحة). في غطاء الدخان الكيميائية ، إضافة 100 ميكرولتر / إضافة إلى وسائل الإعلام بشكل مباشر والثقافة ، وتسمح لإصلاح لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة تثبيتي / توكسين التي تحتوي على وسائل الاعلام والتصرف فيها بما يتفق مع لوائح للنفايات الخطرة (أنظر MSDS). إذا كان الشروع فورا في تلطيخ ، وشطف كل بئر مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي المناعي HCS. بدلا من ذلك ، إذا أن تكون لوحات ملطخة في وقت لاحق ، وشطف مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل ، ثم ترك اشطفها ثانية وحدة التخزين في الآبار وألواح تخزين مغلقة بإحكام عند 4 درجات مئوية حتى تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تخزين عينات ثابتة عند 4 درجات مئوية قبل التلوين ، وشطف مرتين مع 200 مخزن HCS ميكرولتر المناعي قبل المضي قدما في بروتوكول تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العاملين حل المضادة للأرنب βIII تويولين / ماوس HCS أجسام المضادة للGFAP الابتدائية (6 mL/96-well وحة) على النحو التالي : إضافة 60 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة الأولية لإذابة 5.88 مل من الاحتياطي المناعي HCS. مزيج جيد. إزالة الاحتياطي المناعي السابقة الشطف. إضافة 50 ميكرولتر من محلول جسم الابتدائية إلى كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جسم الابتدائيةالحل. شطف ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر الاحتياطي المناعي HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل عمل جسم HCS الثانوي / هويشت HCS النووية اللطخة (لوحة mL/96-well 6) على النحو التالي : إضافة 30 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة الثانوية إذابة و 30 ميكرولتر من إذابة النووية HCS هويشت اللطخة إلى 5.91 مل من الاحتياطي المناعي HCS. مزيج جيد ، وحماية الحل بعيدا عن الضوء. إزالة السابقة الاحتياطي المناعي HCS الشطف. إضافة 50 ميكرولتر من جسم HCS الثانوي / هويشت HCS حل اللطخة النووية واحتضان لمدة 1 ساعة على RT ، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة HCS الثانوية جسم / هويشت HCS حل اللطخة النووية. شطف مرتين مع 200 ميكرولتر الاحتياطي المناعي HCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السابقة الاحتياطي المناعي HCS الشطف. شطف مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل HCS ، تاركا اشطفها ثانية الحجم في الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة وصورة مباشرة ، أو متجر لوحة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى جاهزة للتصوير. </li></ol> الحصول على الصور والتحليل : <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تنفيذ التصوير والتحليل لوحات ملطخة على مجموعة متنوعة من المنصات HCS المتاحة ، بما في محلل الخلية (GE للرعاية الصحية) ، ArrayScan (ThermoFisher العلمية) أو الأوبرا (بيركن إلمر). وتقدم بعض المبادئ التوجيهية لالتصوير والتحليل في الجدول رقم 1 : </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 المبادئ التوجيهية اقتناء صورة </td></tr><tr><td> كشف الكاشف </td><td> هدف لنس </td><td> متوسط ​​الإثارة تصفية [الذروة / عرض النطاق الترددي (نانومتر)] </td><td> تصفية متوسط ​​الانبعاثات [الذروة / عرض النطاق الترددي (نانومتر)] </td></tr><tr><td> هويشت HCS النووية اللطخة </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (535/50 أو إذا لزم الأمر) </td></tr><tr><td> HCS جسم الثانوي ، FITC - حمار المضادة للأرنب مفتش </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS جسم الثانوي ، Cy3 - حمار المضادة للماوس مفتش </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 إرشادات تحليل صورة </td></tr><tr><td> خلية معلمة </td><td> كشف </td><td> تجزئة / قياس </td><td> المنطق </td></tr><tr><td> عدد الخلايا ، الخصائص النووية </td><td> هويشت HCS النووية اللطخة </td><td> المنطقة النووية (460 قناة الانبعاثات نانومتر). عد عدد من النوى. محتوى الحمض النووي (كثافة النووية) ، أو التحليلات المجال النووي وممكن أيضا. </td><td> استخدام عدد الخلايا ، والخصائص النووية لتحديد الخسائر الخلية ، سمية الظواهر ، وما إلى ذلك يمكن &quot;تصفية&quot; نواة لتلك المرتبطة βIII - تويولين أو التعبير GFAP للحصول على عدد الخلايا العصبية منفصلة ونجمي / التوصيفات (يوصى بشدة). </td></tr><tr><td> βIII - تويولين ثمرة Neurite التعبير ، </td><td> HCS جسم الثانوي ، FITC - مترافق </td><td> هيولي المنطقة (535 نانومتر انبعاث القناة). ويمكن استخدام FITC إشارة إلى التمييز بين أجسام الخلايا العصبية من neurites (على سبيل المثال ، عن طريق الحد الأدنى / متوسط ​​المناطق خلايا الجسم ، وأطوال neurite الحد الأدنى / الأقصى وعرض). تحديد معايير مثل طول neurite إجمالي تعداد neurite / خلية ، الخ. </td><td> القياسات قد تكون ثمرة Neurite التضمين خلال تمايز الخلايا العصبية أو نتيجة الإصابة الكيميائية ، والحالات المرضية ، وما إلى ذلك يمكن &quot;تصفية&quot; الهيئات الخلية لتلك المرتبطة βIII تويولين التعبير ، للحصول على توصيف العصبية مميزة (يوصى بشدة). </td></tr><tr><td> GFAP التعبير ، منطقة نجمية </td><td> HCS جسم الثانوي ، Cy3 - مترافق </td><td> هيولي المنطقة (600 قناة الانبعاثات نانومتر). ويمكن استخدام Cy3 إشارة إلى تعريف تجزئة هيولي نجمي. تحديد بارامترات مثل متوسط ​​كثافة إشارة حشوية ، منطقة الخلية ، الخ. </td><td> GFAP التعبير ومنطقة نجمية الخلية قد تكون التضمين أثناء تطوير نجمية أو نتيجة الإصابة الكيميائية ، والحالات المرضية ، الخ &quot;تصفية&quot; الهيئات الخلية لتلك المرتبطة التعبير GFAP للحصول على توصيف نجمي مميزة (يوصى بشدة). </td></tr></tbody></table> . الجدول 1 صورة اقتناء وتحليل المبادئ التوجيهية -- HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (المشارك للثقافة) الفحص ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="الشكل 3" /> الشكل 1. βIII - تويولين وimmunofluore GFAPscence الثقافات الخلية العصبية الفئران مختلطة. وقد تم توليد المشترك ثقافات النجمية الفئران الحصين الابتدائية إما مع الخلايا العصبية الفئران أو الجرذان الأولية الحصين الخلايا PC12 ما قبل طلاء الخلايا النجمية لعدة أيام في الثقافة ، تليها بذر العصبية. وكانت الخلايا العصبية مثقف الأولية ل11 يوما إضافية ، بينما المثقف PC12s ليوم 2 إضافية في ظل ظروف التمايز (المصل منخفض / NGF). أجريت معالجة الخلايا ، وتثبيت immunostaining وفقا لبروتوكولات مقايسة HCS222. وكان تصوير الخلايا على شركة جنرال الكتريك في محلل خلية 1000 (3.3) في 20X (الخلايا العصبية الأولية) ، أو 10X التكبير الهدف (PC12) وتحليلها باستخدام GE في محطة خلية 1000 محلل (3.4) وثمرة Neurite موضوع خوارزميات تحليل لوحة الهدف الأعلى : صور تنصهر HCS هويشت مضان (الحمراء) النووية اللطخة (الأزرق) ، βIII - تويولين (الخضراء) وGFAP. تحليل منفصل للقناة مضان βIII - تويولين يسمح للتجزئة ثمرة neurite (لوحة الأوسط : أجسام الخلايا العصبية المحددة في (الزرقاء الأولية) ، أو الصفراء (PC12) ، neurites باللون الأخضر (الخلايا العصبية الأولية) ، أو الأزرق الفاتح (PC12)). تحليل للقناة GFAP يسمح للتجزئة نجمية (اللوحة السفلية : نوى المبينة باللون الأزرق ، السيتوبلازم باللون الأخضر). GFAP تجزئة للقرن آمون الفئران الخلايا العصبية الأولية / نجمية الثقافة المشتركة يدل على القدرة على التمييز بين النوى / خلية الهيئات التي GFAP (+) (الخطوط الخضراء) وتلك التي GFAP (--) (الحمراء) ، مما يمكن تعداد خلايا منفصلة الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وضع ثقافة مختلطة. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="الشكل 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="figure4 part2" /> الشكل 2. الردود الأولية الفئران جرعة من الخلايا العصبية الحصين / نجمية المشترك الثقافات لتؤكد السامة. وكانت مطلية النجمية الجرذان الأولية الحصين (P6) على لوحات - 96 بشكل جيد في وسائط النمو والمثقف لمدة 6 أيام. وكانت المصنفة ثم الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الأولية (المباشرة من ذوبان الجليد) على رأس قبل مطلي النجمية والمثقف في وسائل الإعلام النمو لمدة 11 يوما. تم علاج الخلايا مع التخفيفات المتسلسلة لبيروكسيد الهيدروجين أو الأكريلاميد (تركيزات بحد أقصى = و100mM 10MM ، على التوالي) عن ال 24 ساعة الماضية للثقافة. أجريت معالجة الخلايا ، وتثبيت immunostaining وفقا لبروتوكولات مقايسة HCS222. وكان تصوير الخلايا على شركة جنرال الكتريك في محلل خلية 1000 (3.3) في 20X (10 الحقول / جيد) وتحليلها (النووية / هيولي / neurite تجزئة) باستخدام GE في محطة خلية 1000 محلل (3.4) وثمرة Neurite موضوع خوارزميات تحليل الهدف. البيانات المقدمة ويعني ± SEM ، ن = 3. وقد تم التحقيق معلمات متعددة (ثمرة neurite ، وكثافة GFAP ، منطقة نجمية وعدد الخلايا العصبية أو نجمي) للجرعة التي تعتمد على الاتجاهات.

<ol>
	<li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro:+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth.">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li><li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening.">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li><li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells.">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li><li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening.">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li><li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems.">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li><li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allegory+of+a+mountain:+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology.">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li><li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+GFAP-thirty-one+years+(1969-2000).">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li><li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK/c-Jun+signaling+pathway.">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li><li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity.">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li><li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes,+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells:+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity?.">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?.</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li><li>Balls, M., Walum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+towards+the+acceptance+of+in+vitro+neurotoxicity+tests.">Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests.</a> Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).</li><li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias.">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li><li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+(SH-SY5Y)+in+vitro.">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li><li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species.">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li><li>Crist&#242;fol, R. M., Gass&#243;, S., V&#237;lchez, D., Rodr&#237;guez-Farr&#233;, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures:+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines.">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li></ol>

الكتاب وجميع العاملين في المؤسسة ميليبور.

حتى الآن ، في التجارب المختبرية تهدف إلى دراسة وتقييم المخاطر العصبية باستخدام ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية كانت محدودة. فمن المعروف جيدا أن الخلايا الدبقية المقبولة هي جزء لا يتجزأ في تقديم الدعم المكاني والتمثيل الغذائي للخلايا العصبية ، وتلعب دورا حاسما في وظائف عدة تحوير الخلايا العصبية ، الخلايا العصبية بما في ذلك الهجرة ، والتمايز والنشاط متشابك. الخلايا النجمية الدبقية أيضا إطلاق سراح السيتوكينات وعوامل أخرى قابلة للذوبان والتي هي قادرة على التسامح على حد سواء العصبية تحفيز استجابات معاكسة في الأنسجة المحيطة العصبية ، فضلا عن تشجيع العديد من السموم. مما يدل على عمق التفاعلات العصبية - الدبقية ، وشارك في دراسات ثقافة ، وقد تبين أن الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية ضد سمية الاكسدة ، في حين لم تظهر ضعف وظائف نجمي ، مثل الصيانة للدفاع المضادة للأكسدة ، ومستويات الطاقة الخلوية ، إلى تأثير حاسم بقاء الخلايا العصبية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن استخدام الخلايا النجمية في اختبار النظام في المختبر العصبية قد تكون أكثر أهمية للإنسان هيكل الجهاز العصبي المركزي وظيفة من الخلايا العصبية وحدها. على الرغم من الوعي المتزايد لأهمية الفسيولوجية العصبية ، نجمي التفاعلات ، فقد كان في السابق من الصعب إجراء تحليل الكمي لهذه التفاعلات في خلايا سليمة. ظهور فحص نسبة عالية تمكن من تطوير فحوصات جديدة وقوية لمعالجة هذا الأمر. في هذه الدراسة ، وقد أثبتنا أن يتم إجراء تحليلات كمية من الظواهر المتعددة ونجمي الخلايا العصبية داخل مقايسة واحدة بفضل HCA. في الخلايا العصبية الأولية قد أجرينا القياسات الكمية من علامات العصبية مثل عدد الخلايا العصبية ، وطول العد neurite neurite. في الخلايا النجمية ، دباق رد الفعل هو معروف من العلامات البيولوجية العصبية ، التي تتميز التعديلات في التعبير GFAP ، وعدد نجمية ومورفولوجيا نجمية. لقد أثبتنا التي قد بسهولة كل من هذه النهاية أن تقيم عبر HCA. هذه الدراسات مفهوم الدعم التي يمكن أن تستخدم HCA من المؤشرات الحيوية العصبية محددة كجزء من مجموعة من التجارب في المختبر لفحص السريع لأعداد كبيرة من المواد الكيميائية بالنسبة لنهايات أعصاب. وتتألف لميليبور HCS222 تحليل محتوى عال عدة للثقافة مشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية من الكواشف ذات جودة عالية وبروتوكولات للالتنميط في وقت واحد ، βIII تويولين والدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) في طائفة واسعة من النماذج من العصبية الخلوية. الكواشف عالية التحقق المقدمة مع هذه المجموعة تسمح للمستخدم لتوحيد المقايسات ، والحد من مقايسة إلى مقايسة تقلباته ، وتوليد الصور بتكاثر مع نسبة إشارة إلى خلفية عالية.

<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Rabbit Anti-&#x03B2;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201672</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L 
Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201649</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201671</td>
<td>1 vial containing 300 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200437</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200438</td>
<td>1 vial containing 150 &micro;L Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200434</td>
<td>1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200435</td>
<td>1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>HCS Wash Buffer, 1X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. 2007643</td>
<td>1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201679</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201730</td>
<td>1 vial containing 500 &micro;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>K-252a (Control Compound), 250X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS201741</td>
<td>1 vial containing 100 &micro;L of 250 &micro;M K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO for Compound Serial Dilution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200441</td>
<td>1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Compound Dilution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200442</td>
<td>1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate Sealers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Part No. CS200443</td>
<td>10 each Millipore HCS222 Kit Components</td>
</tr>
<tr>
<td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCS imaging/analysis system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

ارتفاع تحليل المحتوى (HCA) المقايسات دمج الخلايا والكواشف مع التصوير الآلي وقوية خوارزميات تحليل الصور ، مما يسمح بقياس الظواهر الخلوية متعددة ضمن مقايسة واحد. في هذه الدراسة ، استخدمت نحن HCA لوضع مقايسة رواية عن العصبية. العصبية التقييم يمثل جزءا هاما من تقييم سلامة العقاقير ، فضلا عن كونها والتركيز بشكل كبير من جهود حماية البيئة. بالإضافة إلى ذلك ، العصبية هي أيضا جيدة مقبولة<em&gt; في المختبر</em&gt; علامة لتطور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر وأمراض الشلل الرعاش. مؤخرا ، تم الإبلاغ عن تطبيق HCA لفحص الخلايا العصبية. وذلك عبر تسمية الخلايا العصبية مع βIII - تويولين ، يمكن توفير فحوصات HCA الإنتاجية العالية ، وعدم الموضوعية ، والقياسات الكمية من المعلمات مثل عدد الخلايا العصبية ، والعد neurite neurite طول ، والتي يمكن أن تشير إلى التأثيرات السمية العصبية. ومع ذلك ، لا تزال غير مستكشفة دور الخلايا النجمية في هذه النماذج. النجمية يكون لها دور أساسي في الحفاظ على النظام العصبي المركزي (CNS) التوازن ، وترتبط مع كل من العصبية وneurodegradation عندما يتم تفجيرها في الاستجابة للمواد السامة أو الحالات المرضية. GFAP هو بروتين خيوط المتوسطة وأعرب في الغالب في الخلايا النجمية للجهاز العصبي المركزي. تفعيل نجمي (دباق) يؤدي إلى upregulation من GFAP ، يرافقه عادة من قبل الانتشار نجمية وتضخم. وقد اقترح هذه العملية من دباق رد الفعل باعتباره علامة مبكرة على حدوث ضرر للجهاز العصبي. الطريقة التقليدية لGFAP الكميات حسب المناعية. ويقتصر هذا النهج وعدم القدرة على توفير المعلومات عن التوطين الخلوية ، ومورفولوجيا وعدد الخلايا. مصممون التي يمكن استخدامها للتغلب على هذه HCA القيود ولقياس ميزات متعددة في وقت واحد المرتبطة دباق -- التغيرات في التعبير GFAP ، وتضخم نجمية ، وانتشار نجمية -- ضمن مقايسة واحد. في المشاركة في دراسات ثقافة ، وقد تبين أن الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية ضد عدة أنواع من وسامة وإهانة خطيرة للتأثير على بقاء الخلايا العصبية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن استخدام الخلايا النجمية في<em&gt; في المختبر</em&gt; قد تثبت نظام اختبار العصبية أكثر ملاءمة لبنية الإنسان وظيفة الجهاز العصبي المركزي من الخلايا العصبية وحدها. تبعا لذلك ، لدينا ضعت مقايسة HCA للثقافة مشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية ، التي تتألف من البروتوكولات والتحقق من صحتها والكواشف محددة الهدف الكشف عن التنميط βIII - تويولين الدبقية وبروتين لييفي الحمضية (GFAP). هذا الاختبار يمكن تحليل العصبية في وقت واحد ، neurite ثمرة ، دباق ، مورفولوجيا الخلايا العصبية والخلايا العصبية والتنمية نجمي ونجمي في طائفة واسعة من النماذج الخلوية ، وهو ما يمثل الرواية ، غير ذاتية ، والإنتاجية العالية مقايسة لتقييم العصبية. في مقايسة يحمل امكانات كبيرة للكشف عن العصبية تعزيز وتحسين الإنتاجية في مجال البحوث والأعصاب اكتشاف المخدرات.

Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

توضح هذه المقالة بروتوكول الرواية وكاشف مجموعة مصممة لقياس التأثيرات السمية العصبية الحساسة للمركبات والعلاجات على الثقافات المشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية باستخدام عالية تحليل المحتوى. تظهر النتائج ان ارتفاع تحليل المضمون يمثل تكنولوجيا جديدة مثيرة لتقييم العصبية.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

a-neuronal-astrocyte-co-culture-assay-for-high-content-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Video: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

مطلق قياس العائد الكم من عينات مسحوق

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it is challenging to assess the contributions of individual constituents to its overall toxicity. Toxicological profiles of individual constituents as well as mixtures can be however established in vitro, by applying high through-put screening tools, which enable the profiling of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHCs) of tobacco smoke, as defined by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).2
For an initial assessment, an impedance-based instrument was used for a real-time, label-free assessment of the compound&#39;s toxicity. The instrument readout relies on cell adhesion, viability and morphology that all together provide an overview of the cell status. A dimensionless parameter, named cell index, is used for quantification. A set of different staining protocols was developed for a fluorescence imaging-based investigation and a HCS platform was used to gain more in-depth information on the kind of cytotoxicity elicited by each HPHC.
Of the 15 constituents tested, only five were selected for HCS-based analysis as they registered a computable LD50 (&#60; 20 mM). These included 1-aminonaphtalene, Arsenic (V), Chromium (VI), Crotonaldehyde and Phenol. Based on their effect in the HCS, 1-aminonaphtalene and Phenol could be identified to induce mitochondrial dysfunction, and, together with Chromium (VI) as genotoxic based on the increased histone H2AX phosphorylation. Crotonaldehyde was identified as an oxidative stress inducer and Arsenic as a stress kinase pathway activator.
This study demonstrates that a combination of impedance-based and HCS technologies provides a robust tool for in vitro assessment of CS constituents.

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

عالية تحليل فحص المحتوى لتقييم الآثار السمية للمكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...